桃仁紅花煎通過抑制淋巴管增生改善ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的炎癥反應

王怡茹， 張一凡， 韋婧， 劉萍*

(1.上海中醫(yī)藥大學 附屬龍華醫(yī)院 心病科， 上海 200032； 2.上海徐匯區(qū)中心醫(yī)院 中醫(yī)科， 上海 200031)

流行病學調(diào)查顯示心血管疾病在20歲以上人群中的患病率為48%，是全球主要死亡原因之一[1-2].動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是誘發(fā)大多數(shù)心腦血管疾病的重要病理基礎[3]，與AS相關的心腦血管疾病發(fā)病率持續(xù)上升且呈年輕化趨勢[4].因此，積極探索AS病理機制和有效治療方案具有重要臨床意義.AS與自身免疫的關系由Ross[5]首次提出：動脈粥樣硬化病變是由于血管內(nèi)皮和平滑肌細胞等各種因素損傷而產(chǎn)生的過度化炎癥性-纖維增殖性反應.炎癥反應是AS重要的病理機制之一，不同的分子和細胞實驗證實炎癥反應貫穿AS病理進程的始末[6-7]，為其發(fā)病機制提供全新闡釋[8].但是在AS的相關指南和實際臨床治療方案中主要以降低血脂和穩(wěn)定斑塊為主，并未對粥樣硬化斑塊引起的急慢性炎癥給予針對性的治療[9].

文獻報道活血化瘀藥物可抑制過度的炎癥因子表達，如白介素(interleukin, IL)家族中的白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor, TNF-α)和C反應蛋白(C-reactive protein, CRP)等[10-12].桃仁紅花煎出自宋代名醫(yī)陳素庵的《素庵醫(yī)案》，很多文獻書籍將其列為AS之心血瘀阻證型的代表方劑.桃仁紅花煎君以桃仁、紅花、延胡索、丹參、香附行氣通絡、活血化瘀，臣以青皮、川芎、赤芍活血通絡，當歸、生地養(yǎng)血祛瘀為其佐，并用乳香為其使，芳香行氣.全方共奏活血化瘀、理氣通絡之功.近年來對桃仁紅花煎用于心血管疾病的研究日益增多.桃仁紅花煎的藥理學分析發(fā)現(xiàn)該方可通過抗炎、擴張血管和抑制細胞增殖等在心血管疾病中發(fā)揮治療作用[13].基礎研究發(fā)現(xiàn)桃仁紅花煎可以顯著抑制寒凝血瘀型大鼠血清中血小板聚集[14].臨床研究結果提示，桃仁紅花煎可以改善勞力性心絞痛心血瘀阻癥患者的心絞痛積分、運動代謝當量及抑制炎癥反應[15]，提高冠心病、缺血性心臟病患者的臨床治療的有效率[16]，減少房顫患者發(fā)作次數(shù)、發(fā)作時間等[17].

本研究擬探索桃仁紅花煎是否可減少粥樣硬化斑塊面積以及對其潛在作用機制進行探討.

1 材料與方法

1.1 實驗動物與動脈粥樣硬化模型

6～8周齡的SPF(specific pathogen free)級別雄性ApoE-/-小鼠，體質(zhì)量在19～26 g范圍內(nèi)，實驗開始前給予1周普通飼料適應性喂養(yǎng)，1周后采用高脂飼料進行為期8周的造模，高脂飼料成分為：78.85%普通飼料+21%豬油+0.15%膽固醇(由常州鼠一鼠二生物科技有限公司合成及質(zhì)控).另有6～8周齡的SPF級C57BL/6小鼠作為空白組對照，給予普通飼料喂養(yǎng).本研究動物實驗得到上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院動物管理委員會批準實施(批準號：No. 2019-N002).

1.2 實驗干預藥物

本研究采用的干預藥物為辛伐他汀(商品名為舒降之，美國默沙東公司生產(chǎn)，貨號：6951283550390).中草藥來源于上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院中藥房，并由中藥房資深藥師進行質(zhì)量評估，產(chǎn)地及貨號見表1.已有研究對本方組分進行鑒定[13]，結果提示中藥復方桃仁紅花煎中共含有672種化合物分子(表1).另外，對本研究采用的桃仁紅花煎進行高效液相色譜(high performance liquid chromatography, HPLC)鑒定，結果提示有8種化合物的占比較高：苦杏仁苷(0.904 1%)、芍藥苷(0.601 3%)、丹參酚酸B(0.481 2%)、羥基紅花黃色素A(0.378 9%)、橘皮苷(0.253 3%)、延胡索乙素(0.130 2%)、阿魏酸(0.025 3%)和丹參酮(0.003 5%).

表1 桃仁紅花煎化學成分鑒定Table 1 Identification of chemical composition of TaorenHonghua formula

1.3 試劑和儀器

Anti-CD3 antibody(ab5690)為美國abcam公司產(chǎn)品；Anti-LYVE-1 antibody(ab14917)為美國abcam公司產(chǎn)品；goat anti-rabbit IgG H&L(Alexa Fluor?(488, # 4412)為美國CST公司產(chǎn)品；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)為美國abcam公司(ab104139)產(chǎn)品；RNA提取試劑盒為中國EZBioscience公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為日本TAKARA公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒為中國威奧公司產(chǎn)品；實時熒光定量基因擴增儀7500(0100147484)為美國應用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；冰凍切片機(CM1950)為德國徠卡公司產(chǎn)品；倒置式顯微鏡(403497)為日本Nikon公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡(Ti-E)為日本尼康公司產(chǎn)品.引物為上海生工公司產(chǎn)品，引物序列見表3.

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥

將ApoE-/-小鼠按照隨機數(shù)字表法分為5組，前4組每組12只，分別模型組(MOD)、桃仁紅花煎高劑量組(FH)、中劑量組(FM)和低劑量組(FL)，空白組(CON)C57BL/6小鼠10只.根據(jù)課題組前期研究的基礎及查閱的文獻，ApoE-/-小鼠給予高脂飲食飼養(yǎng)8周時檢測是否成模并根據(jù)結果給予干預，高、中、低劑量組的桃仁紅花煎質(zhì)量濃度依次為3.630 0、1.815 0、0.907 5 g/mL，每天灌胃2次，每次給予0.3 mL，給藥周期為12周.空白組給予生理鹽水，灌胃方法及時間同給藥組.

1.4.2 體質(zhì)量監(jiān)測及生化檢查

從造模開始到完成干預期間每周稱量小鼠體質(zhì)量1次，動態(tài)監(jiān)測其變化.眼球取血后3 000 r/min離心15 min，取血清并稀釋2.5倍后，檢測小鼠甘油三酯(TRIG)、膽固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、肌酐(CREA)、尿素(UA)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST).檢測由上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院檢驗科MODULAR全自動生化鑒定儀完成.

1.4.3 組織病理學檢測

將小鼠心臟及縱膈淋巴結(位于主動脈弓前方和前腔靜脈的側(cè)面，一般包含1～2個淋巴結[18])取出后放于體積分數(shù)為4%的多聚甲醛，4 ℃固定24 h后，依次于質(zhì)量分數(shù)為10%、20%和30%蔗糖溶液各脫水24 h，采用冰凍切片包埋劑進行包埋，心臟做橫切面切片并顯露心房及主動脈竇，心臟和淋巴結切片厚度均為10 μm.將心臟心房和淋巴結免疫熒光染色，主動脈竇行油紅O染色.分別于共聚焦顯微鏡和光學顯微鏡下觀察拍照.

1.4.4 血清炎癥因子檢測

按方法1.4.2提取血清并稀釋2.5倍后，參照ELISA試劑盒說明書分步檢測血清炎癥因子(IL-6、IL-10和TNF-α)的水平，采用酶標儀在D(562 nm)下檢測.

On the inconsistency of the surface air temperature forecasts over East Asia using TIGGE data

1.4.5 主動脈炎癥相關基因mRNA水平檢測

采用試劑盒提取主動脈總RNA并反轉(zhuǎn)錄后，實時熒光定量PCR法檢測炎癥相關基因IL-6、IL-10和TNF-α的mRNA表達水平.

1.5 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 22.0軟件分析結果，數(shù)據(jù)采用(平均數(shù)±標準差)表示，兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則采用兩獨立t檢驗，多組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則采用方差分析，否則采用非參數(shù)檢驗.P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 桃仁紅花煎可降低小鼠體質(zhì)量和血脂

如圖1A-1C所示，通過8周高脂飲食造模后，小鼠的體質(zhì)量、TRIG、CHOL、HDL和LDL明顯升高(P<0.05,P<0.01)，桃仁紅花煎可有效減輕小鼠體質(zhì)量、TRIG和CHOL濃度，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01).另外，桃仁紅花煎可降低LDL和升高HDL濃度，但無統(tǒng)計學差異.同時給藥組肝腎功能指標與空白組及對照組比較，均無統(tǒng)計學差異.

A：造模第8周和第20周(干預第12周)的小鼠體質(zhì)量.1)MOD組與CON組比較，給藥組與MOD組比較，P<0.05； B：小鼠從適應性喂養(yǎng)到干預完成期間體質(zhì)量變化情況(0～1代表適應性喂養(yǎng)1周，1～9代表造模1～8周，9～21代表藥物干預12周)； C：藥物干預結束后各組小鼠TRIG、CHOL、HDL和LDL濃度, 1)MOD組與CON組比較P<0.01， 2)給藥組與MOD組比較P<0.05； D：藥物干預結束后各組小鼠ALT、AST和CREA水平.

2.2 桃仁紅花煎可減小主動脈竇斑塊面積

如圖2所示，在倒置顯微鏡下觀察(×100)，細胞核呈藍色，間質(zhì)無色，粥樣硬化的脂肪區(qū)域呈現(xiàn)橘黃色.空白對照組未觀察到斑塊，模型組含有廣泛而典型的動脈粥樣硬化成熟斑塊，F(xiàn)H、FM和FL組可觀察到桃仁紅花煎干預后脂肪斑塊明顯縮小，且桃仁紅花煎的質(zhì)量濃度越高，脂肪斑塊含量越少.

圖2 小鼠主動脈竇斑塊油紅O染色鏡下改變(×100)

2.3 桃仁紅花煎抑制心房肌淋巴管增生

如圖3所示，在倒置熒光顯微鏡下觀察(×200)，細胞核呈藍色，淋巴管呈綠色(淋巴管表面的LYVE-1特異性抗體).空白對照組小鼠的心房肌淋巴管含量相對較少，且形態(tài)規(guī)則，呈完整的管腔狀；而模型組小鼠的心房肌淋巴管數(shù)量較空白組數(shù)量明顯增加，形態(tài)雜亂、粗大，大部分的淋巴管呈非閉合式管腔結構；通過不同濃度桃仁紅花煎干預的小鼠，心房肌淋巴管數(shù)量減少，管腔形態(tài)規(guī)則、完整.

圖3 小鼠心房淋巴管的免疫熒光染色鏡下改變(×200)

2.4 桃仁紅花煎減少淋巴結中T細胞含量

如圖4所示，在倒置熒光顯微鏡下觀察(×100)，細胞核呈藍色，綠色區(qū)域為T淋巴細胞(T淋巴細胞表面的CD3特異性抗體)，綠色熒光越強則代表T細胞數(shù)量越多.模型組小鼠的縱膈淋巴結中T細胞含量較空白組明顯增加，通過高劑量桃仁紅花煎干預組的小鼠，其縱膈淋巴結中T細胞含量較模型組明顯減少.

圖4 小鼠縱膈淋巴結中T細胞含量的免疫熒光染色

2.5 桃仁紅花煎可降低主動脈炎癥相關因子的mRNA表達

提取小鼠主動脈的總RNA，通過實時熒光定量PCR方法對其進行檢測.如圖5所示，模型組與空白組比較，IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量升高，IL-10的mRNA相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05).桃仁紅花煎干預后，IL-6和TNF-α的mRNA相對表達量明顯降低(P<0.01)，而IL-10的mRNA相對表達量僅有中劑量組可見明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01).

A：IL-6的mRNA相對表達量， 1)MOD組與CON組比較，給藥組與MOD組比較，P<0.01； B：IL-10的mRNA相對表達量， 1)MOD組與CON組比較，P<0.05，2)給藥組與MOD組比較，P<0.01； C：TNF-α 的mRNA相對表達量， 1)MOD組與CON組比較，給藥組與MOD組比較，P<0.01.

2.6 桃仁紅花煎降低血清炎癥因子的表達

處死各組小鼠前，通過眼球取血并離心獲得血清，采用ELISA法檢測各組小鼠血清中炎癥因子的表達情況.如圖6所示，模型組小鼠的血清IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度較空白組明顯升高(P<0.01)，IL-10質(zhì)量濃度稍有升高但不具有統(tǒng)計學差異.通過桃仁紅花煎干預后，IL-6和TNF-α表達水平較模型組明顯降低(P<0.01)，IL-10表達水平僅在低劑量組較模型組有所提高(P<0.05).

A：小鼠血清IL-6質(zhì)量濃度. 1)MOD組與CON組比較，給藥組與MOD組比較, P<0.01； B：小鼠血清IL-10質(zhì)量濃度.1) MOD組與CON組比較，給藥組與MOD組比較,P<0.05； C：小鼠血清TNF-α質(zhì)量濃度.1) MOD組與CON組比較，給藥組與MOD組比較P<0.01.

3 討論

本研究為采用中藥復方干預并探索其對AS過程中心臟淋巴管和心臟淋巴結T細胞數(shù)量變化的實驗研究，具有一定的創(chuàng)新性.對于動脈粥樣硬化與炎癥反應相關性的認識，使得人類對AS的發(fā)生發(fā)展以及治療策略有了全新的理解和機會.近年來，淋巴管在心血管疾病中的作用逐漸成為人們關注焦點，以期為患者尋找到一個全新有效的治療途徑[19].哺乳動物的循環(huán)系統(tǒng)包括血管和淋巴管[20]，雖然淋巴管內(nèi)皮細胞僅占成年人心臟細胞的3%[21]，不過研究表明心肌淋巴管增生和免疫細胞運輸增強在AS中起重要作用[22]，AS進展期斑塊病變處亦出現(xiàn)淋巴管數(shù)目增多的現(xiàn)象[23].本研究結果提示：模型組小鼠的心臟淋巴管較空白組數(shù)量增多，且形態(tài)雜亂，管腔結構嚴重受損，可能增強AS過程中的炎癥反應；桃仁紅花煎干預后3組小鼠的心臟淋巴管數(shù)量明顯減少，且形態(tài)規(guī)則，管腔結構完整，可能在一定程度上抑制了慢性炎癥反應.另外，既往心臟淋巴管染色多采用免疫組織化學法，本研究采用冰凍切片結合免疫熒光染色技術，發(fā)現(xiàn)此法可更加清晰展示淋巴管的形態(tài)和數(shù)量，但是需要注意冰凍切片的質(zhì)量，一旦卷片則無法呈現(xiàn)淋巴管完整的結構.

心臟淋巴結在心血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用也得到更多的醫(yī)學工作者關注，報道稱急性心血管事件中患者的T細胞數(shù)量明顯高于病情穩(wěn)定的患者，即T細胞含量的增多會提高突發(fā)心血管事件的風險[24]；另有研究表明在穩(wěn)定型心絞痛和急性冠狀動脈綜合征患者的胸淋巴結中調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量明顯增加，且淋巴結和血液之間的淋巴細胞亞群存在一定差異[25]，所以無法簡單通過外周血淋巴細胞含量判斷AS患者炎癥情況.本研究通過特異性CD3抗體標記縱膈淋巴結T淋巴細胞，評估AS中炎癥反應的情況.如前所述，模型組的縱膈淋巴結中T細胞數(shù)量較空白組明顯增多，這說明模型組小鼠的體內(nèi)炎癥反應更強；而桃仁紅花煎高劑量組小鼠的縱膈淋巴結中T細胞數(shù)量較模型組減少，從而推斷桃仁紅花煎可能通過減少T細胞數(shù)量以發(fā)揮抑制AS炎癥反應的作用.

此外，本研究亦發(fā)現(xiàn)桃仁紅花煎可以減輕小鼠體質(zhì)量，降低小鼠血清甘油三酯和總膽固醇含量，縮小主動脈竇油脂型斑塊面積，對IL-6和TNF-α具有明顯的抑制作用，但是對IL-10的升高效果不明顯，推測桃仁紅花煎發(fā)揮抗炎作用主要是通過抑制促炎因子，而非提高抑炎因子的表達.

本研究初步證明桃仁紅花煎具有一定的抗動脈粥樣硬化作用，并推測其發(fā)揮效應可能與抑制心臟淋巴管增生、減少縱膈淋巴結T細胞含量以及減輕相關炎癥因子水平相關，更深入的作用機制值得進一步探索.