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    基于綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷提取率的四妙勇安湯拆方分析*

    2016-03-20 08:29:34遲森森
    關(guān)鍵詞:妙勇安全方哈巴

    遲森森,王 翀,劉 斌

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102)

    基于綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷提取率的四妙勇安湯拆方分析*

    遲森森,王 翀,劉 斌**

    (北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 北京 100102)

    目的:研究四妙勇安湯不同配伍組合對綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷提取率的影響。方法:將四妙勇安湯拆方后,采用高效液相色譜法,SunFireTM C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)為流動相,流速1.0 mL·min-1,柱溫35 ℃,測定綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的含量并分別計算其提取率。結(jié)果:測定了原方及拆方后共14組樣品中綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的含量并計算相應(yīng)提取率,其回歸方程分別為Y=2 945 611.51X-77 211.93(r=0.999 6),Y=5 266 108.02X-2 733.36(r=0.999 6),Y=8 599 526.24X-11 646.29(r=0.999 6)和Y=2 822 342.06X-1 685.64(r=0.999 8),線性范圍分別為0.237-1.422,0.009 76-0.058 56,0.015 68-0.094 08和0.007 27-0.043 6 μg,平均加樣回收率分別為99.39%(RSD=1.76%),102.59%(RSD=2.55%),103.60%(RSD=1.07%)和99.32%(RSD=2.93%)。結(jié)論:與單味金銀花、當歸相比,拆方組綠原酸和阿魏酸的提取率均有明顯降低,而其全方配伍后的提取率僅低于單味藥單煎時提取率;玄參中肉桂酸和哈巴俄苷在全方配伍后提取率最高。本研究有助于揭示四妙勇安湯單味藥配伍過程中化學(xué)組分變化及配伍作用機制。

    四妙勇安湯 拆方配伍 綠原酸 阿魏酸 肉桂酸 哈巴俄苷

    中藥復(fù)方是中醫(yī)臨床用藥的主要形式,在理、法、方、藥中占有重要的一環(huán)。復(fù)方中各組方藥味通過“君臣佐使”配伍,從而使群藥形成有制之師,針對證或病,達到整體調(diào)節(jié)的目的[1]。中藥復(fù)方四妙勇安湯最早見于華佗的《神醫(yī)秘傳》[2],后被收載于《驗方新編》,該方由金銀花、玄參、當歸和甘草四味藥組成,具有滋陰降火、活血化瘀、和營解毒之功效,臨床常用于治療脫疽[3-5]、血栓閉塞性脈管炎[6]、結(jié)節(jié)性紅斑和痛風性關(guān)節(jié)炎[7]等疾病?;瘜W(xué)成分研究表明:該方中的四味藥含有有機酸、黃酮、環(huán)烯醚萜、苯丙素、揮發(fā)油、三萜皂苷和多糖等成分[8-11]。由于該方的化學(xué)成分包含有機酸,水煎液呈酸性,可能影響有效成分的溶出率及其存在狀態(tài),或使酸不穩(wěn)定成分發(fā)生化學(xué)變化。前期研究發(fā)現(xiàn):四妙勇安湯中金銀花與玄參、當歸和甘草不同配伍均能提高當藥苷和馬錢苷的提取率[12];玄參與金銀花、當歸、甘草配伍均能降低哈巴苷的提取率,但全方煎煮可提高其提取率[13];甘草與金銀花、玄參、當歸配伍均能明顯降低甘草酸的提取率[14]。本文以四妙勇安湯中3種有機酸類成分綠原酸、阿魏酸和肉桂酸,1種環(huán)烯醚萜苷類成分哈巴俄苷為指標,研究拆方配伍對以上4個成分提取率的影響,為全面系統(tǒng)探究四妙勇安湯單味藥配伍過程中化學(xué)組分變化及配伍作用機制提供依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    Waters高效液相色譜儀,自帶1525型二元高壓梯度泵系統(tǒng),2414型柱溫控制系統(tǒng),2998型PDA檢測器,2707型自動進樣系統(tǒng)(美國Waters公司);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);Sartorious BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)。

    表1 四妙勇安湯組方藥味不同拆方組成

    金銀花(產(chǎn)地:山東,批號:140201)、玄參(產(chǎn)地:浙江,批號:140101)、當歸(產(chǎn)地:甘肅,批號:140101)和甘草(產(chǎn)地:甘肅,批號:140301)藥材均購自安國市鼎晟中藥飲片經(jīng)營有限公司。經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定:所購金銀花藥材為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾;所購當歸藥材為傘形科植物當歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels.的干燥根;所購玄參藥材為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根;所購甘草藥材為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根莖。綠原酸(批號:110753-201314)、阿魏酸(批號:10773-201012)、肉桂酸(批號:110786-200503)和哈巴俄苷(批號:111730-201307)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈(德國Merck公司);純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司);其他試劑均為分析純。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 色譜條件

    SunfireTM C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流速1.0 mL·min-1;檢測波長278 nm(肉桂酸和哈巴俄苷)、316 nm(綠原酸和阿魏酸);柱溫 35℃;流動相乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0-25 min,12% A;25-60 min,12%-30% A;60-75 min,30%-95% A;75-80 min,95%A)。

    2.2 樣品制備

    參照《驗方新編》,以金銀花∶玄參∶當歸∶甘草=3∶3∶2∶1的比例,按表1所示,稱取四妙勇安湯組方單味藥14個拆方組飲片。取各組飲片,分別加入12倍體積的水浸泡60 min后,回流提取60 min,濾過,藥渣加10倍量水回流提取45 min,合并兩次濾液,回收溶劑至0.5 g·mL-1,用95%乙醇調(diào)節(jié)乙醇質(zhì)量分數(shù)至70%,靜置過夜,離心取上清液,減壓回收溶劑,殘留物減壓干燥得干膏,稱重,備用。

    2.3 對照品溶液制備

    分別精密稱取綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷對照品適量,加50%甲醇溶解,制成質(zhì)量濃度分別為0.119、0.004 88、0.007 84和0.003 67 mg·mL-1的對照品溶液。

    2.4 供試品溶液制備

    各取四妙勇安湯不同拆方組水提物約50 mg,精密稱定于10 mL量瓶中,加50%甲醇超聲溶解(100 kHz,30 min),放冷,50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過,即得供試品溶液。

    2.5 陰性樣品溶液制備

    分別取四妙勇安湯不同拆方組中缺金銀花組、缺玄參組和缺當歸組樣品,按照“2.2”和“2.4”項下方法,制備金銀花、玄參和當歸陰性樣品溶液。

    2.6 空白試驗

    按照“2.1”項下色譜條件,分別精密吸取綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷對照品溶液各10 μL、供試品溶液及缺金銀花、缺玄參、缺當歸陰性樣品溶液各25 μL進樣檢測。在對照品溶液和供試品溶液色譜圖相應(yīng)位置上,有相同保留時間的色譜峰,而陰性樣品溶液色譜圖相應(yīng)位置無色譜峰,結(jié)果見圖1、圖2和圖3。

    2.7 線性關(guān)系考察

    精密吸取混合對照品溶液各2,4,6,8,10,12 μL進樣檢測,測定色譜峰峰面積。以對照品的進樣量(X)為橫坐標,色譜峰的峰面積(Y)為縱坐標,繪制標準曲線。計算綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷回歸方程分別為:Y=2 945 611.51X-77 211.93,r=0.999 6(n=5);Y=5 266 108.02X-2 733.36,r=0.999 6(n=5);Y=8 599 526.24X-11 646.29,r=0.999 6(n=5)和Y=2 822 342.06X- 1 685.64,r=0.999 8(n=5),表明綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷進樣量分別在0.237-1.422,0.009 76-0.058 56,0.015 68-0.094 08和0.007 27-0.043 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.8 精密度考察

    稱取樣品1(全方)2份(約25 mg和50 mg),精密稱定,按“2.4”項下方法處理,前者精密吸取25 μL(測定綠原酸),后者精密吸取50 μL(測定阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷),連續(xù)進樣6次測定綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷色譜峰峰面積,計算RSD值分別為0.19%,1.79%,1.15%和0.72%(n=6),表明精密度良好。

    2.9 穩(wěn)定性考察

    稱取樣品1(全方)2份(約25 mg和50 mg),精密稱定,按“2.4”項下方法處理,前者精密吸取25 μL(測定綠原酸),后者精密吸取50 μL(測定阿魏酸、肉桂酸、哈巴俄苷),分別于制備后0,2,4,6,8,10,12 h進樣,測定綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷色譜峰峰面積,計算RSD值分別為0.21%,2.93%,1.59%和2.01% ,表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

    2.10 重復(fù)性考察

    稱取樣品1(全方)6份,每份分為2份(25 mg和50 mg),精密稱定,按“2.4”項下方法處理,前者精密吸取25 μL(測定綠原酸),后者精密吸取50 μL(測定阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷)進樣檢測,測定色譜峰峰面積。計算綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的平均質(zhì)量分數(shù)分別為1.704 5%(RSD = 0.85%),0.015 1%(RSD = 2.96%),0.028 0%(RSD = 2.63%)和0.013 1%(RSD = 1.14%),表明該方法重復(fù)性符合要求。

    2.11 加樣回收率試驗

    稱取已知含量的樣品1(全方)(綠原酸的平均含量為1.704 5%)6份,每份約12.5 mg,精密稱定,分別置10 mL量瓶中,精密加入綠原酸對照品溶液(0.395 mg·mL-1)0.5 mL,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,備用。

    稱取已知含量的樣品1(全方)(阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的平均含量分別為0.015 1%、0.028 0%和0.013 1%)6份,每份約25 mg,精密稱定于10 mL量瓶中,分別精密加入阿魏酸對照品溶液(0.012 2mg·mL-1)0.3 mL,肉桂酸對照品溶液(0.007 84 mg·mL-1)0.9 mL,哈巴俄苷對照品溶液(0.012 12 mg·mL-1)0.27 mL,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,備用。

    圖1 綠原酸對照品、缺金銀花陰性樣品、供試品HPLC色譜圖

    圖2 阿魏酸對照品、缺當歸陰性樣品、供試品HPLC色譜圖

    分別精密吸取以上兩種供試品溶液25 μL和50 μL進樣檢測,測定各色譜峰峰面積,計算綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷的含量和回收率,結(jié)果見表2。

    2.12 樣品含量測定

    分別取四妙勇安湯不同拆方組樣品各3份,每份分為2份(25 mg和50 mg),精密稱定,按“2.4”項下方法制備供試品溶液,前者精密吸取25 μL(測定綠原酸),后者精密吸取50 μL(測定阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷),精密吸取綠原酸、阿魏酸、肉桂酸和哈巴俄苷混合對照品溶液8 μL進樣檢測,測定色譜峰峰面積,并計算其含量和提取率,結(jié)果見表3。

    3 討論

    四妙勇安湯拆方含量測定結(jié)果表明,組方中四味藥經(jīng)不同配伍后,金銀花水煎液中綠原酸、當歸水煎液中阿魏酸的提取率均較單煎時明顯降低,其最大降低值分別為34.55%和74.69%。玄參中哈巴俄苷在其配伍金銀花后,提取率降低了5.83%,金銀花、當歸和玄參三味藥配伍后,哈巴俄苷的提取率降低了5.03%,而其它5種配伍方式則均會增加哈巴俄苷提取率。三味藥配伍方式均降低了綠原酸、肉桂酸和阿魏酸這3類有機酸類成分的提取率,其中玄參、當歸和甘草配伍后有機酸類成分提取率最低。肉桂酸和哈巴俄苷在全方配伍后提取率最高,分別較單煎時增加了4.16%和10.65%,而綠原酸和阿魏酸在全方配伍后的提取率僅低于單味藥單煎時提取率。

    表2 加樣回收率測定結(jié)果

    在實驗過程中,未發(fā)現(xiàn)不同配伍水煎液出現(xiàn)沉淀,有機酸類成分提取率均較單煎時降低的原因可能是有機酸類成分存在溶出競爭,提取被抑制[15]。綠原酸是方中君藥金銀花清熱解毒的主要有效成分,其提取率在金銀花單煎時最高,這符合四妙勇安湯使用時“初起用金銀花二斤煎湯,方可解其毒”的用藥規(guī)律,配伍后綠原酸提取率降低而清熱解毒力不減也說明[16]該方清熱解毒作用不單是綠原酸所為,而是四妙勇安湯各組成藥物間、各有效成分間協(xié)同作用。哈巴俄苷和肉桂酸為君藥玄參瀉火解毒的主要成分之一[17,18],其提取率在全方配伍后達到最高。阿魏酸為佐藥當歸活血散瘀的活性成分[19],其對君藥金銀花中綠原酸的提取率有較大的影響。上述結(jié)果表明,在探討四妙勇安湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其配伍規(guī)律時,應(yīng)充分考慮復(fù)方組方單味藥之間相輔相成的整體性。但方劑配伍研究僅是闡明中藥復(fù)方防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用方式的有效途徑之一,若要闡明四妙勇安湯更確切的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其相互作用機制,尚有待于多種途徑的進一步研究。

    續(xù)表2

    表3 14個拆方組樣品含量測定結(jié)果(%,n=3)

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    Decomposition Analysis Method in the Extraction Rates of Chlorogenic Acid, Ferulic Acid, Cinnamic Acid and Harpagoside from Simiao Yong’an Decoction

    Chi Sensen, Wang Chong, Liu Bin
    (School of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China)

    This study aimed to investigate the influences of different compatible combinations of Simiao Yong'an decoction (SYD) on the extraction rates of chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside, which were determined by HPLC with a SunFireTMC18analytical column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) in the dismantling of SYD. The mobile phase was composed of acetonitrile (A) and aqueousphosphoric acid (0.1%) (B) using a gradient elution. Extractions were performed at 35℃ with a flow rate of 1.0 mL·min-1. The chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside in fourteen groups from the original prescription and dismantlement were detected and analyzed. As a result, the regression formulations for chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside were Y = 2 945 611.51X-77 211.93 (r = 0.999 6), Y = 5 266 108.02X-2 733.36 (r = 0.999 6), Y = 8 599 526.24X-11 646.29(r = 0.999 6) and Y = 2 822 342.06X-1 685.64 (r = 0.999 8), respectively. Theindividual linearity of the extracts ranged from 0.237 to 1.422 μg, 0.009 76 to 0.058 56 μg, 0.015 68 to 0.094 08 μg and 0.007 27 to 0.043 6 μg, respectively. The average recoveries of chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid and harpagoside were 99.39% (RSD 1.76%), 102.59% (RSD 2.55%), 103.60% (RSD 1.07%) and 99.32% (RSD 2.93%). Compared with single LoniceraeJaponicae Flos and Angelica sinensis(Oliv.)Diels., the extraction rates of chlorogenic acid and ferulic acid were obviously reduced in the dismantlement of SYD. Those of the whole prescription were superior to the other groups’, while the extraction rates of cinnamic acid and harpagoside of Scrophularia ningpoensis Hemsl. were the highest in the whole prescription. In conclusion, this study may be beneficial to uncovering the material basis changes behind the compatible mechanisms of SYD.

    Simiao Yong'an decoction, compatibility and dismantlement of prescriptions, chlorogenic acid, ferulic acid, cinnamic acid, harpagoside

    10.11842/wst.2016.08.023

    R917

    A

    (責任編輯:馬雅靜,責任譯審:朱黎婷)

    2016-01-08

    修回日期:2016-01-29

    * 北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項目(2016-JYB-XS050):基于血清化學(xué)成分分析的四妙勇安湯配伍研究,負責人:遲森森。

    ** 通訊作者:劉斌,教授,博士生導(dǎo)師,主要研究方向:中藥(復(fù)方)有效成分(組分)發(fā)現(xiàn)與新藥創(chuàng)制。

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