PI3k/Akt通路參與二仙湯抑制順鉑所致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用＊

楊 蕾，陶仕英，王繼峰，牛建昭，趙丕文，孫麗萍，王燕霞，武洪波，蔡欣悅，楊 陽

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

PI3k/Akt通路參與二仙湯抑制順鉑所致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用＊

楊 蕾，陶仕英＊＊，王繼峰，牛建昭，趙丕文，孫麗萍，王燕霞，武洪波，蔡欣悅，楊 陽

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 北京 100029）

目的：觀察順鉑干預(yù)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，從而探討二仙湯含藥血清經(jīng)PI3k/Akt通路抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：SD雌性大鼠30只，隨機(jī)分為3組，分別為生理鹽水組、補(bǔ)佳樂組、二仙湯組。心臟取血，制備藥物血清。SD大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)貼壁后，用順鉑損傷大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞。經(jīng)各組藥理血清作用后，應(yīng)用Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，并對各實(shí)驗(yàn)組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行分析。應(yīng)用免疫組化法，測定各分組PI3k、Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)行圖像分析。結(jié)果：流式細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，二仙湯可以降低順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率。免疫組化結(jié)果顯示，PI3k、p-Akt、Akt在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)，可見棕黃色陽性物質(zhì)；而二仙湯可以上調(diào)順鉑干預(yù)后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的PI3k、p-Akt、Akt的表達(dá)。結(jié)論：二仙湯含藥血清上調(diào)了PI3k、p-Akt、Akt的表達(dá)，從而抑制了卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，該過程可能通過調(diào)節(jié)PI3k/Akt通路實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而有效地保護(hù)卵巢功能。

二仙湯 卵巢顆粒細(xì)胞 PI3k/Akt通路 細(xì)胞凋亡

二仙湯是名醫(yī)張伯訥教授治療女性更年期腎陰陽兩虛的常用方藥，臨床常用于治療更年期綜合征、更年期高血壓，卵巢早衰等，療效顯著[1，2]。二仙湯主要是由仙茅、淫羊藿、巴戟天、黃柏、知母、當(dāng)歸六味中藥組成。根據(jù)中醫(yī)方劑的配伍原則，本方呈現(xiàn)了辛溫苦寒同用，溫補(bǔ)寒瀉同施，整方溫而不燥，寒而不凝，且以滋腎陰降相火、調(diào)沖任、平陰陽為所長?？蛇_(dá)陰陽調(diào)和之效，對卵巢功能不全起到了很好的治療作用[3]。卵巢顆粒細(xì)胞對育齡期女性的生殖功能起著重要的作用。正常卵泡生長、發(fā)育以及排卵均需要顆粒細(xì)胞的正常增殖和功能表達(dá)[4]，正常的卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，嚴(yán)重影響卵巢功能甚至形成卵巢早衰。順鉑作為抗癌藥物，在臨床治療腫瘤的同時也具有細(xì)胞毒性作用。它可以破壞正常的卵巢顆粒細(xì)胞，使其發(fā)生凋亡，甚至形成卵巢早衰[5]。

PI3k/Akt信號通路是細(xì)胞增殖調(diào)控的重要通路，它主要是通過促進(jìn)細(xì)胞增殖起到抗凋亡作用。該通路的抗凋亡機(jī)制主要是激活后的Akt通過直接磷酸化凋亡機(jī)器組件或間接改變編碼凋亡機(jī)器組件的基因表達(dá)水平，來控制凋亡過程[6]。該通路中分子的參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長、原始卵泡發(fā)育以及顆粒細(xì)胞的增殖、分化。而在人類卵母細(xì)胞中PI3k通路中各信號分子異常表達(dá)會導(dǎo)致原始卵泡生存和發(fā)育的缺陷，造成卵巢的病理狀態(tài)，甚至引起POF；顆粒細(xì)胞內(nèi)的PI3k/Akt信號通路對卵泡的生長和成熟有至關(guān)重要的作用，本文通過分子生物水平，重點(diǎn)觀察二仙湯含藥血清經(jīng)PI3k/Akt信號通路抑制順鉑干預(yù)后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從PI3k/Akt信號通路的角度探討二仙湯含藥血清對卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，探討其可能的治療機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

22-24天健康雌性SD大鼠，共40只，體質(zhì)量60±10 g，隨機(jī)分為5籠，每籠10只，動物飼養(yǎng)在室溫、自然光照的清潔級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，食水充足，食用常規(guī)飼料，飲用去離子水。動物飼料均購于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，使用許可證：SCXK（京）2011-0004。

1.2 實(shí)驗(yàn)用藥

二仙湯由淫羊藿、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏和知母組成。中草藥由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供，按照《婦科臨床方劑學(xué)》規(guī)定的劑量比（9∶6∶10∶15∶12∶10），最終按照人（60 kg）用藥劑量計(jì)算大鼠用藥劑量為7.5 g·kg-1；注射用順鉑（CDDP），每支10 mg（齊魯制藥有限公司，批號：411033CF）；補(bǔ)佳樂（雌激素）購自東直門醫(yī)院，規(guī)格：1 mg/片（拜耳醫(yī)藥有限公司，批號：195A5）。用法與劑量：折算成大鼠所需劑量即0.009 mg·kg-1。

1.3 主要試劑

PI3k、Akt、p-Akt一抗（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號：sc-1637、sc-8312、sc-135651）；AnnexinV FITC凋亡檢測試劑盒（北京歐北科技有限公司，批號：20151210004）；DAB顯色劑（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號：20151016）；二抗SP-9000（羊抗兔）（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，批號：20150921）。

2 方法

2.1 制備卵巢顆粒細(xì)胞

22-24天的雌性SD大鼠10只，體重35 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1天，注射孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）50 IU/只，48 h后，在無菌條件下取出雙側(cè)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。具體操作如下：①取SD大鼠，經(jīng)脫臼處死，浸泡75%酒精中消毒3min。②消毒后放入已消毒托盤中在超凈臺中取雙側(cè)卵巢，放入預(yù)冷的Hank's液2.7 mL。③用Hank's液清洗3次，將其中的脂肪、包膜等清理干凈。④將卵巢移入無血清培養(yǎng)基中，用1 mL一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使顆粒細(xì)胞充分釋放。⑤加入0.3 mL2.5%胰酶反復(fù)用吸管吹打懸液數(shù)次，使顆粒細(xì)胞團(tuán)塊分離。37%消化10 min（每3 min，震蕩或吹打一次）。⑥加入1 mL含血清培養(yǎng)液終止胰酶消化，并靜置10 min。取懸液加入15 mL離心管中。⑦1 000 rpm離心10 min，棄上清。加入生理鹽水5 mL沖散細(xì)胞再次離心。⑧棄上清，加入10%胎牛血清0.2 mL，吹打均勻。⑨計(jì)數(shù)：應(yīng)用血球小板計(jì)數(shù)，調(diào)整懸液濃度，以5×105接種于96孔板中。在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察貼壁情況，待細(xì)胞長滿瓶底至75%-80%融合時，用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 制備藥理血清組

22-24天的雌性SD大鼠50只，體重35-40 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1天，第2天取藥理血清。將藥理血清動物分3組：①正常組：灌胃蒸餾水0.4 mL/天；②補(bǔ)佳樂組：灌胃補(bǔ)佳樂0.009 mg·kg-1/天；③二仙湯組：灌胃二仙湯7.5 g·kg-1/天，各組連續(xù)灌胃3天，于第4天晨起7∶00灌胃，2 h以后，心臟取血并分離血清，-20 ℃保存。

2.3 CDDP損傷顆粒細(xì)胞

待細(xì)胞生長至底壁的75%-80%時，將模型組、補(bǔ)佳樂組、二仙湯組的培養(yǎng)基吸出，每孔加入CDDP（濃度為2.5 μg·mL-1）200 μL，放入37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

2.4 藥物干預(yù)

顆粒細(xì)胞與CDDP作用12 h后，進(jìn)行給藥干預(yù)，每孔加入相應(yīng)的藥理血清組200 μL，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行指標(biāo)測定。

2.5 流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡步驟

2.5.1 實(shí)驗(yàn)步驟

吸取培養(yǎng)皿的上清液轉(zhuǎn)移至微型管中保存。用1×PBS洗細(xì)胞2次，收集清洗液保存。

1 mL 2.5%胰酶消化5 min。1 mL 10%胎牛血清培養(yǎng)基終止消化，將懸液轉(zhuǎn)移至離心管，將第一步、第二步的上清一并加入。3 000 rpm離心3 min，棄上清。加入PBS后3 000 rpm離心3 min，棄上清，重復(fù)本步操作一遍。加入預(yù)先配好的1×結(jié)合緩沖液，制成終濃度為1×106 cell/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL上個步驟中的懸液，加入到新的tube中。向細(xì)胞懸液中加入5 μL AnnexinV，F(xiàn)ITC結(jié)合物，再加入5 μL PISolution。室溫下避光培養(yǎng)15 min。加入400 μL 1×結(jié)合緩沖液，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.5.2 設(shè)定分組

A.正常組，B.模型組，C.補(bǔ)佳樂組，D.二仙湯組。

2.6 卵巢顆粒細(xì)胞PI3k、p-Akt、Akt免疫組化染色步驟

免疫組化染色采用SABC法，其中PI3k、p-Akt、Akt的一抗?jié)舛染鶠?∶200。依次通過：96孔板每孔滴加20 μL 4%多聚甲醛固定、每孔滴加20 μL 0.5%tritox-100、1×PBS清洗、3% H2O2去離子水孵育、1×PBS清洗、滴加試劑A（封閉用正常山羊血清工作液）室溫孵育，傾去，勿洗、滴加一抗，37℃孵育、1×PBS清洗、滴加試劑B（生物素化二抗工作液IgG/Bio），室溫孵育、1×PBS清洗、滴加試劑C（辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液S-A/HRP），室溫孵育、1×PBS清洗、DAB顯色劑顯色，最后自來水沖洗，顯微鏡觀察。

圖1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞流式凋亡情況

每孔隨機(jī)選取6個視野，統(tǒng)一放大倍數(shù)為200倍，利用免疫組化軟件包對卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行灰度測量分析，并測算視野內(nèi)陽性目標(biāo)總面積，并與視野面積相比得到陽性反應(yīng)顆粒的平均光密度（Average Optical Density，AOD），即單位面積內(nèi)陽性顆粒所占面積

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 各實(shí)驗(yàn)組對細(xì)胞凋亡率的影響

AnnexinV/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率證實(shí)，二仙湯含藥血清作用的順鉑干預(yù)后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡明顯降低，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率分別為正常組（22.5±7.77）%、模型組（48.233±11.299）%、補(bǔ)佳樂組（39.667± 17.906）%、二仙湯組（34.367±18.949）%。以上結(jié)果顯示，二仙湯可以降低順鉑損傷后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率（圖1）。

3.2 各組卵巢顆粒細(xì)胞PI3k、p-Akt、Akt表達(dá)的比較

免疫組化結(jié)果顯示，各組PI3k在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)，可見棕黃色陽性物質(zhì)位于胞質(zhì)內(nèi)，正常組PI3k陽性細(xì)胞染色較深，呈棕色或深棕色，表達(dá)較多。模型組陽性細(xì)胞著色較淺，呈淺棕色，表達(dá)較少。補(bǔ)佳樂組、二仙湯組和模型組相比，陽性表達(dá)細(xì)胞著色變深，但不及正常組（圖2）。與PI3k蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相同的趨勢，各組Akt棕黃色陽性表達(dá)位于胞漿內(nèi)，其中正常組表達(dá)最多，呈深棕色；模型組Akt陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，呈淡棕色。補(bǔ)佳樂組、二仙湯組陽性細(xì)胞著色增強(qiáng)，而二仙湯組陽性表達(dá)最為明顯，但少于正常組（圖3）。與Akt蛋白表達(dá)相同，各組p-Akt棕黃色陽性表達(dá)位于胞漿內(nèi)，其中正常組表達(dá)最多，呈深棕色；模型組p-Akt陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，呈淡棕色。補(bǔ)佳樂組、二仙湯組陽性細(xì)胞著色增強(qiáng)，而二仙湯組陽性表達(dá)最為明顯，但少于正常組（圖4）。

由圖4可知，和正常組比較，順鉑干預(yù)后的各組PI3k均表達(dá)減少，模型組呈現(xiàn)極少表達(dá)現(xiàn)象（P＜0.05）；和模型組比較，各治療組均可見陽性表達(dá)增強(qiáng)，但表達(dá)均低于正常組，其中二仙湯組陽性表達(dá)略低于補(bǔ)佳樂組（P＜0.05）。Akt、p-Akt與PI3k表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果相同，和正常組相比較，順鉑干預(yù)后各組Akt表達(dá)均減弱，而以模型組最明顯（P＜0.05）；和模型組比較，各藥物組均可見Akt陽性表達(dá)增加，但弱于正常組（P＜0.05）。與Akt結(jié)果相同，p-Akt和正常組相比較，順鉑干預(yù)后各組表達(dá)均減弱，而以模型組最明顯（P＜0.05）；和模型組比較，各藥物組均可見p-Akt陽性表達(dá)增加，但弱于正常組（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中PI3k蛋白的表達(dá)情況（免疫組化法×200）

圖4 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中p-Akt蛋白的表達(dá)情況（免疫組化法×200）

表1 各組大鼠卵巢細(xì)胞中PI3k、p-Akt、Akt蛋白免疫組化圖像分析結(jié)果（±s，n=6)

表1 各組大鼠卵巢細(xì)胞中PI3k、p-Akt、Akt蛋白免疫組化圖像分析結(jié)果（±s，n=6)

注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

PI3kAktp-Akt正常組1.421±0.047 1.449±0.043 1.079±0.001模型組1.070±0.125**1.261±0.062** 1.039±0.017**補(bǔ)佳樂組1.275±0.097##1.360±0.038**##1.079±0.004##二仙湯組1.273±0.11*##1.356±0.039**##1.077±0.001##

4 討論

PI3k是由sugimoto和Maeara等發(fā)現(xiàn)的一種胞內(nèi)磷脂酞肌醇激酶，與v-src和v-ras等癌基因的產(chǎn)物相關(guān)，它可以特異地使肌醇環(huán)上的3′位經(jīng)基磷酸化。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，因與蛋白激酶C（73%的同源性）和蛋白激酶A（68%的同源性）有同源性，而又稱為蛋白激酶B（PKB）[7]。PI3k/Akt通路在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)發(fā)育、新陳代謝及其他過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它調(diào)節(jié)著細(xì)胞發(fā)育的各個方面，如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞分化[8]。PI3k/Akt信號通路的抗凋亡機(jī)制學(xué)者研究了生長因子受體的下游底物PI3k和Akt的抑制凋亡能力，激活后的Akt通過直接磷酸化凋亡機(jī)器組件或間接改變編碼凋亡機(jī)器組件的基因表達(dá)水平，來控制凋亡過程[9-11]。順鉑對卵巢性激素的分泌和顆粒細(xì)胞、卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞的功能均有損傷，順鉑改變了卵巢組織的穩(wěn)態(tài)內(nèi)環(huán)境，使其產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷效應(yīng)[12]。PI3k/Akt通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞周期增殖、參與血管形成等，是最主要的抑制細(xì)胞凋亡的信號途徑[13]。PI3k/Akt信號通路中分子的參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞生長、原始卵泡發(fā)育以及顆粒細(xì)胞的增殖、分化。而在人類卵母細(xì)胞中PI3k通路中各信號分子異常表達(dá)會導(dǎo)致原始卵泡生存和發(fā)育的缺陷，造成卵巢的病理狀態(tài)，甚至引起POF；顆粒細(xì)胞內(nèi)的PI3k/Akt信號通路對卵泡的生長和成熟有至關(guān)重要的作用，而本實(shí)驗(yàn)觀察二仙湯含藥血清經(jīng)PI3k/Akt信號通路抑制順鉑干預(yù)后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)二仙湯含藥血清對順鉑干預(yù)后的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡率產(chǎn)生了明顯降低凋亡率的效果，經(jīng)免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測，我們發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組中大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的PI3k、p-Akt、Akt蛋白的表達(dá)存在差異：二仙湯可以上調(diào)順鉑干預(yù)后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的PI3k、p-Akt、Akt的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。從我們對PI3k/Akt信號通路的了解，以及綜合以上指標(biāo)可看出：二仙湯含藥血清可以抑制順鉑損傷的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡情況，考慮可能是因?yàn)槎蓽梢陨险{(diào)了p-Akt、Akt、PI3k的表達(dá)，達(dá)到保護(hù)卵巢的作用；但是我們只了解了二仙湯對PI3k/Akt信號通路上游蛋白p-Akt、Akt、PI3k的表達(dá)起到了上調(diào)作用，PI3k/Akt有抑制凋亡的作用，且與MAPK、PKC通路并列。PI3k/PKB可以保護(hù)細(xì)胞，對抗CD95引起的細(xì)胞凋亡；PKB磷酸化BAD（BCl-2家族的一員,具有促凋亡作用），使其失活，從而阻斷了細(xì)胞的凋亡PI3k/PKB是獨(dú)立于其他通路的一個新的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),與細(xì)胞代謝、生長、凋亡、惡變等密切相關(guān)，且與Ras、G蛋白、PKc等有復(fù)雜的交互作用[14，15]。接下來我們將探討在細(xì)胞凋亡的過程中，BAD可與BCl-2或Bax形成復(fù)合物促進(jìn)凋亡，激活后的Akt是一種高效Bad激酶，探討二仙湯是通過磷酸化哪一位點(diǎn)，從而阻斷細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，并發(fā)揮其抗凋亡作用。

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Effects of Er-Xian Decoction on Cisplatin Induced Ovarian Granulosa Cells Apoptosis Through PI3k/Akt Pathway

Yang Lei, Tao Shiying, Wang Jifeng, Niu Jianzhao, Zhao Piwen, Sun Liping, Wang Yanxia, Wu Hongbo, Cai Xinyue, Yang Yang
(School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029, China)

This study aimed to investigate the effects of cisplatin on rats' ovarian granulosa (OG) cells apoptosis, and to explore the mechanism of Er-xian Decoction (EXD) behind the anti-apoptotic role of its pharmacological serum in OG cells by PI3k/Akt pathway.30 female SD rats were randomly divided into three groups, the normal saline group, the progynova group and the EXD group. Pharmacological serum was prepared after heart puncture. Prior to cisplatin stimulation, SD rat OG cells were cultivated withadherence method.When administered by pharmacological serum of EXD, AnnexinV/PI double staining flow cytometry was adopted to detect cell apoptotic situations of OG cells of all groups, and immunohistochemical technology to quantify the protein expressions of PI3k, Akt and p-Akt combined with and the image analysis.It was found that the apoptosis rate, stimulated by cisplatin, was reducedafter EXD administration according to analysis of flow cytometry. Immunohistochemical outcomes showed that PI3k, p-Akt and Akt were expressed in the cytoplasm featuring brown positive substances. EXD enhanced the expressions of PI3k, p-Akt and Akt of cisplatin-stimulated OG cells. In conclusion, EXD prohibited the apoptosis of OG cells through upregulating the expressions of PI3k, p-Akt and Akt, by which affected the PI3k/Akt pathway further and effectively protectedthe ovarian function.

Er-xian decoction, ovarian granulosa cells, PI3k/Akt signaling pathway, cell apoptosis

10.11842/wst.2016.08.020

R285

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：朱黎婷）

2016-08-09

修回日期：2016-08-20

＊ 教育部國家外專局高等學(xué)校學(xué)科創(chuàng)新引智基地項(xiàng)目（B07007）負(fù)責(zé)人：牛建昭；國家自然科學(xué)基金委資助項(xiàng)目（81273887）基于PI3k/Akt信號通路探討二仙湯治療化療損傷性卵巢早衰的作用機(jī)制，負(fù)責(zé)人：牛建昭；國家自然科學(xué)基金委資助項(xiàng)目（30772849）：報(bào)告基因技術(shù)研究二仙湯的雌激素作用機(jī)制和配伍規(guī)律，負(fù)責(zé)人：王繼峰。

＊＊ 通訊作者：陶仕英，副教授，研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥防治女性生殖內(nèi)分泌疾病基礎(chǔ)研究。