基于系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的重要平臺(tái)化學(xué)品生物制造的研究進(jìn)展

袁海波，李江華，劉龍，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

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基于系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的重要平臺(tái)化學(xué)品生物制造的研究進(jìn)展

袁海波，李江華，劉龍，堵國(guó)成，陳堅(jiān)

（江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

摘要：基于生物質(zhì)資源的平臺(tái)化學(xué)品制造，是解決目前石化資源枯竭和環(huán)境問題的重要措施，對(duì)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本文主要介紹了系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)在有機(jī)酸（琥珀酸、富馬酸、L-蘋果酸、葡萄糖二酸、丙酮酸、苯丙酮酸、α-酮戊二酸）以及其他平臺(tái)化學(xué)品（2,5-呋喃二甲酸）生物制造中的應(yīng)用，并展望了生物制造在平臺(tái)化學(xué)品生產(chǎn)中的未來發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：系統(tǒng)生物學(xué)；合成生物學(xué)；生物催化；生物技術(shù)；平臺(tái)化合物；生物制造

2015-07-01收到初稿，2015-08-16收到修改稿。

聯(lián)系人：陳堅(jiān)。第一作者：袁海波（1991—），男，博士研究生。

Received date: 2015-07-01.

引 言

近年來，隨著人們對(duì)環(huán)境問題的日益關(guān)注以及全球石化資源供給的日趨緊張，生物制造在環(huán)境保護(hù)、生物能源以及生物基材料的開發(fā)等領(lǐng)域正受到人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注[1-3]。生物基材料的開發(fā)是生物制造的一項(xiàng)重要內(nèi)容，它是以可再生的生物質(zhì)資源為原料，利用微生物細(xì)胞或酶的催化功能來生產(chǎn)多種高附加值平臺(tái)化合物，這些化合物可經(jīng)進(jìn)一步加工或者直接使用來生產(chǎn)多種高附加值化工產(chǎn)品[2, 4]。2004年，美國(guó)能源部在一份名為“源自生物基質(zhì)的高附加值化學(xué)品”的報(bào)告中，提出了12種未來最有價(jià)值的平臺(tái)化合物，包括：琥珀酸、2,5-呋喃二甲酸、3-羥基丙酸、谷氨酸、天冬氨酸、葡萄糖二酸、衣康酸、3-羥基丁內(nèi)酯、乙酰丙酸、甘油、山梨醇和木糖醇[5]，圖1所示為該12種重要平臺(tái)化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

圖1 12種重要平臺(tái)化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of 12 top value added bio-based chemicals

圖2 系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)在工業(yè)生產(chǎn)菌株改造中的應(yīng)用Fig.2 Application of systems biology and synthetic biology in strain improvement for industrial products

近年來，系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的快速發(fā)展，為定向改造微生物細(xì)胞生產(chǎn)目標(biāo)化合物提供了有力的分析手段和工具，圖2所示為系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)在工業(yè)生產(chǎn)菌株改造中的應(yīng)用[6]。目前，系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)可以使人們從基因組層面去研究細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)，包括代謝途徑中的關(guān)鍵基因、細(xì)胞代謝的復(fù)雜調(diào)節(jié)機(jī)制以及外界環(huán)境的擾動(dòng)對(duì)細(xì)胞整體代謝的影響，進(jìn)而通過建立代謝模型，評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)可能的代謝工程操作，從而改善細(xì)胞的生理機(jī)能和生產(chǎn)性狀。合成生物學(xué)作為綜合了生物科學(xué)和工程學(xué)的嶄新的研究領(lǐng)域，通過理性設(shè)計(jì)創(chuàng)建生物零件、模塊和系統(tǒng)甚至新物種，實(shí)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)有的天然生物系統(tǒng)進(jìn)行改造和優(yōu)化，或者設(shè)計(jì)新的生物途徑或網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)人工生物系統(tǒng)的構(gòu)建[7]。本文總結(jié)了系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)技術(shù)在生物基平臺(tái)化學(xué)品制造領(lǐng)域的最新應(yīng)用進(jìn)展，并展望了生物制造在平臺(tái)化學(xué)品生產(chǎn)中的未來發(fā)展方向。

1 系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)與有機(jī)酸的生物制造

有機(jī)酸（organic acids）作為一類重要的平臺(tái)化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化工生產(chǎn)等領(lǐng)域。目前，有20多種有機(jī)酸可以采用發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)，有機(jī)酸的發(fā)酵生產(chǎn)行業(yè)已經(jīng)逐漸成為發(fā)酵工業(yè)的重要支柱。

1.1 琥珀酸

琥珀酸又名丁二酸（succinate），是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，廣泛存在于人體、動(dòng)植物以及微生物中[8]。琥珀酸作為一種重要的C4平臺(tái)化合物，可以替代由石油衍生的化學(xué)品來合成己二酸、1,4-丁二醇、γ-丁內(nèi)酯、四氫呋喃等大宗化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯（PBS）等可降解生物材料[9]。

琥珀酸生產(chǎn)菌株種類繁多，目前研究最多的是Actinobacillus succinogenes、Anaerobiosprillum succiniciproducens、Mannheimia succiniciproducens、Corynebacterium glutamicum和重組大腸桿菌[10-12]。由于培養(yǎng)條件相對(duì)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速、遺傳背景和代謝途徑清楚等優(yōu)點(diǎn)，大腸桿菌被廣泛應(yīng)用于琥珀酸的生產(chǎn)[9]。重組大腸桿菌可以通過有氧、厭氧和兩階段發(fā)酵來生產(chǎn)琥珀酸[13-15]。其中，兩階段發(fā)酵過程包括有氧條件下菌體的生長(zhǎng)和厭氧條件下琥珀酸的積累。近年來，隨著琥珀酸生物制造工業(yè)的快速發(fā)展，人們?cè)诖竽c桿菌的代謝途徑改造和發(fā)酵工藝等方面做了大量的研究。尤其是在大腸桿菌的琥珀酸代謝途徑方面，如強(qiáng)化琥珀酸合成途徑、抑制或阻斷琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)途徑或者構(gòu)建琥珀酸有氧生產(chǎn)體系，提高琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度[16]。

1.1.1 強(qiáng)化琥珀酸合成途徑 有氧條件下，對(duì)于野生型大腸桿菌，琥珀酸僅作為三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，不作積累；在厭氧條件下，可以進(jìn)行混合酸發(fā)酵產(chǎn)生少量的琥珀酸（7.8%）[17-18]。在厭氧條件下，葡萄糖先經(jīng)糖酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），然后在PEP羧化酶作用下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸（OAA），進(jìn)而在蘋果酸脫氫酶和富馬酸還原酶的作用下生成琥珀酸（代謝途徑見圖3）。Millard等[19]在大腸桿菌中過表達(dá)了內(nèi)源性基因ppc和pck，結(jié)果表明過表達(dá)ppc可以明顯提高琥珀酸的產(chǎn)量，而過表達(dá)pck對(duì)發(fā)酵結(jié)果沒有顯著影響，但是在ppc缺陷菌株中，過表達(dá)pck可以提高琥珀酸的產(chǎn)量。Liu等[20]通過在敲除了ldhA、pflB和ppc基因的大腸桿菌K12中過表達(dá)pck，額外提供了菌體生長(zhǎng)所需的ATP，顯著提高了生物量和琥珀酸產(chǎn)量。此外，Kwon等[21]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，只有在添加重碳酸鹽的條件下，過表達(dá)PEP羧激酶才能提高琥珀酸產(chǎn)量。Wang等[22]和Goldberg等[23]通過在大腸桿菌中過表達(dá)富馬酸還原酶，可以直接將富馬酸轉(zhuǎn)化為琥珀酸，且轉(zhuǎn)化率達(dá)到93%。

圖3 大腸桿菌中琥珀酸合成途徑Fig.3 Central metabolic pathways related to succincate formation in E. coli

目前，很多研究者通過在大腸桿菌中引入外源的關(guān)鍵酶基因，來提高琥珀酸產(chǎn)量及生產(chǎn)強(qiáng)度。Kim 等[24]通過引入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌Actinobacillus succinogenes的pck基因，使琥珀酸產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了6.5倍，與過表達(dá)內(nèi)源性pck基因相比，效果顯著。Lin等[25]通過引入Sorghum vulgare中的ppc基因以及Lactococcus lactis中的丙酮酸羧化酶基因pyc，琥珀酸的產(chǎn)量大大提高，且乳酸、乙酸含量很低。Sánchez等[15]在大腸桿菌E. coli SBS550MG中引入檸檬酸合成酶基因cs，琥珀酸產(chǎn)量有了明顯提高，琥珀酸對(duì)葡萄糖的得率為1.58 mol·mol-1。Vemuri等[26]在E. coli AFP111中引入了來自菜豆根瘤菌Rhizobium etli的pyc基因，該菌株在雙階段發(fā)酵中琥珀酸產(chǎn)量可以達(dá)到99.2 g·L-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.3 g·L-1·h-1。Yang等[27]在E. coli ZJG13中過表達(dá)了調(diào)控乙醛酸支路的aceKBA基因，結(jié)果表明對(duì)琥珀酸的生產(chǎn)強(qiáng)度影響較小。隨后，Yang等利用計(jì)算機(jī)模擬對(duì)琥珀酸生產(chǎn)途徑中的3個(gè)羧化酶——丙酮酸羧化酶、蘋果酸酶和PEP羧化酶對(duì)琥珀酸產(chǎn)率的影響進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示丙酮酸羧化酶對(duì)琥珀酸產(chǎn)率影響最大，這一結(jié)果在實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。采用補(bǔ)料分批發(fā)酵策略，琥珀酸的產(chǎn)量可以達(dá)到36.1 g·L-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.75 mmol·(g DCW)-1·h-1，是目前已報(bào)道的有氧發(fā)酵中生產(chǎn)強(qiáng)度最大的菌株。

1.1.2 抑制或阻斷琥珀酸競(jìng)爭(zhēng)途徑 要提高琥珀酸產(chǎn)量，就必須減少E. coli中混酸發(fā)酵的副產(chǎn)物，如甲酸、乙酸及少量乳酸等，使代謝流更多流向琥珀酸。Chatterjee等[28]通過抑制E. coli中的磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（PTS），使E. coli的生長(zhǎng)和琥珀酸的產(chǎn)量都有所提高。Lee等[29]通過在基因組范圍內(nèi)比較琥珀酸高效生產(chǎn)菌株M. Succiniciproducens和混合酸發(fā)酵下的E. coli中琥珀酸的中心代謝途徑，通過找出差異基因并對(duì)這些基因進(jìn)行改造以提高E. coli發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的產(chǎn)量。Lee等首先選擇了E. coli中的ptsG，pykF，sdhA，mqo和aceBA 5個(gè)基因，并對(duì)它們進(jìn)行了組合失活，發(fā)現(xiàn)該方法并不能提高琥珀酸的產(chǎn)量。隨后，采用計(jì)算機(jī)模擬分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)敲除E. coli中與丙酮酸生成相關(guān)的3個(gè)酶——ptsG，pykF和pykA可以提高琥珀酸產(chǎn)量，這一結(jié)果在實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。Lin等[13,30]通過構(gòu)建包含TCA循環(huán)氧化支路和乙醛酸循環(huán)的代謝工程菌株，有氧條件下，補(bǔ)料分批發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量可以達(dá)到58.3 g·L-1，得率為0.85 mol·mol-1。Jantama等[14]以E. coli C菌株為基礎(chǔ)，通過敲除一系列與副產(chǎn)物生成相關(guān)的基因，構(gòu)建了菌株E. coli KJ073（ΔldhA ΔadhEΔackAΔfocAΔpflBΔmgsAΔpoxB），在礦物鹽培養(yǎng)基中通過簡(jiǎn)單控制pH分批發(fā)酵，琥珀酸產(chǎn)量可以達(dá)到688 mmol·L-1，琥珀酸對(duì)葡萄糖產(chǎn)率為1.2 mol·mol-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.82 g·L-1·h-1。

目前，利用E. coli生產(chǎn)琥珀酸的突出問題是生產(chǎn)強(qiáng)度相對(duì)于某些瘤胃細(xì)菌還較低[31]。比如M. succiniciproducens的琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度可以達(dá)到25.28 mmol·(g DCW)-1·h-1[32]。隨著系統(tǒng)和合成生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)E. coli的生理代謝和調(diào)控機(jī)制方面的認(rèn)識(shí)也會(huì)越來越清晰，進(jìn)而可以通過定向改造和優(yōu)化琥珀酸表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或者重構(gòu)有潛力的代謝途徑來提高琥珀酸生產(chǎn)強(qiáng)度。

1.2 富馬酸

富馬酸又名延胡索酸（fumaric acid），是一種重要的C4平臺(tái)化合物。富馬酸作為重要的精細(xì)化工產(chǎn)品和有機(jī)化工原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、材料、化工、飼料及食品添加劑等領(lǐng)域[33]。同時(shí)，富馬酸還可以通過酶催化、水合、氨化、加氫等工藝生產(chǎn)L-天冬氨酸、琥珀酸、蘋果酸和1,4-丁二醇等C4化合物[5]。目前，工業(yè)上主要采用化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)富馬酸。其中，化學(xué)合成法主要包括糠醛氧化法和順酐異構(gòu)法。由于化學(xué)合成法面臨著化石資源的短缺和環(huán)境污染等問題，生物轉(zhuǎn)化法成為富馬酸產(chǎn)業(yè)發(fā)展和提升的有力技術(shù)支撐。

富馬酸的生物合成法包括微生物發(fā)酵和酶催化轉(zhuǎn)化法。酶催化轉(zhuǎn)化一般是用馬來酸異構(gòu)酶催化馬來酸生成富馬酸。微生物發(fā)酵法主要是利用根霉菌、釀酒酵母和工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸[33-35]。

真菌是包括富馬酸在內(nèi)的有機(jī)酸生產(chǎn)的主要菌株，其中根霉菌Rhizopus species的富馬酸產(chǎn)生能力較強(qiáng)，由于其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、易培養(yǎng)以及生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，使其成為了主要研究對(duì)象，主要包括少根根霉Rhizopus arrhizus和米根霉Rhizopus oryzae等。Osmani等[36]提出的關(guān)于富馬酸在根霉菌中積累的“胞液途徑”學(xué)說，是目前被認(rèn)同的主流觀點(diǎn)。他們認(rèn)為在少根根霉Rhizopus arrhizus的胞液中存在著TCA還原途徑，丙酮酸羧化酶是該途徑中的關(guān)鍵酶之一，它催化丙酮酸固定CO2生成草酰乙酸，然后草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶和富馬酸酶的作用下生成富馬酸。Kenealy等[37]證實(shí)了該途徑是R. arrhizus中富馬酸生成的主要途徑，而TCA循環(huán)的作用主要是為菌體生長(zhǎng)提供ATP和中間代謝物。Wright等[38]通過14C同位素標(biāo)記得到了葡萄糖的代謝模型，證明了R. oryzae中存在兩個(gè)獨(dú)立的丙酮酸代謝池，一個(gè)位于胞液中用于合成富馬酸、乳酸及乙醇等，另外一個(gè)位于線粒體用于TCA循環(huán)。由于富馬酸酶在胞液途徑富馬酸的生成中的重要作用，Zhang等[39]在米根霉中表達(dá)了富馬酸酶基因fumR，結(jié)果顯示單純過表達(dá)富馬酸酶并不能提高富馬酸產(chǎn)量，因?yàn)楦获R酸酶也可以催化富馬酸生成蘋果酸，因而L-蘋果酸產(chǎn)量反而有所提高。

近年來，研究者們也嘗試采用基因工程手段在釀酒酵母和大腸桿菌中重構(gòu)富馬酸的代謝途徑。Kaclíková等[40]通過對(duì)釀酒酵母中的線粒體富馬酸酶進(jìn)行突變失活，以葡萄糖為底物，富馬酸的產(chǎn)量約為0.5 g·L-1。吳世根等通過在畢赤酵母GS115中過表達(dá)丙酮酸羧化酶胞質(zhì)同工酶，結(jié)果表明該酶的表達(dá)有助于草酰乙酸和L-蘋果酸的積累，富馬酸的產(chǎn)量?jī)H有少量增加。Xu等[34]通過在釀酒酵母中表達(dá)來自米根霉的蘋果酸脫氫酶基因、富馬酸酶基因以及釀酒酵母自身的丙酮酸羧化酶基因，實(shí)現(xiàn)了富馬酸的積累，但是產(chǎn)量?jī)H有3.18 g·L-1。Song等[35]通過敲除大腸桿菌中的異檸檬酸裂解酶調(diào)節(jié)因子基因iclR、富馬酸酶基因fumABC、葡萄糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ⅡCBGlc基因ptsG和天冬氨酸酶基因aspA，并且過表達(dá)了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc，補(bǔ)料分批發(fā)酵63 h后，富馬酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了28.2 g·L-1和0.448 g·L-1·h-1。

1.3 L-蘋果酸

L-蘋果酸（L-malic acid）是生物體中三羧酸循環(huán)及其支路乙醛酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物。作為一種重要的C4化合物，L-蘋果酸被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域[41]。

L-蘋果酸的生物合成法主要有3種：第1種是直接發(fā)酵法，使用霉菌（米曲霉、黃曲霉及寄生曲霉等）以糖類為原料直接發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸；第2種是混合發(fā)酵，首先利用根霉菌將糖類轉(zhuǎn)化為富馬酸，然后再利用酵母將富馬酸轉(zhuǎn)化成L-蘋果酸；第3種是酶催化轉(zhuǎn)化，利用微生物的富馬酸酶直接將富馬酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蘋果酸。已有研究表明，曲霉等微生物生成L-蘋果酸的主要途徑是丙酮酸羧化支路途徑，即丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下固定CO2生成草酰乙酸，然后在蘋果酸脫氫酶作用下生成L-蘋果酸[42-43]。

目前，采用系統(tǒng)生物學(xué)及合成生物學(xué)手段來改造和構(gòu)建L-蘋果酸生產(chǎn)菌株已成為蘋果酸高產(chǎn)菌株育種的主要研究方向。Zhang等[44]在生產(chǎn)琥珀酸的大腸桿菌（KJ060和KJ073）的基礎(chǔ)上敲除了富馬酸還原酶基因frdBC、蘋果酸酶基因sfcA和maeB以及富馬酸同功酶基因fumB和fumAC，構(gòu)建了工程菌XZ658（KJ073?frdBC?sfcA?maeB?fumB?fumAC）。該菌株在雙階段發(fā)酵下，72 h后L-蘋果酸產(chǎn)量可以達(dá)到253 mmol·L-1，糖酸轉(zhuǎn)化率為1.42 mol·mol-1，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.47 g·L-1·h-1。Mu等[45]首次采用合成生物學(xué)手段將大腸桿菌中的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和釀酒酵母中蘋果酸脫氫酶引入到枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis，成功構(gòu)建了一條L-蘋果酸的異源生物合成途徑。該工程菌在進(jìn)一步敲除乳酸脫氫酶基因后，采用兩階段發(fā)酵可以實(shí)現(xiàn)L-蘋果酸的積累，最大產(chǎn)量為(15.65±0.13)mmol·L-1。Zelle等[46]在丙酮酸脫羧酶缺陷型的釀酒酵母中過表達(dá)蘋果酸脫氫酶MDH3的等位基因、內(nèi)源性丙酮酸羧化酶基因和蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SpMAE1，分批培養(yǎng)下，L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到59 g·L-1，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.42 mol·mol-1。Oba等[47]從清酒醪中分離到一株高產(chǎn)蘋果酸的釀酒酵母，通過基因芯片技術(shù)比較該菌株和原始菌株的基因表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸高產(chǎn)菌株中的應(yīng)激反應(yīng)基因如HSP12出現(xiàn)上調(diào)，而硫胺素合成基因THI4和SNZ2出現(xiàn)下調(diào)，此研究為今后代謝改造釀酒酵母生產(chǎn)L-蘋果酸提供了研究方向。

1.4 葡萄糖二酸

葡萄糖二酸（D-glucaric acid, GA）是一種天然存在于櫻桃、柑橘等水果和十字花科蔬菜中的無毒化合物，也少量存在于包括人類的哺乳類動(dòng)物中[48-50]。葡萄糖二酸在糖尿病、癌癥的治療和降低膽固醇方面也有廣泛應(yīng)用[49, 51-52]。葡萄糖二酸及其酯還可作為合成羥基化的尼龍和超支化聚酯的起始單體原料，具有巨大的應(yīng)用潛力[5]。

目前，化學(xué)氧化法是制備葡萄糖二酸的主要方法，通過氧化D-葡萄糖來生產(chǎn)D-葡萄糖二酸，如硝酸氧化和以2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧化物（TEMPO）為介導(dǎo)的氧化[53-55]。微生物發(fā)酵法作為一種更為經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的方法越來越受到研究者的青睞。

葡萄糖二酸作為哺乳動(dòng)物體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物，以葡萄糖為底物需要經(jīng)過10步以上的反應(yīng)才可以得到[49]。Marsh[56]用小鼠腺體中提取純化的葡萄糖醛酸酶，以葡萄糖醛酸為底物，在Fe2+和H2O2存在的條件下，可以得到葡萄糖二酸。目前，并沒有微生物存在從葡萄糖到葡萄糖二酸的完整的天然合成途徑的報(bào)道。

Moon等[57]首次用合成生物學(xué)的方法在E. coli中構(gòu)建了一條葡萄糖二酸的合成途徑，成功實(shí)現(xiàn)了由葡萄糖到葡萄糖二酸的生物制備。研究者通過在E. coli中共表達(dá)了3個(gè)外源基因——釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae的肌醇-1-磷酸合成酶基因Ino1，小鼠的肌醇氧化酶基因MIOX以及丁香假單胞菌Pseudomonas syringae中的糖醛酸脫氫酶基因Udh，構(gòu)建了一條葡萄糖二酸的生物合成途徑。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該途徑中催化肌醇轉(zhuǎn)化為葡萄糖醛酸的MIOX是限速酶，其活性受到底物肌醇濃度的直接影響。為了增大肌醇的有效濃度，從而提高葡萄糖二酸的產(chǎn)量，Moon等[58]依據(jù)蛋白之間的相互作用構(gòu)建了多肽支架，將途徑中的3種酶組成蛋白復(fù)合體，提高了物質(zhì)流的利用效率，使葡萄糖二酸的產(chǎn)量提高了5倍，達(dá)到2.5 g·L-1。隨后，Shiue 等[59]通過在MIOX的N端融合表達(dá)了SUMO（小泛素相關(guān)修飾物）標(biāo)簽以及提高肌醇的轉(zhuǎn)運(yùn)速率，以肌醇為底物，使葡萄糖二酸的產(chǎn)量提高至4.85 g·L-1。Shiue等在研究中發(fā)現(xiàn)，以肌醇為底物生產(chǎn)葡萄糖二酸時(shí)，存在產(chǎn)物抑制現(xiàn)象，葡萄糖二酸的產(chǎn)量無法超過5 g·L-1，這種現(xiàn)象可能是由于產(chǎn)物葡萄糖二酸的積累導(dǎo)致體系pH過低，從而引起細(xì)胞正常的生理和代謝機(jī)能發(fā)生變化[59-60]。Konishi 等[61]通過使用不同來源的Ino1、MIOX和Udh在大腸桿菌中構(gòu)建了葡萄糖二酸的合成途徑，添加并且強(qiáng)化了Ino1，通過控制培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度和采取補(bǔ)料分批發(fā)酵策略，葡萄糖二酸的產(chǎn)量可以達(dá)到73 g·L-1。

1.5 丙酮酸

丙酮酸（pyruvate）是生物體中重要的中間代謝產(chǎn)物，被廣泛應(yīng)用于制藥、化工、農(nóng)用化學(xué)品和保健品等行業(yè)。目前，丙酮酸的化學(xué)合成法主要有酒石酸法、乳酸催化氧化法、羥基丙酮法和電化學(xué)法等；生物合成法主要包括生物催化轉(zhuǎn)化法和直接發(fā)酵法。

早在20世紀(jì)50年代，就有學(xué)者對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮酸開始了研究。1989年，日本學(xué)者M(jìn)iyata和Yonehara選育出了多種丙酮酸產(chǎn)量可以超過50 g·L-1的球擬酵母（Torulopsis）。其中，光滑球擬酵母Torulopsis glabrata是工業(yè)化生產(chǎn)上也是目前研究較多的菌株。丙酮酸作為糖酵解的最終產(chǎn)物，處于生物體內(nèi)代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，很容易代謝生成其他產(chǎn)物，不易積累。要實(shí)現(xiàn)丙酮酸的大量積累，就需要弱化或切斷丙酮酸的進(jìn)一步代謝。日本學(xué)者Yonehara和Yokota分別對(duì)多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型球擬酵母和能量代謝有缺陷的大腸桿菌進(jìn)行了研究，獲得了一株丙酮酸生產(chǎn)能力良好的多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型T. glabrata IFO0005，正常培養(yǎng)條件下，丙酮酸對(duì)葡萄糖的產(chǎn)率為0.41 g·g-1。對(duì)該菌株通過誘變處理后，增加了一系列遺傳標(biāo)記（如L-精氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型、L-異亮氨酸和L-纈氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型等），其丙酮酸產(chǎn)率可以達(dá)到0.54 g·g-1。李寅等[62]考察了T. glabrata WSH-IP303菌株在葡萄糖為碳源、氯化銨為唯一氮源的培養(yǎng)基中，不同維生素對(duì)丙酮酸產(chǎn)量的影響，分批發(fā)酵57.5 h后，丙酮酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率分別達(dá)到了69.4 g·L-1和0.593 g·g-1。丙酮酸在多重維生素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株T. glabrata中的積累，被認(rèn)為是由于以硫胺素為輔因子的丙酮酸脫氫酶系PDH受損，導(dǎo)致丙酮酸氧化脫羧減少造成的。

除了篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株用于丙酮酸的生產(chǎn)外，借助生化工程方法和代謝工程策略，綜合運(yùn)用定量PCR（qPCR）、表達(dá)譜芯片、代謝物分析和關(guān)鍵酶活性分析等系統(tǒng)生物學(xué)手段來研究胞內(nèi)NADH和ATP的代謝控制方式，也是提高T. glabrata丙酮酸生產(chǎn)效率的有效手段。Hua等通過代謝分析研究了不同溶氧濃度對(duì)丙酮酸發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)不同溶氧水平對(duì)能量代謝和關(guān)鍵代謝途徑的影響是不同的。當(dāng)溶氧為30%～40%時(shí)，丙酮酸的產(chǎn)率提高了15%，且副產(chǎn)物乙醇的生成量減少。Li等[63]通過考察分批發(fā)酵中不同的體積溶氧系數(shù)對(duì)丙酮酸發(fā)酵的影響，結(jié)果表明分階段控氧比恒定KLa的丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度有大幅度提高。通過代謝分析可知，抑制氧化磷酸化途徑中ATP的生成是提高丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度的有效措施。劉立明等[64-65]通過選育T. glabrata的呼吸缺陷型突變株，削弱了氧化磷酸化的活性，提高了糖酵解速度，丙酮酸的生產(chǎn)強(qiáng)度也得到提高。由于細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+的水平也會(huì)直接影響ATP的水平，劉立明等通過加入電子傳遞鏈抑制劑（抗霉素A和魚藤酮）和FoF1-ATPase抑制劑（寡霉素）或選育新霉素抗性菌株，達(dá)到了提高丙酮酸產(chǎn)量的目的。此外，Liu等[66]用高滲透條件篩選到一株可以耐受70 g·L-1NaCl的菌株T. glabrata RS23。此菌株以葡萄糖為碳源，丙酮酸產(chǎn)量和產(chǎn)率可以達(dá)到94.3 g·L-1和0.635 g·g-1。Wang 等[67]通過DNA重組技術(shù)敲除了T. glabrata中的丙酮酸脫羧酶PDC，減少了發(fā)酵過程中副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生，丙酮酸產(chǎn)量可以達(dá)到82.2 g·L-1。Zeli?等[68]構(gòu)建了一株重組大腸桿菌E. coli YYC202 ldhA::Kan，該菌株喪失了丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A、醋酸和乳酸的能力，利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸產(chǎn)率可以達(dá)到0.54 g·g-1。

1.6 α-苯丙酮酸

α-苯丙酮酸（phenylpyruvic acid, PPA）是一種雙羰基化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工生產(chǎn)等領(lǐng)域[69]。PPA是合成D-苯丙氨酸的前體，而D-苯丙氨酸可以用來生產(chǎn)手性藥物和食品添加劑[70]。此外，PPA還可以用來生產(chǎn)苯乳酸和阿斯巴甜等。

目前，PPA的生產(chǎn)主要是化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)法主要有海因法、雙羰基化法和α-乙酰氨基肉桂酸水解法等。相對(duì)于化學(xué)合成法，生物轉(zhuǎn)化法具有環(huán)境污染小、生產(chǎn)成本低以及產(chǎn)物安全性高等優(yōu)點(diǎn)，正受到人們的廣泛關(guān)注。

PPA的生物轉(zhuǎn)化法主要包括微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。但是由于發(fā)酵法的PPA產(chǎn)量較低（1.05 g·L-1），因此目前研究較多的是酶轉(zhuǎn)化法[71]。酶轉(zhuǎn)化法是通過L/D-氨基酸脫氨酶（LAAO/DAAO）催化L/D-苯丙氨酸脫氨基生成。但是由于D-苯丙氨酸價(jià)格較高以及DAAO催化過程產(chǎn)生的雙氧水對(duì)轉(zhuǎn)化的不利影響，因此目前主要采用非雙氧水生成型的LAAO進(jìn)行PPA的生產(chǎn)。LAAO廣泛存在于蛇毒、真菌、細(xì)菌、藻類及動(dòng)物中。其中，來源于普通變形桿菌Proteus vulgaris、奇異變形桿菌Proteus mirabilis、雷特格氏變形桿菌Proteus rettgeri、魔氏變形桿菌Proteus morganii以及普羅維登斯菌屬Providence的菌株因具有苯丙氨酸脫氨酶而被廣泛研究[72]。

有研究者在E. coli BL21（DE3）中表達(dá)了來源于P. mirabilis KCTC2566的脫氨酶基因pma，在最優(yōu)條件下，以濃度為14 g·L-1的L-苯丙氨酸為底物，PPA的產(chǎn)量可以達(dá)到6.2 g·L-1，轉(zhuǎn)化率為44.6%。隨后，利用易錯(cuò)PCR對(duì)該脫氨酶進(jìn)行定向進(jìn)化并且敲除了E. coli中與L-苯丙氨酸進(jìn)一步代謝有關(guān)的基因，最終PPA的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了11.5 g·L-1和82%[73]。

1.7 α-酮戊二酸

α-酮戊二酸（α-ketoglutarate, α-KG）作為三羧酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）中重要的中間代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)氨基酸、糖類以及脂肪代謝等多種代謝過程。因此，α-酮戊二酸被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療以及化工生產(chǎn)等領(lǐng)域[74]。目前，工業(yè)上生產(chǎn)α-酮戊二酸主要采用的是化學(xué)合成法，但是化學(xué)合成過程中使用的氰化物和重金屬離子等有毒試劑，限制了α-酮戊二酸在食品和醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，生物法成為了生產(chǎn)α-酮戊二酸的最佳選擇。

目前，人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種可以過量積累α-KG的微生物，包括多種原核微生物和真核微生物[75-77]。由于真核微生物相對(duì)于原核微生物來說，能耐受更低的pH條件，更適合發(fā)酵生產(chǎn)短鏈有機(jī)酸[78]，因此目前研究的生產(chǎn)α-KG的菌株多以真核微生物為主。其中，解脂亞洛酵母Yarrowia lipolytica因其生長(zhǎng)迅速、生理特征清晰、底物譜寬和安全性等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視[79]。

由于α-KG在三羧酸循環(huán)中處于關(guān)鍵位置，并且連接著碳-氮代謝，參與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控過程，因此采取基于代謝組學(xué)的系統(tǒng)生物學(xué)手段對(duì)微生物積累α-KG的過程進(jìn)行系統(tǒng)分析，對(duì)于揭示微生物的代謝機(jī)理和實(shí)現(xiàn)α-KG的過量積累具有重要的意義。α-KG生產(chǎn)菌株在積累α-KG的過程中，存在兩個(gè)重要的代謝節(jié)點(diǎn)：一是丙酮酸在丙酮酸脫氫酶系PDHC作用下生成乙酰輔酶A，然后進(jìn)入TCA循環(huán)；二是α-酮戊二酸脫氫酶系KGDH催化的α-KG的進(jìn)一步代謝。硫胺素作為PDHC和KGDH的輔因子，是α-KG積累的關(guān)鍵因素。Chernyavskaya等[80]對(duì)硫胺素營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株Y. lipolytica N1在不同硫胺素濃度、氮源、pH和溶氧下α-KG的產(chǎn)量進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示亞適量硫胺素和過量氮源是積累α-KG的必要條件，在最佳條件下α-KG的產(chǎn)量可以達(dá)到49.0 g·L-1，對(duì)乙醇產(chǎn)率為42%。緊接著，Il’chenko等[81]對(duì)Y. lipolytica N1菌株中心代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示在積累α-KG階段，KGDH和檸檬酸合酶活性較低，而依賴于NADPH的異檸檬酸脫氫酶具有較高活性。為了提高α-KG的產(chǎn)量，基于增大流向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流和減弱目標(biāo)產(chǎn)物的進(jìn)一步代謝的代謝工程改造是較為有效的手段。為了增大流向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流，F(xiàn)oerster等[82]在Y. lipolytica H222中過表達(dá)了異檸檬酸裂解酶ICL1，實(shí)現(xiàn)了菌體在總產(chǎn)酸不變的情況下，異檸檬酸占總酸比例的顯著下降。隨后，Holz等[83]通過表達(dá)順烏頭酸酶ACO1，使異檸檬酸占總酸的比例由35%～49%提高到66%～71%。Yin等[84]在Y. lipolytica WSH-Z06中分別過表達(dá)了來自釀酒酵母和米根霉的丙酮酸羧化酶PYC，重組菌株的α-KG產(chǎn)量分別提高了24.5%和35.3%，在3 L發(fā)酵罐上的產(chǎn)量可以達(dá)到69.2 g·L-1。此外，通過削弱α-KG的進(jìn)一步代謝是提高α-KG產(chǎn)量的另一策略。Verseck等敲除了C. glutmicum菌株的谷氨酸脫氫酶基因gdh，使得α-KG在發(fā)酵液中的濃度達(dá)到5 g·L-1。Holz 等[85]在研究KGDH對(duì)Y. lipolytica的產(chǎn)酸影響時(shí)，利用生物信息學(xué)技術(shù)，將Y. lipolytica與S. cerevisiae 中KGDH的3個(gè)基因（ScKGD1，KGD2，LPD1）進(jìn)行了比較分析，找到了Y. lipolytica中的3個(gè)相應(yīng)基因YlKGD1，YlKGD2和YlLPD1，并將這3個(gè)基因在Y. lipolytica中進(jìn)行過量表達(dá)。發(fā)酵結(jié)果顯示，α-KG的產(chǎn)量從原始菌中的97 g·L-1下降到重組菌中的72 g·L-1，而丙酮酸含量有所提高。

雖然在微生物代謝生產(chǎn)α-KG的機(jī)制及代謝工程改造方面已經(jīng)取得一定成果，但是依然存在著過量積累α-KG機(jī)制不清楚以及代謝副產(chǎn)物過多等問題。

1.8 2,5-呋喃二甲酸

2,5-呋喃二甲酸（2,5-furandicarboxylic acid, FDCA）作為一種重要的化工原料及有機(jī)合成中間體，廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、抗菌劑和高分子材料的合成中[86-87]。此外，由于2,5-呋喃二甲酸的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與對(duì)苯二甲酸相似，可以作為其替代品用于聚酯類材料的制造[88-90]。

2,5-呋喃二甲酸可以由5-羥甲基糠醛（HMF）氧化生成，而5-羥甲基糠醛可以由葡萄糖或果糖脫水而成。目前，對(duì)于FDCA的生產(chǎn)，主要是化學(xué)合成法。FDCA的化學(xué)合成需要高壓、高溫、有機(jī)溶劑和金屬離子催化，致使整個(gè)生產(chǎn)工藝高成本和高污染，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用[91-93]。與化學(xué)催化不同的是，生物（酶或全細(xì)胞）催化可以在相對(duì)溫和的條件下進(jìn)行，可以顯著降低生產(chǎn)成本和有害物質(zhì)的排放[94]。然而，目前用生物催化法生產(chǎn)FDCA的研究還處于初始階段，已報(bào)到的文獻(xiàn)中只有極少的酶可以氧化HMF生成FDCA。其中來源于Caldariomyces fumago的氯過氧化物酶可以氧化HMF，生成74%的2,5-呋喃二甲醛和20%的5-羥甲基-2-呋喃甲酸，但是不能生成FDCA[95]。近年來，Koopman等[96]通過轉(zhuǎn)座子突變篩選鑒定出了貪銅菌Cupriavidus basilensis HMF14中的HMF和呋喃甲醛的代謝途徑，證實(shí)了5-羥甲基糠醛氧化還原酶（HmfH）可以將5-羥甲基糠醛氧化為2,5-呋喃二甲酸。隨后，Koopman等[97]在惡臭假單胞菌Pseudomonas putida S12中異源表達(dá)了HmfH，以甘油為碳源，補(bǔ)料分批培養(yǎng)，可以得到30.1 g·L-1的FDCA，產(chǎn)率為97%。該惡臭假單胞菌Pseudomonas putida S12自身只能催化HMF生成5-羥甲基-2-呋喃甲酸，只有表達(dá)了來源于貪銅菌Cupriavidus basilensis HMF14中的HmfH基因后，才可以催化HMF生成FDCA。隨后，Dijkman等[98-99]在大腸桿菌中表達(dá)了來源于甲基營(yíng)養(yǎng)菌Methylovorus sp. strain MP688的5-羥甲基糠醛氧化酶（HMFO），該酶不僅可以將HMF氧化為FDCA，而且還可以氧化芳香族醇類和醛類物質(zhì)，該酶可以在24 h內(nèi)將95%的HMF轉(zhuǎn)化為FDCA。

雖然人們對(duì)5-羥甲基糠醛氧化酶研究還處于起始階段，但生物催化仍是未來2,5-呋喃二甲酸生產(chǎn)的重要研究方向。

2 展 望

系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)的飛速發(fā)展，為理性改造微生物提供了技術(shù)手段。系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展使人們能夠從整體水平上來理解和把握微生物的生理、代謝和功能，有助于識(shí)別代謝途徑中的關(guān)鍵靶基因，從而對(duì)其進(jìn)行代謝工程操作。另外，關(guān)于目標(biāo)代謝途徑和表達(dá)宿主的系統(tǒng)生物學(xué)研究也為合成生物學(xué)的開展提供了重要的參考。

生物制造離不開生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，即利用微生物細(xì)胞或酶將底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物的過程。微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)在平臺(tái)化學(xué)品如葡糖糖二酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等有機(jī)酸的生產(chǎn)中已展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。盡管我國(guó)在有機(jī)酸制造工業(yè)取得了顯著成績(jī)，但是總體技術(shù)仍低于國(guó)際同期水平，特別是在轉(zhuǎn)化率、物耗和能耗以及產(chǎn)品質(zhì)量等產(chǎn)業(yè)化指標(biāo)方面仍明顯落后于國(guó)際先進(jìn)水平。因此，通過系統(tǒng)改造微生物代謝過程，構(gòu)建高效的生物合成途徑，是提高微生物轉(zhuǎn)化水平的重要途徑，也是推動(dòng)生物制造業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要舉措。

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Foundation item: supported by the National Basic Research Program of China (2012CB720802, 2013CB733602) and the National Natural Science Foundation of China (21390204).

Advances in production of important platform chemicals by bio-manufacturing based on systems biology and synthetic biology

YUAN Haibo, LI Jianghua, LIU Long, DU Guocheng, CHEN Jian
(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Abstract:Due to the limited amount of fossil fuels and global warming problem, bio-manufacturing based on renewable biomass has been paid more attention. In this review, the contribution of systems biology and synthetic biology in bio-manufacture of platform chemicals like organic acid such as succinate, fumarate, malate, glucaric acid, pyruvate, phenylpyruvic acid, α-ketoglutarate and other platform chemicals such as 2,5-furandicarboxylic acid are reviewed. Finally, the trends of bio-manufacture for platform chemical are prospected.

Key words：systems biology；synthetic biology；biocatalysis；biotechnology；platform chemical；bio-manufacture

Corresponding author:Prof. CHEN Jian, jchen@jiangnan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012CB720802，2013CB733602）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21390204）。

中圖分類號(hào)：Q 815

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0438—1157（2016）01—0129—11

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151042