雙標染色技術(shù)在大鼠腦創(chuàng)傷后caspase-3與神經(jīng)細胞凋亡研究中的應(yīng)用

2016-03-23 01:52宋朝彥董曉輝謝東

中國現(xiàn)代醫(yī)生 2014年19期

宋朝彥+董曉輝+謝東

[摘要] 目的探討末端標記（TUNEL）法與caspase-3免疫組織化學(xué)法雙標染色技術(shù)在研究大鼠神經(jīng)細胞凋亡機制中應(yīng)用的優(yōu)越性。方法雄性Wistar大鼠12只隨機分成兩組，用Marmarou方法造成大鼠重型彌漫性顱腦創(chuàng)傷。切片先按照試劑盒提供的方法行TUNEL染色顯示凋亡，再按caspase-3免疫組化試劑盒檢測方法繼續(xù)染色。結(jié)果雙標染色顯色滿意，大鼠海馬區(qū)大部分TUNEL陽性細胞同時也表現(xiàn)caspase-3陽性。結(jié)論 caspase-3與TUNEL雙標染色能更好的反映出大鼠腦創(chuàng)傷后caspase-3與凋亡之間的關(guān)系，體現(xiàn)了雙標染色技術(shù)的優(yōu)越性。

[關(guān)鍵詞] 大鼠；免疫組織化學(xué)；雙標染色；凋亡

[中圖分類號] R651.15[文獻標識碼] A[文章編號] 1673-9701（2014）19-0025-03

Double staining techniques in the study of caspase-3 and the apoptosis after traumatic brain injury in rats

SONG Chaoyan DONG Xiaohui XIE Dong

Department of Neurosurgery,Baoding City the First Hospital in Hebei Province，Baoding 071000，China

[Abstract] Objective To explore the advantage of double staining TUNEL in situ and immunohistochemical technique of casepase-3 expression following traumatic brain injury(TBI) in rats.Methods 12 male Wistar rats were randomly divided into 2 groups. According to Marmarou, severe closed brain injury was made. After that, TUNEL in situ was applied of the apoptosis cell in hippocampus region. Then immunohistochemical staining with Caspase-3 were performed of hippocampus region. Results Double staining was well showed that TUNEL positive cell appeared in hippocampus and Caspase-3 appeared in the same cell. Conclusion TUNEL and Caspase-3 double staining better reflect the relationship between caspase-3 and apoptosis following TBI in rats. Double staining showes the advantage in the relation of apoptosis and Caspase-3.

[Key words] Rats; Immunohistochemistry; Double staining; Apoptosis

雙標染色技術(shù)目前在免疫組織化學(xué)已經(jīng)普遍采用[1，2]，但雙標染色技術(shù)要求相對較高，切片染色成功率低，尤其對初學(xué)者由于細節(jié)方面的忽視，難以獲得滿意的染色結(jié)果。而關(guān)于雙標染色技術(shù)的專門研究文章較少，本實驗利用大鼠顱腦創(chuàng)傷（TBI）模型，大鼠TBI后通過對海馬組織進行caspase-3免疫組化與末端標記（TUNEL）法染色，探討雙標染色技術(shù)在研究神經(jīng)細胞凋亡機制中應(yīng)用中的注意事項及優(yōu)越性。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組

健康Wistar雄性大鼠（河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供）12只，體重250～300 g。大鼠隨機分成對照組、創(chuàng)傷組。其中創(chuàng)傷組8只（實際存活5只大鼠，由于模型死亡造成），對照組4只大鼠。

1.2大鼠創(chuàng)傷模型制備及取材

仿Marmarou方法[3]并根據(jù)實際情況加以改進建立模型，大鼠以腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg）麻醉，頭皮切開后采用450 g×1.5 m自由落體打擊大鼠頂骨制作大鼠腦損傷模型。對照組僅予麻醉及頭皮切開、縫合，但不致傷。于傷后3 d經(jīng)心灌注前固定，斷頭取腦，取大腦部分前囟后3.3~4.3 mm間行后固定。常規(guī)脫水、石蠟包埋，標本行連續(xù)冠狀切片，厚度約7μm，置于經(jīng)粘片劑處理過的載玻片上備用。

1.3 末端標記（TUNEL）法與caspase-3免疫組化雙標染色

TUNEL檢測試劑盒購自美國Roche公司，轉(zhuǎn)換液為堿性磷酸酶標記。所用caspase-3一抗購自美國Santa Cruz公司，SP免疫組化試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟梯度酒精至水。首先嚴格按TUNEL試劑盒所要求步驟進行操作（空白對照[4]只加不含酶等量核苷酸反應(yīng)液，余相同），用BCIP/NBT顯色液顯色（細胞核呈藍紫色為顯色陽性），避光室溫下顯色約20 min，顯微鏡下顯色滿意后，用0.01M PBS液沖洗2～3次終止顯色。用蒸餾水沖洗去除切片殘余試劑。切片再次嚴格按caspase-3免疫組化說明書步驟操作?？瞻讓φ沼?.1M PBS液代替一抗其余步驟相同。DAB顯色劑顯色約20 min，顯微鏡下顯色滿意后（細胞漿呈黃色為顯色陽性），清水充分沖洗，經(jīng)酒精及二甲苯依次處理后，中性樹膠封片。

2結(jié)果

對照組未見明顯染色。創(chuàng)傷組大部分TUNEL標記陽性細胞（細胞核呈藍色）同時也表現(xiàn)caspase-3免疫染色陽性（細胞漿呈棕黃色），除此小部分TUNEL標記陽性細胞未見caspase-3免疫染色陽性，另外也有小部分caspase-3免疫染色陽性細胞未見TUNEL標記陽性。TUNEL空白對照僅顯示caspase-3染色陽性，caspase-3空白對照僅顯示TUNEL染色陽性（圖1～3）。

圖1 創(chuàng)傷組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞TUNEL與caspase-3雙標染色400×（可見caspase-3染色與TUNEL染色）

圖2 雙標染色TUNEL空白對照400×（僅顯示caspase-3染色陽性）

3討論

近年來，由于免疫組織化學(xué)的迅速發(fā)展，單克隆抗體的不斷產(chǎn)生，因此人們對免疫組化技術(shù)的要求也越來越高，不僅僅滿足于免疫組化的單一標記，而且需要雙重或多重標記，其基本原理是根據(jù)標記物的不同，各自所標記的抗原呈現(xiàn)不同的顏色，在一張切片上或同一細胞內(nèi)顯示兩種以上的抗原，光鏡或熒光鏡下根據(jù)不同的顏色來判斷不同的抗原成分。利用這種技術(shù)可以了解到組織細胞間的形成和機能的關(guān)系，以及抗原成分相互之間的關(guān)系，為基礎(chǔ)理論的探討，發(fā)病機制的研究、疾病的診斷提供了重要的實驗手段。

endprint

由于雙標染色過程復(fù)雜，所需時間長，對切片的質(zhì)量要求極高，因此在制作石蠟切片時包埋、切片、展片、撈片、烤片過程中講究技巧以制作優(yōu)良的切片。這要求取材脫水一定要徹底，石蠟包埋時一定要達到浸蠟的均一，防止脫水不徹底而造成的組織包埋不合格。切片時勻速，使切片首尾相連，以利于切片的下一步的轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移到恒溫水浴箱中不要出現(xiàn)切片重疊。水溫應(yīng)合適，水溫過高易造成切片過度分散，水溫過低展片時間過長且不易平整。水浴箱中避免氣泡的產(chǎn)生，防止切片漂到氣泡上，撈片過程中注意不要在切片和載玻片中間留有氣泡，造成切片不平整且易從載玻片上脫落影響后續(xù)操作及染色?？酒捎?60℃恒溫箱烤片 1 h以上。時間過短也會造成脫片。由于染色過程中需數(shù)次振蕩洗滌切片，防脫片非常重要，載玻片應(yīng)用粘片劑等防脫片技術(shù)預(yù)防切片脫片。這些技術(shù)細節(jié)一定要重視，否則可能導(dǎo)致事倍功半。在我們的試驗中，由于在caspase-3免疫組化染色過程中需抗原熱修復(fù)[5]，而TUNEL原位凋亡染色步驟相對較少，對切片影響小，因此染色順序先行TUNEL原位凋亡染色后再行免疫組化染色，防止抗原熱修復(fù)對DNA造成損傷。

目前雖有全自動免疫組化儀的應(yīng)用[6]，節(jié)省人力，規(guī)范自動化，但其自動化步驟不靈活，期間廢片不能檢出，造成試劑的浪費，增加了試驗成本，尤其是第一次染色后，仍需人工判定切片是否可以繼續(xù)進行第二次標記染色。因此在雙標染色中不主張應(yīng)用全自動免疫組化儀。染色過程中滴加一抗及二抗前用濾紙吸附多余的水分，防止試劑稀釋影響染色，同時所加抗體量要足，充分覆蓋切片，滴加抗體后孵育時間要充足，同時應(yīng)放在濕盒中防止干燥，以免染色不均。

雙標染色可以用單酶或兩種酶系統(tǒng)進行染色。利用單酶做雙標染色的主要不利因素為第一次標記抗體的殘留部分不易洗去，易造成假陽性反應(yīng)。雖然可以在兩流程之間用酸洗和氣化來加以克服，但總有一定誤差。用兩種酶分別標記兩種不同的抗原，可以避免非特異性交叉反應(yīng)，兩種酶反應(yīng)系統(tǒng)互不干擾，顯色清晰可靠。因此目前研究中多用兩種酶標記不同的抗原進行顯色。本實驗為防止染色系統(tǒng)的干擾應(yīng)用過氧化物酶反應(yīng)系統(tǒng)DAB顯色劑顯色顯示caspase-3陽性細胞（呈黃色），用堿性磷酸酶反應(yīng)系統(tǒng)NBT顯色液顯色顯示凋亡細胞（呈藍紫色），同時保證在第一次染色后顏色不能被后續(xù)步驟洗脫。

已經(jīng)證實大鼠顱腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經(jīng)細胞可產(chǎn)生凋亡[7]。觸發(fā)凋亡的途徑很多[8]，但大多通過半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)，caspase-3被認為是caspases家族中的關(guān)鍵蛋白酶[9]，TUNEL法通過標記凋亡細胞染色體DNA斷裂后可產(chǎn)生大量的粘性3′-OH末端特定的斷裂端，因而是檢測凋亡的重要方法[10]。在我們的caspase-3和TENUL雙標染色切片中，可見大部分caspase-3免疫染色陽性細胞TUNEL標記同時也表現(xiàn)陽性，說明細胞凋亡大部分是通過caspase-3介導(dǎo)的[11]。同時在雙標染色切片中也存在部分TUNEL陽性細胞陽性而未見caspase-3免疫染色陽性，這說明有一部分細胞可能是通過其他途徑凋亡的。同時一小部分caspase-3免疫染色陽性細胞未見TUNEL標記陽性，說明caspase-3所介導(dǎo)的凋亡過程中由于凋亡抑制因子的存在，caspase-3失活，凋亡程序不能繼續(xù)，部分細胞有存活下來的希望。雙標染色技術(shù)可以在同一張切片中展示上述關(guān)系，很好的說明了這個問題。雙標染色技術(shù)不但可以在此應(yīng)用，也可用于類似的研究中，是一項富有生命力的技術(shù)。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-03-10）

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