小劑量超短波治療對大鼠脊髓損傷后炎癥反應(yīng)及水腫的影響①

萬峪岑，孫師，趙利娜，尹艷梅，馮智萍，周禹鑫，張志強(qiáng)，張立新

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小劑量超短波治療對大鼠脊髓損傷后炎癥反應(yīng)及水腫的影響①

萬峪岑，孫師，趙利娜，尹艷梅，馮智萍，周禹鑫，張志強(qiáng)，張立新

[摘要]目的觀察小劑量超短波治療對大鼠脊髓損傷后運(yùn)動功能恢復(fù)、水腫及巨噬細(xì)胞反應(yīng)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法56只Sprague-Dawley大鼠分為3組。假手術(shù)組(n=8)暴露硬脊膜后，不予打擊，直接縫合；模型組(n=24)采用Allen打擊法建立大鼠脊髓損傷(SCI)模型，不給予任何治療；超短波組(n=24)在SCI后第2天開始給予受損部位小劑量超短波(最大輸出功率40 W，實(shí)際輸出功率11.58 W)治療，7 min/次，1次/d，至取材前。于造模后1周、2周、3周、4周采用BBB評分評定大鼠的后肢運(yùn)動功能，免疫組織化學(xué)染色檢測水通道蛋白-4(AQP-4)、巨噬細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)抗原(ED-1)的表達(dá)。結(jié)果治療后，BBB評分逐漸增加；術(shù)后1～4周，與模型組相比，超短波組評分明顯增加(t>3.368, P<0.01)。術(shù)后1周起，模型組、超短波組的AQP-4及ED-1陽性表達(dá)較假手術(shù)組增加，且呈下降趨勢；與模型組相比，超短波組各時間點(diǎn)的AQP-4及ED-1表達(dá)均減少(t>3.156, t>4.466, P<0.05)。結(jié)論脊髓損傷后超短波治療可以減輕損傷處繼發(fā)性水腫，減少炎癥細(xì)胞的活化及浸潤，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞]脊髓損傷；超短波；水通道蛋白-4；巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞；大鼠

[本文著錄格式]萬峪岑，孫師，趙利娜，等.小劑量超短波治療對大鼠脊髓損傷后炎癥反應(yīng)及水腫的影響[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016, 22(2): 150-155.

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脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)的發(fā)病率高，并發(fā)癥多，嚴(yán)重危害人類健康。脊髓損傷后早期病理改變以出血、水腫、炎癥、缺血等反應(yīng)為主。水腫后，脊髓組織受到軟脊膜、硬脊膜的限制，內(nèi)壓力升高，加重內(nèi)循環(huán)障礙，造成神經(jīng)元缺血、缺氧及壞死發(fā)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，后期運(yùn)動功能恢復(fù)與早期脊髓水腫程度密切相關(guān)[1]。炎癥反應(yīng)是脊髓損傷后繼發(fā)性損傷重要的病理過程，多種免疫炎性細(xì)胞通過血腦屏障進(jìn)入損傷部位，損傷局部的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞大量活化，小膠質(zhì)細(xì)胞和脊髓/血源性巨噬細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的第一道也是最主要的一道免疫防線[2]。巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞可以吞噬損傷局部的神經(jīng)細(xì)胞，清理壞死的組織殘骸，也可以分泌大量細(xì)胞毒性因子、自由基，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[3]；其分泌的炎癥趨化因子可以使炎癥反應(yīng)呈瀑布樣擴(kuò)大，導(dǎo)致產(chǎn)生遠(yuǎn)大于原發(fā)損傷的壞死液化區(qū)域。

超短波治療因其安全、有效已廣泛應(yīng)用于康復(fù)醫(yī)學(xué)臨床治療中。小劑量超短波治療可以改善血液循環(huán)，促進(jìn)炎癥吸收，減輕水腫[4]，增強(qiáng)組織營養(yǎng)，加強(qiáng)局部組織代謝。在基礎(chǔ)試驗(yàn)中，小劑量超短波已被證實(shí)對外周神經(jīng)的營養(yǎng)、再生及功能恢復(fù)有效[4-6]。國內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)超短波治療脊髓損傷后作用的相關(guān)研究。本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中，已證實(shí)超短波可以減輕脊髓損傷大鼠遠(yuǎn)期的損傷空洞面積，改善其運(yùn)動功能[6]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察超短波對大鼠脊髓損傷后早期水腫及炎癥反應(yīng)的影響，研究并探討其作用機(jī)制，為脊髓損傷的多樣化治療提供可能的理論基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1動物和分組

8～10周齡Sprague-Dawley大鼠56只，體質(zhì)量180～250 g，由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。將大鼠分為假手術(shù)組(n=8)、模型組(n=24)和超短波組(n=24)。每組分別分為1周、2周、3周、4周各4個亞組，假手術(shù)組每個亞組2只，模型組和超短波組每個亞組6只。

1.2試劑與儀器

小鼠抗大鼠巨噬細(xì)胞-小膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)抗原(ED-1)單克隆抗體：MILLPORE。兔抗大鼠水通道蛋白(aquaporin-4, AQP-4)多克隆抗體：ABCAM。SABC試劑：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。DAB顯色劑：福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。RM2245石蠟切片機(jī)、DMD108顯微圖像成像系統(tǒng)：LEICA。BS-60光學(xué)顯微鏡：OLYMPUS。五官超短波治療機(jī)：上海醫(yī)用設(shè)備廠，頻率40.68 MHz，最大輸出功率40 W。

1.2.1模型制備

10%水合氯醛0.33 ml/100 g腹腔麻醉大鼠，無菌條件下在T9～T11平面打開椎管，暴露T10節(jié)段脊髓，采用改良Allen法[7]制作脊髓損傷模型，打擊強(qiáng)度為10 cm×10 g，大鼠立即出現(xiàn)一過性鼠尾擺動和后肢痙攣視為造模成功，蘇醒后評分為0～1分。術(shù)后傷口局部青霉素沖洗防止感染，清醒后分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。術(shù)后3 d每天給大鼠腹腔注射青霉素8萬U，每天早晚排尿2次，直至建立正常的排尿反射。術(shù)后觀察大鼠切口愈合情況，保持身體干燥，預(yù)防泌尿系感染及壓瘡等并發(fā)癥。剔除蘇醒后評分過高及死亡者，并及時補(bǔ)充。

假手術(shù)組僅單純咬除椎板，脊髓無損傷。

1.2.2干預(yù)方法

模型組不給予治療。超短波組損傷后24 h進(jìn)行損傷部位小劑量超短波治療。將大鼠固定于特制的塑料固定器內(nèi)，直徑4 cm的圓形電極板對置于大鼠損傷脊髓兩側(cè)，電極板與脊髓皮膚間隙2 cm，調(diào)諧后第1檔輸出功率約為11.58 W，7 min/次，1次/d，直至取材前一天。

1.2.3取材

脊髓損傷后按預(yù)定時間，大鼠10%水合氯醛0.33 ml/100 g腹腔麻醉，仰臥位開胸，暴露兩肺和心臟，首先以4℃預(yù)冷的生理鹽水約250 ml經(jīng)心臟-主動脈灌注至肝臟顏色變淺；更換4℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定液約200 ml心臟灌注至大鼠四肢震顫，四肢僵硬，停止灌流。解剖并暴露脊髓，取以T10損傷處為中心向頭尾端共1 cm的脊髓，置于4%多聚甲醛PBS溶液的標(biāo)本儲存瓶中4℃固定24 h，石蠟包埋，沿脊髓長軸縱向連續(xù)切片，片厚3μm。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1 BBB評分

術(shù)后第2天及1、2、3、4周對所有大鼠進(jìn)行BBB行為學(xué)評分，評分采用雙人雙盲法，觀察時間為4 min。0分為全癱，21分為正常大鼠。

1.3.2免疫組化染色

每個脊髓組織標(biāo)本切片選取10張，常規(guī)脫蠟，高壓抗原修復(fù)，3% H2O2溶液中孵育，10%胎牛血清封閉，分別滴加小鼠抗大鼠ED-1單克隆抗體(1∶2000)，兔抗大鼠AQP-4多克隆抗體(1∶800)，4℃過夜，陰性對照用PBS代替一抗；PBS沖洗，分別滴加SABC試劑，具體染色步驟按照試劑盒說明執(zhí)行。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，透明封片。使用DMD108顯微圖像成像系統(tǒng)對每張切片進(jìn)行拍照(400×)，每張切片隨機(jī)選取4個視野。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像處理，行AQP-4陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)及ED-1的積分光密度(integral optical density, IOD)值測量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則進(jìn)一步做Bonferroni檢驗(yàn)，進(jìn)行兩兩比較。顯著性水平α=0.05。

2　結(jié)果

大鼠麻醉后行脊髓損傷手術(shù)操作，術(shù)后約1～2 h后清醒，大鼠雙下肢癱瘓，二便障礙，行動遲緩，進(jìn)食水情況較差，術(shù)后1 d BBB評分為0～1分，說明脊髓損傷模型造模成功。

實(shí)驗(yàn)期間共死亡4只大鼠，假手術(shù)組因手術(shù)誤傷導(dǎo)致下肢輕癱瘓排除1只大鼠。模型組因麻醉過量死亡1只，因泌尿系感染死亡2只；超短波組因麻醉過量死亡1只。其余大鼠均存活至取材，各組死亡及排除大鼠于實(shí)驗(yàn)中隨時補(bǔ)齊。

2.1 BBB評分

假手術(shù)組大鼠BBB評分為21分。模型組及超短波組術(shù)后1天評分為0～1分，隨著時間延長，評分逐漸增加。術(shù)后1～4周，與模型組相比，超短波組評分明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1　脊髓損傷后不同時間點(diǎn)各組BBB評分

2.2 AQP-4

假手術(shù)組的AQP-4在白質(zhì)的神經(jīng)元及灰質(zhì)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞中均有少量表達(dá)。模型組在中央灰質(zhì)內(nèi)表達(dá)增加，血管周圍膠質(zhì)細(xì)胞及中央室管膜細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)。超短波組AQP-4表達(dá)位置與模型組基本相同，但數(shù)量有所減少。見圖1。

脊髓損傷后，模型組、超短波組AQP-4陽性細(xì)胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增加。術(shù)后1周起，兩組AQP-4表達(dá)均呈下降趨勢。各個時間點(diǎn)，超短波組的AQP-4陽性細(xì)胞數(shù)較模型組均減少(P<0.05)，2周時最為明顯。見表2。

表2　脊髓損傷后不同時間點(diǎn)各組AQP-4陽性細(xì)胞數(shù)

2.3 ED-1

假手術(shù)組大鼠ED-1陽性細(xì)胞數(shù)量稀少。模型組早期可見大量ED-1陽性棕色顆粒在損傷區(qū)內(nèi)分布密集，在損傷區(qū)周圍呈彌散樣分布，遠(yuǎn)離損傷區(qū)的陽性細(xì)胞密度逐漸減低；3周后可見ED-1陽性細(xì)胞呈團(tuán)塊樣或泡沫樣表達(dá)于損傷區(qū)和壞死空洞壁周圍。超短波組ED-1表達(dá)位點(diǎn)與假手術(shù)組基本相同。見圖2。

脊髓損傷后，模型組和超短波組各時間點(diǎn)的ED-1表達(dá)均較假手術(shù)組增加。術(shù)后1周起，兩組ED-1表達(dá)均呈下降趨勢。各個時間點(diǎn)，超短波組ED-1表達(dá)均較模型組顯著降低(P<0.001)。見表3。

表3　脊髓損傷后不同時間點(diǎn)各組ED-1(IOD)

圖1　脊髓損傷后1～4周各組AQP-4表達(dá)(免疫組化染色，400×)

圖2　脊髓損傷后1～4周各組ED-1表達(dá)(免疫組化染色，400×)

3　討論

AQP是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的組成因素，主要功能為介導(dǎo)細(xì)胞跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)[10]，高表達(dá)于星型膠質(zhì)細(xì)胞膜、髓鞘周圍的少突膠質(zhì)細(xì)胞膜以及室管膜上皮細(xì)胞，同時在神經(jīng)元上有少量分布[9]，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)水代謝的調(diào)節(jié)具有雙向作用[10-11]。脊髓損傷后由于局部缺血缺氧及炎癥反應(yīng)刺激，微血管被破壞，激發(fā)AQP的高表達(dá)，促進(jìn)大量水分從血管中游離于組織間隙，并從低滲區(qū)間質(zhì)向高滲區(qū)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，加重神經(jīng)細(xì)胞的水腫，加速細(xì)胞凋亡[12-13]。

巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞是最主要的炎癥細(xì)胞，ED-1表達(dá)于活性的巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中[14]。隨著對炎癥反應(yīng)作用研究的深入，目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)在脊髓損傷中具有雙重作用[15]。巨噬細(xì)胞可吞噬壞死組織，清除軸突再生抑制物質(zhì)，減少瘢痕形成[16]。巨噬/小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1和M2兩種不同亞群細(xì)胞[17-18]，其中M1細(xì)胞可釋放大量促炎性因子和自由基，具有神經(jīng)毒性作用[19]；M2細(xì)胞可以分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子及抑炎因子，減少對正常組織的損傷，促進(jìn)軸突再生[20]。過高的炎性反應(yīng)會導(dǎo)致?lián)p傷面積擴(kuò)大，鄰近區(qū)域軸突變性及脫髓鞘[21]。

超短波屬于高頻電治療范圍，目前廣泛應(yīng)用于物理治療中。高頻電對生物體的作用可分為熱與非熱兩種效應(yīng)。高頻電治療時，帶電顆粒在高頻電場中急劇振蕩和旋轉(zhuǎn)，與周圍媒介發(fā)生摩擦產(chǎn)生“內(nèi)源性熱”。產(chǎn)熱深度可達(dá)深部肌肉和骨，產(chǎn)熱均勻且可控。小劑量超短波治療時，其非熱效應(yīng)也可以引起生理功能的改變，機(jī)制尚待研究。周淑華等研究表明，微熱量超短波可調(diào)節(jié)一氧化氮合酶(NOS)活性，減輕內(nèi)毒素性肺損傷血管內(nèi)膜及平滑肌的損傷；擴(kuò)張血管，預(yù)防肺動脈高壓[22]。芮永軍等發(fā)現(xiàn)超短波可增加坐骨神經(jīng)損傷后脊髓內(nèi)降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)的表達(dá)，CGRP是強(qiáng)烈的血管舒張因子，且可觸發(fā)神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元的存活和修復(fù)[23]。多個研究證實(shí)，無熱量超短波可減少肺部炎癥血清和痰液中的炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞)及炎癥因子(IL-8、TNF-a、IL-6)，改善肺通氣功能，促進(jìn)炎癥吸收[24-25]。在我們既往的實(shí)驗(yàn)中，超短波治療可以增加血管內(nèi)皮生長因子mRNA的含量，減少坐骨神經(jīng)損傷后脛前肌的萎縮，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度，提高軸突的直徑和髓鞘的厚度[5]。Pang的實(shí)驗(yàn)中，同樣證實(shí)超短波可以提高坐骨神經(jīng)損傷后血管內(nèi)皮生長因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的蛋白和基因的表達(dá)[4]。

本實(shí)驗(yàn)中，各時間點(diǎn)的超短波組ED-1表達(dá)均較模型組顯著降低(P<0.001)，說明早期超短波治療可抑制脊髓損傷后炎癥反應(yīng)。從1周起，超短波組AQP-4陽性表達(dá)較模型組明顯減少，且各時間點(diǎn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中以2周時最為明顯，2周以后差異趨勢逐漸減小，說明2周時超短波治療消除脊髓水腫作用最為明顯，2周以后作用相對減小。大鼠的行為學(xué)檢測可見，超短波治療可提高BBB評分，從1周起出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，且趨勢逐漸增加。說明超短波治療抑制炎癥反應(yīng)，消除脊髓水腫，可以改善運(yùn)動功能。其機(jī)制可能為高頻熱可以引起小動脈及毛細(xì)血管擴(kuò)張[22-23]，血流速度加快，使?jié)B出物清除加快，消除水腫；血管再生增加[6]，組織供氧及營養(yǎng)供給增強(qiáng)，ATP等物質(zhì)供給增加，增強(qiáng)大小吞噬細(xì)胞的吞噬功能；由于代謝廢物及誘發(fā)炎癥的化學(xué)介質(zhì)排出加速，有利于急性炎癥的消散，控制炎癥范圍，減少正常臨界神經(jīng)組織的破壞。超短波抑制炎癥反應(yīng)可改善神經(jīng)功能的機(jī)制是否與促進(jìn)巨噬細(xì)胞優(yōu)化極化比例有關(guān)，以及其傳導(dǎo)通路尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察?？傊?，超短波治療可減輕脊髓損傷后水腫，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

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·綜述·

Effects of Low Dose Ultrashort Wave Therapy on Inflammation and Edema after Spinal Cord Injury in Rats

WAN Yu-cen, SUN Shi, ZHAO Li-na, YIN Yan-mei, FENG Zhi-ping, ZHOU Yu-xin, ZHANG Zhi-qiang, ZHANG Li-xin
Department of Rehabilitation, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang, Liaoning 110022, China

Correspondence to ZHANG Li-xin. E-mail: zhanglx@sj-hospital.org

Abstract:Objective To investigate the effect of ultrashort wave therapy on edema and inflammatory reaction after spinal cord injury (SCI) in rats. Methods 56 Sprague-Dawley rats were divided into sham-operated group (n=8), model group (n=24) and ultrashort wave group (n=24). The model was established with Allen's method. The sham-operated group was exposed endorhachis without hit. The ultrashort wave group was exposed to ultrashort wave radiation 7 minutes, once a day, 24 hours after modeling until the animals were sacrificed. Locomotors functional recovery was assessed every week post operation period by BBB score. Immunohistochemical staining was performed to observe the expression of the aquaporin-4(AQP-4) and ED-1. Results The BBB scores increased in the model group and the ultrashort wave group after treatment, and was higher in the ultrashort wave group than in the model group from 1 week after treatment (t>3.368, P<0.01). The expressions of AQP-4 and ED-1 were higher in the model group and ultrashort wave group than in the sham-operated group, and decreased as time went on. They were lower in the ultrashort wave group than in the model group(t>3.156, t>4.466, P<0.05). Conclusion Ultrashort wave therapy can alleviate the edema after SCI, reduce the activation and infiltration of inflammatory cells, and promote the recovery of neurological function.

Key words:spinal cord injury; ultrashort wave; aquaporin-4; macrophage/microglias; rats

(收稿日期：2015-11-02修回日期：2015-12-28)

作者簡介：作者單位：中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)中心，遼寧沈陽市110022。萬峪岑(1986-)，女，漢族，遼寧沈陽市人，醫(yī)師，主要研究方向：脊髓損傷康復(fù)。通訊作者：張立新(1974-)，女，漢族，遼寧人，博士，副教授，主要研究方向：脊髓損傷康復(fù)。E-mail: zhanglx@sj-hospital.org。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81101462)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.02.006

[中圖分類號]R651.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1006-9771(2016)02-0150-06