改進的雙波長法測定二元混合體系中葡萄糖和木糖含量

朱 捷，葛奉娟，王欲曉

(徐州工程學院化學化工學院，江蘇徐州 221111)

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改進的雙波長法測定二元混合體系中葡萄糖和木糖含量

朱 捷，葛奉娟，王欲曉

(徐州工程學院化學化工學院，江蘇徐州 221111)

摘要[目的]采用改進的雙波長法測定混合糖液中葡萄糖和木糖含量。[方法]采用分光光度法(Douglas法)對標準糖溶液的糖含量進行了測定，并對傳統(tǒng)的雙波長法的波長選擇和標準曲線擬合進行了改進：通過誤差分析確定測定波長，對木糖顯色反應在550 nm處的標準曲線進行二次方程擬合，使其更適于低濃度木糖的檢測。[結(jié)果]該方法可同時測定混合體系中葡萄糖和木糖的含量，總糖、木糖和葡萄糖測定的回收率均為94.00%~101.60%，準確度較高。[結(jié)論]該方法能滿足植物纖維水解液中糖含量的常規(guī)分析要求。

關鍵詞總糖；葡萄糖；木糖；雙波長分光光度法

Detection of Glucose and Xylose in Duplex Mixture by Improved Dual-wavelength Spectrophotometry

ZHU Jie, GE Feng-juan, WANG Yu-xiao(School of Chemistry and Chemical Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou, Jiangsu 221111)

Abstract[Objective] To detect the accharide contents of glucose and xylose in duplex mixture by improved dual-wavelength spectrophotometry. [Method] Saccharide content in standard solution was detected by spectrophotometry (Douglas method). The wavelength selection and standard curve fitting were improved in traditional dual-wavelength method: Detection wavelength was detected by error analysis. Quadratic equation fitting of standard curve was carried out at 550 nm, which was more suitable for the detection of low-concentration xylose. [Result] This method could simultaneously detect the glucose and xylose contents in the mixed system. The recovery rates of total sugar, xylose and glucose were all between 94.00% and 101.60%, which had relatively high accuracy. [Conclusion] This method meets the demand of saccharide determination for plant fiber hydrolysis.

Key wordsTotal sugars; Glucose; Xylose; Dual-wavelength spectrophotometry

生化法生產(chǎn)纖維乙醇，也稱第2代燃料乙醇，主要是利用木質(zhì)纖維素原料中的各種糖組分經(jīng)微生物發(fā)酵生產(chǎn)[1-4]。木質(zhì)纖維素原料水解液中糖組分非常復雜，既含有戊糖(主要是木糖)又含有己糖(主要是葡萄糖)，它們的存在既有單體也有寡聚形式[5]。大多數(shù)天然發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的微生物(如酵母菌和運動發(fā)酵細菌)只能利用葡萄糖單糖[6]。最近研發(fā)的基因工程菌可以利用戊糖(如木糖)和阿拉伯糖的單糖，有的可以利用纖維二糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇[7]。因此，對木質(zhì)纖維素原料水解液中葡萄糖和木糖含量的測定非常重要。

常見的研究定量分析方法有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、分光光度法(比色法)、滴定法[8-14]。高效液相色譜法的優(yōu)點是水解液中的混合糖組分都能定量分析(主要是葡萄糖和木糖)，但是此方法所用設備昂貴，分析操作和維護的成本都較高。氣相色譜法也可以定量分析水解液中的混合糖組分，但需要衍生化，分析時間也較長。滴定法操作簡單，成本低，但該方法的選擇性較差，無法區(qū)分出混合組分中戊糖和己糖。

分光光度法是實驗室分析糖組分的常用方法，而地衣酚-鹽酸法利用戊糖與濃鹽酸共熱時降解轉(zhuǎn)變?yōu)榭啡?，后者與3，5-二羥基甲苯(地衣酚)反應呈鮮綠色，采用比色法測定，可用于測定戊糖含量[15]；苯酚硫酸法利用濃硫酸將糖迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再采用比色法測定，可用于分析總糖含量[16]；DNS法，即二硝基水楊酸法，是利用堿性條件下二硝基水楊酸(DNS)與還原糖發(fā)生氧化還原反應，生成3-氨基-5-硝基水楊酸，該產(chǎn)物在煮沸條件下顯現(xiàn)棕紅色，可以分析總還原糖含量[17]。但是，苯酚硫酸法和DNS法對己糖和戊糖的選擇性不高，不能分別測定二者的濃度。地衣酚-鹽酸法對己糖的響應極弱，是一種測定戊糖濃度的好方法，但無法測定己糖的濃度。植物纖維水解液中，戊糖以木糖為主，而己糖以葡萄糖為主。筆者選擇Douglas法(間苯三酚-冰醋酸顯色法)，并采用改進的雙波長法同時測定混合糖液中木糖和葡萄糖的含量。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

1.1.1儀器。751型紫外-可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；水浴鍋；電子天平；磁力加熱攪拌器。

1.1.2試劑。間苯三酚；冰醋酸；無水乙醇；濃鹽酸；葡萄糖；木糖。

1.2標準溶液的配制分別配制不同濃度的木糖和葡萄糖溶液，木糖濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L，葡萄糖濃度分別為1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mmol/L。

1.3顯色反應按照陳鈞輝[17]的方法配制顯色液。移取1 mL 1 mmol/L或2 mmol/L的木糖或葡萄糖標準溶液于試管中，加入10 mL顯色液并搖勻，立即放入沸水浴中反應，10 min后取出試管，用流水冷卻至室溫，5 min后在分光光度計上進行全波長掃描。以空白樣進行相同的顯色反應，作為參比。確定測定波長后，移取1 mL標準溶液或待測溶液，按照上述步驟進行顯色反應，在測定波長下測定其吸光度。

1.4測定波長的選擇雙波長法即測定2個波長下的吸光度，同時測出葡萄糖和木糖的濃度。其中，第1個測定波長通常選擇木糖的最大吸收波長550 nm，而第2個測定波長的選擇的方法并不統(tǒng)一[18-19]。因此，雙波長法的本質(zhì)是求解以下的二元方程組：

ε1c1+ε1′c2=A1

(1)

ε2c1+ε2′c2=A2

(2)

式中，c1和c2分別為木糖和葡萄糖的摩爾濃度，ε1和ε1′分別為木糖和葡萄糖在波長1時的摩爾吸光系數(shù)，ε2和ε2′分別為木糖和葡萄糖在波長2時的摩爾吸光系數(shù)，A1和A2分別為樣品在波長1和波長2時的吸光度。這個方程組的求解并不復雜，因此對計算的簡化并不是考慮的主要因素，應從誤差分析上來考慮波長的選擇。當吸光度的測量值因系統(tǒng)誤差偏離了理論值ΔA(如0.001)時，測得的c1和c2的相對誤差應盡可能小。

假定波長1為550 nm，假定葡萄糖在550 nm處的摩爾吸光系數(shù)ε1′近似為零(當葡萄糖濃度不是遠大于木糖濃度時，此種近似是合理的)，則A1、A2的測定誤差與c1的關系式為：

(3)

(4)

這說明木糖濃度的測定值與波長2的選擇無關，僅僅與波長1(550nm)下吸光度A1測定的準確度有關。

A1、A2的測定誤差與c2的關系式為：

(5)

(6)

葡萄糖濃度的測定誤差除了與A1、A2的測定準確度有關外，還與葡萄糖的濃度以及2種糖在波長2時的吸光系數(shù)有關。樣品中葡萄糖濃度越小，A1和A2對葡萄糖濃度測定結(jié)果的影響就越大，這由混糖樣品(或水解液)本身的性質(zhì)決定。然而，吸光系數(shù)則可以通過選擇波長來達到預期誤差最小的目的。最理想的波長選擇是使得ε2/ε2′和1/ε2′同時達到最小。因此,通對葡萄糖和木糖溶液在不同波長下顯色反應的吸光度進行了誤差分析，并選擇了最佳的第二波長。

1.5標準曲線的繪制以糖濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，按直線或二次曲線規(guī)則擬合出標準曲線，并根據(jù)標準曲線計算出待測樣品的糖濃度。

1.6回收率的計算分別測定3份混合糖樣品(樣品1：木糖5mmol/L，葡萄糖1mmol/L；樣品2：木糖1mmol/L，葡萄糖5mmol/L；樣品3：木糖0.5mmol/L，葡萄糖2.5mmol/L)的糖濃度，并按照以下公式計算回收率：回收率(%) = 實測糖濃度/理論糖濃度×100。

2結(jié)果與分析

2.1雙波長法第二波長的確定從圖1可以看出，在550nm處木糖的吸收達到最大值，同時在550nm處葡萄糖的吸收幾乎為零，因此選擇550nm作為雙波長法測定的第一波長。最理想的第二波長選擇使得ε2/ε2′和1/ε2′同時達到最小。因為ε2/ε1小于1，所以A2的誤差對葡萄糖濃度c2的影響更為明顯。由表1可知，在405nm處ε2/ε2′達到最小值，在400nm處1/ε2′達到最小值。因此，選擇400nm為雙波長法測定的第二波長。

注：1.木糖濃度為1 mmol/L；2.木糖濃度為2 mmol/L；3.葡萄糖濃度為1 mmol/L;4.葡萄糖濃度為2 mmol/L?！ote：1. 1 mmol/L xylose; 2. 2 mmol/L xylose; 3. 1 mmol/L glucose 1; 4. 2 mmol/L glucose. 圖1　不同濃度的葡萄糖和木糖溶液的顯色反應光譜 Fig. 1　Spectra of glucose and xylose solutions at various concentrations

Table 1The values of ε2/ε2′ and 1/ε2′ within the wavelength of 390-420 nm

波長Wavelengthnmε2/ε2'濃度為1mmol/L濃度為2mmol/L1/ε2'濃度為1mmol/L濃度為2mmol/L3900.6670.57513.88912.5003950.6570.58214.28612.6584000.6450.58013.15812.3464050.6220.57113.51412.9874100.6380.59614.49313.6994150.7780.67718.51915.7484200.9360.88221.27721.505

此外，標準曲線的方程為A=εc+b，當截距b較大時不可忽略，因此式(1)和(2)在更精確測定時應更正為：

ε1c1+b1+ε1′c2+b1′=A1

(7)

ε2c1+b2+ε2′c2+b2′=A2

(8)

然而，這并不會影響波長選擇的結(jié)果。

2.2標準曲線木糖和葡萄糖在400和550 nm處的標準曲線方程分別為：y=0.044 6x和y=0.211 4x+0.223 4；葡萄糖在400和550 nm處的標準曲線方程分別為：y=0.068 4x-0.003 4和y=0.003 9x-0.003 5。

其中，木糖在400 nm處的標準曲線以及葡萄糖在400和550 nm處標準曲線的截距很小，可以忽略不計。但是，木糖在550 nm處的標準曲線有很大的截距。這也說明用式(7)替換式(1)是必要的。

當擬合直線關系時，R2約為0.99。從圖2可以看出，標準曲線的截距較大，在測量低濃度的木糖樣品時(濃度小于 1 mmol/L)會造成很大的誤差。同時，高濃度時試驗點向低值偏移。從圖3可以看出，用二次函數(shù)得到擬合曲線的R2達到0.999 5，且截距明顯減小。

2.3方法的精度和準確率評價從表2可以看出，在木糖濃度不太低時，樣品濃度的測定結(jié)果令人滿意，回收率為94%~102%。但當木糖的濃度低至0.5 mmol/L時，測定結(jié)果出現(xiàn)明顯偏差，說明該方法不適于低濃度木糖的測定(小于1 mmol/L)。

圖2　木糖的標準曲線(一次曲線)Fig.2　The standard curve of xylose (linear curve)

圖3　木糖的標準曲線(二次曲線)Fig.3　Standard curve of xylose (quadratic curve)

樣品編號Samplecode總糖Totalsaccharide理論濃度Theoreticalconcentrationmmol/L實測濃度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%木糖Xylose理論濃度Theoreticalconcentrationmmol/L實測濃度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%葡萄糖Glucose理論濃度Theoreticalconcentrationmmol/L實測濃度Measuredconcentrationmmol/L回收率Recoveryrate∥%16.006.04100.675.005.10102.001.000.9494.0026.005.9699.333.002.9698.673.003.00100.0033.002.8996.330.500.1428.002.502.75110.00

注： 木糖在550 nm處的顯色反應標準曲線選取一次標準曲線。

Note：Linear standard curve was selected for the standard curve of xylose chromogenic reaction at 550 nm.

用木糖在550 nm處的二次標準曲線，重新計算了3種混糖樣品的濃度。由表3可知，當木糖濃度較大時，用一次標準曲線測定的回收率較好，而當木糖濃度較低時二次標準曲線對總糖、木糖和葡萄糖的回收率分別為96.7%、96.0%和96.8%，明顯好于一次標準曲線。

忽略葡萄糖顯色反應在550 nm的吸光度，樣品1、2使用木糖的一次標準曲線，樣品3使用木糖的二次標準曲線，計算回收率。由表4可知，即使在葡萄糖濃度為木糖5倍的情況下，對測定結(jié)果的影響依然是很小的。

用該方法測定了稻桿的硫酸和鹽酸的水解液，并進行了加標回收率試驗。前者加入2 mmol/L的葡萄糖溶液，后者加入2 mmol/L的木糖溶液。由表5可知，該方法對加標樣品的測定有較高的準確度，可用于植物纖維水解液的糖含量測定。

表3　回收率的測定結(jié)果(2)

注：木糖在550 nm處的顯色反應標準曲線選取二次標準曲線。

Note：Quadratic standard curve was selected for the standard curve of xylose chromogenic reaction at 550 nm.

表4　回收率的測定結(jié)果(3)

注：測定中忽略葡萄糖顯色反應在550 nm處的吸收。

Note：Absorption at 550 nm was neglected in glucose color reaction.

表5　樣品加標回收率的測定結(jié)果

3結(jié)論

筆者采用改進的雙波長法測定了混糖溶液中木糖和葡萄糖的含量，并對方法的回收率進行了測定，得出以下結(jié)論：①選擇550和400 nm作為測定波長，可以使測定誤差盡可能小； ②對于木糖在550 nm處標準曲線的擬合，選擇二次方程擬合標準曲線有更寬的適用范圍，尤其適合測定木糖濃度較低的溶液；③葡萄糖顯色反應在550 nm處的吸光度要遠小于木糖，除非混糖溶液中葡萄糖的濃度遠大于木糖，不必考慮葡萄糖在550 nm處的吸收；④在合適的木糖標準曲線選擇下，中配制的幾種混糖樣品的總糖、木糖和葡萄糖測定的回收率均為94.00%~101.60%，對加標樣品的測定也有較高的準確度，說明該方法可以實現(xiàn)對總糖、木糖和葡萄糖含量的準確測定。

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收稿日期2015-12-07

作者簡介朱捷(1979- )，男，江蘇徐州人，講師，博士，從事農(nóng)作物廢棄物的有效利用方面研究。

基金項目江蘇省高校自然科學基金項目(12KJD530002)。

中圖分類號O 657.3

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-009-04