危重型新型冠狀病毒肺炎患者T淋巴細(xì)胞亞群分析

吳強(qiáng), 盧春曉, 肖強(qiáng), 李曉龍, 江思維, 吳佳逢, 高虹*

(1. 深圳市第三人民醫(yī)院 心內(nèi)科， 廣東 深圳 518112; 2. 南方醫(yī)科大學(xué) 順德醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 廣東 佛山 528000)

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019， COVID-19，簡(jiǎn)稱新冠肺炎)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引起的急性呼吸道傳染病，COVID-19是嚴(yán)重影響人類健康和生命的重大公共衛(wèi)生威脅，臨床可分輕型、普通型、重型和危重型.重型和危重型轉(zhuǎn)化速度快，現(xiàn)有治療仍難以抑制部分患者的病情進(jìn)展.COVID-19是中國(guó)乃至世界目前較為重大的公共衛(wèi)生威脅.

有研究認(rèn)為SARS-CoV-2侵入人體的途徑與SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-CoV)相同，即通過病毒表面的刺突蛋白與呼吸道上皮細(xì)胞表面的受體，即血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin converting enzyme 2，ACE2)相互結(jié)合，隨后進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起一系列病理改變，并誘發(fā)炎癥因子釋放[1-2].早在 2005 年，Huang等[3]就發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子在SARS-CoV導(dǎo)致的急性呼吸窘迫綜合征(SARS)中具有重要作用, 在一項(xiàng)分析武漢市41 例COVID-19確診患者的研究中，也認(rèn)為SARS-CoV-2感染的危重病人可能與炎癥因子有關(guān)[4].因此分析COVID-19患者炎癥和免疫反應(yīng)特點(diǎn)，尋找早期的病情發(fā)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸預(yù)測(cè)指標(biāo)具有重要意義.本研究分析深圳市第三人民醫(yī)院2020年1月11日至2月5日收治的COVID-19患者152例，收集并記錄患者的臨床特征和血液生化指標(biāo), 初步分析COVID-19患者的炎癥和免疫反應(yīng)特點(diǎn)，以期尋找早期的病情發(fā)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的潛在生物標(biāo)志物.

1 資料與方法

1.1 對(duì)象

收集2020年1月11日至2月5日在深圳市第三人民醫(yī)院住院、年齡在18歲以上、明確診斷為COVID-19的患者.

1.2 診斷及臨床分型標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 診斷標(biāo)準(zhǔn)

診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[5]：

1.疑似病例：有流行病學(xué)史中的任何1條，且符合臨床表現(xiàn)中任意2條；無(wú)明確流行病學(xué)史的，符合臨床表現(xiàn)中的3條.

(1)流行病學(xué)史：①發(fā)病前14 d內(nèi)有武漢市及周邊地區(qū)，或其他有病例報(bào)告社區(qū)的旅行史或居住史；②發(fā)病前14 d內(nèi)與新型冠狀病毒感染者(核酸檢測(cè)陽(yáng)性者)有接觸史；③發(fā)病前14 d內(nèi)曾接觸過來(lái)自武漢市及周邊地區(qū)，或來(lái)自有病例報(bào)告社區(qū)的發(fā)熱或有呼吸道癥狀的患者；④聚集性發(fā)病.

(2)臨床表現(xiàn)：①發(fā)熱和/或呼吸道癥狀；②具有新型冠狀病毒肺炎影像學(xué)特征：早期呈現(xiàn)多發(fā)小斑片影及間質(zhì)改變，以肺外帶明顯，進(jìn)而發(fā)展為雙肺多發(fā)磨玻璃影、浸潤(rùn)影，嚴(yán)重者可出現(xiàn)肺實(shí)變，胸腔積液少見；③發(fā)病早期白細(xì)胞總數(shù)正?；蚪档?，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少.

2.確診病例：疑似病例，具備以下病原學(xué)證據(jù)之一者：①實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性；②病毒基因測(cè)序，與已知的新型冠狀病毒高度同源.

1.2.2 臨床分型標(biāo)準(zhǔn)

臨床分型標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》[5]：

(1)輕型：臨床癥狀輕微，影像學(xué)未見肺炎表現(xiàn).

(2)普通型：具有發(fā)熱、呼吸道等癥狀，影像學(xué)可見病毒性肺炎表現(xiàn).

(3)重型：符合以下任何一條.①呼吸窘迫：呼吸頻率(respiratory rate,RR)≥30次/min；②靜息狀態(tài)下，指氧飽和度≤93%；③動(dòng)脈血氧分壓(arterial partial pressure of oxygen，PaO2,P)與吸入氧濃度(fraction of inspiration O2，F(xiàn)iO2,F)之比P/F≤300 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa).

(4)危重型：符合以下情況之一者.①出現(xiàn)呼吸衰竭，且需建立人工氣道，進(jìn)行有創(chuàng)機(jī)械通氣；②出現(xiàn)休克；③合并其他器官功能衰竭需ICU 監(jiān)護(hù)治療.

1.3 分組

本研究中輕型與普通型合并為普通型組，故根據(jù)臨床分型將患者分為普通型組、重型組和危重型組.根據(jù)目前預(yù)后情況，對(duì)危重型組進(jìn)一步亞組分析，分為死亡組和生存組.

1.4 收集臨床數(shù)據(jù)

收集的臨床信息包括性別、年齡、初始癥狀、合并的基礎(chǔ)疾病、流行病學(xué)史、并發(fā)癥、臨床生化指標(biāo)、影像學(xué)檢查等，臨床生化指標(biāo)包括白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、病毒載量Ct值、氧合指數(shù)、血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein,CRP)、降鈣素原(procalcitonin,PCT)、D-二聚體、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、血肌酐、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)，臨床生化指標(biāo)均采集于患者入院48 h內(nèi)，均收集入院后第一次結(jié)果.

危重型患者按病程分為入院時(shí)、轉(zhuǎn)重型時(shí)、轉(zhuǎn)危重型時(shí)、轉(zhuǎn)危重型后1周、轉(zhuǎn)危重型后2周、觀察終點(diǎn)6個(gè)階段進(jìn)行數(shù)據(jù)收集，收集相應(yīng)節(jié)點(diǎn)前后24 h內(nèi)的血樣本指標(biāo)，其中觀察終點(diǎn)以患者死亡/好轉(zhuǎn)出院或最后一次指標(biāo)為參考.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，3組間比較采用秩和檢驗(yàn)，再進(jìn)行兩兩比較；正態(tài)分布計(jì)量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，非正態(tài)分布計(jì)量資料采用中位數(shù)表示，3組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，進(jìn)一步采用Bonferroni法進(jìn)行兩兩比較；Spearman等級(jí)相關(guān)系數(shù)用于進(jìn)行兩組連續(xù)變量之間的線性相關(guān)分析，用多因素Logistic回歸分析COVID-19危重型轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)因素.P<0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 COVID-19患者一般情況

本研究共納入152名明確診斷為COVID-19的患者，其中危重型組17例，重型組31例，普通型組104例；男性79例，占比51.9%.其中，危重型組男性12例，占比70.6%；重型組男性22例，占比70.9%；普通型組男性45例，占比43.2%；危重型組、重型組患者男性比例高于普通型組患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).平均年齡51.89歲，其中危重型組患者平均年齡63.53歲，重型組患者平均年齡59.55歲，普通型組患者平均年齡47.71歲，危重型組、重型組患者平均年齡均高于普通型患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).與普通型組比較，危重型組患者合并高血壓、糖尿病比例較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).與普通型組患者比較，危重型組患者氧合指數(shù)、病毒載量Ct值較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，D-二聚體、AST、LDH、ESR較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).與重型組患者比較，危重型組患者D-二聚體、LDH較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1、2).

表1 危重型組、重型組、普通型組3組間一般資料比較Table 1 Comparison of general data among three groups of critical, severe and general

表2 危重型組、重型組、普通型組3組間臨床生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of clinical biochemical indexes among three groups of critical, severe and general

2.2 COVID-19患者外周免疫和炎癥指標(biāo)分析

收集患者入院時(shí)免疫和炎癥指標(biāo)分析，與普通型組患者比較，危重型組患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、IL-6較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).與重型組患者比較，危重型組患者IL-6較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05).與普通型組比較，危重型組、重型組CD4/CD8比值較高，但進(jìn)一步兩兩比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(表3).

表3 危重型組、重型組、普通型組3組間免疫和炎癥指標(biāo)比較Table 3 Comparison of immune and inflammation indexes among three groups of critical, severe and general

2.3 COVID-19患者多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析顯示CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少(OR=-0.011；95%CI為0.979～0.999；P=0.031)，IL-6升高(OR=0.069；95%CI為1.010～1.136；P=0.022)是危重型COVID-19的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4).

表4 與危重型 COVID-19相關(guān)的危險(xiǎn)因素的多因素回歸分析Table 4 Multivariate regression analysis of risk factors related to critical COVID-19

2.4 COVID-19患者外周免疫和炎癥指標(biāo)相關(guān)性分析

使用Spearman相關(guān)系數(shù)來(lái)進(jìn)行相關(guān)性研究，發(fā)現(xiàn)病毒滴度Ct值與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)成正相關(guān)，與CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、IL-6等無(wú)相關(guān)性；IL-6與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)成負(fù)相關(guān)；IL-6與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP成正相關(guān)(圖1).

A:病毒滴度Ct值與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性分析；B:IL-6與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性分析；C:IL-6與中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性分析；D:IL-6與CRP相關(guān)性分析.

2.5 生存組與死亡組外周免疫與炎癥指標(biāo)變化趨勢(shì)

危重型組亞組分析，死亡組病程中淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)偏低，生存組淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)逐步恢復(fù)，死亡組病程后期白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)升高.死亡組病程中IL-6、CRP的質(zhì)量濃度逐步升高，其中兩例患者觀察終點(diǎn)時(shí)IL-6的質(zhì)量濃度高于檢測(cè)極限，生存組IL-6、CRP的質(zhì)量濃度隨著病情好轉(zhuǎn)逐步下降(圖2).

A:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)白細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)；B:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)；C:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)；D:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)；E:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)變化趨勢(shì)；F:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)CRP變化趨勢(shì)；G:死亡組與生存組不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)IL-6變化趨勢(shì).

3 討論

早期研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)COVID-19患者淋巴細(xì)胞絕對(duì)值降低[6-7].本研究中大部分COVID-19患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，且在危重型組患者中計(jì)數(shù)降低更加明顯，危重型組患者中CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低.進(jìn)一步對(duì)危重型組患者進(jìn)行亞組分析，死亡組患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)偏低，而生存組患者淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，在轉(zhuǎn)危階段達(dá)到最低谷，其后隨著病情的好轉(zhuǎn)，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、CD8+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)逐步恢復(fù)，且相關(guān)性分析提示淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)與病毒載量Ct值成正相關(guān)，病毒載量Ct值越低，病毒復(fù)制情況越嚴(yán)重，淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)越低.Qin等[8]研究亦發(fā)現(xiàn)COVID-19患者中T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，尤其是CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少在危重癥患者中更為常見，但CD8+T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞的數(shù)量卻無(wú)明顯變化.本研究中，CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞在危重型患者中均有明顯減少，SARS-CoV-2可能與SARS-CoV一樣，能作用于淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞均減少.病毒顆粒通過呼吸道黏膜傳播并感染其他細(xì)胞，產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng), 淋巴細(xì)胞總數(shù)的大幅減少表明SARS-CoV-2消耗了許多免疫細(xì)胞并抑制了人體的細(xì)胞免疫功能.T淋巴細(xì)胞的損傷可能是導(dǎo)致患者病情惡化的重要因素[9].

首例COVID-19患者的病理解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外周血淋巴細(xì)胞減少，但同時(shí)淋巴細(xì)胞也被過度激活，尤其是CD4+T細(xì)胞中具有高度促炎效應(yīng)的CCR4+CCR6+Th17細(xì)胞數(shù)量增加，CD8+T細(xì)胞中高細(xì)胞毒性的T細(xì)胞過度活化[10].Th17 細(xì)胞是近些年發(fā)現(xiàn)的 T 細(xì)胞亞群，能夠分泌大量的IL-17從而起到致炎作用.原始 T 淋巴細(xì)胞在IL-6及其他因子刺激下，由非受體酪氨酸激酶介導(dǎo)，激活 STAT3 信號(hào)通路，通過表達(dá)維甲酸相關(guān)核孤兒受體γt使 Th0 分化平衡朝 Th17 轉(zhuǎn)化[11]. 本研究中COVID-19患者促炎性細(xì)胞因子IL-6升高，在危重型患者中升高更加明顯，亞組分析顯示死亡組患者病程中IL-6持續(xù)升高，病程后期IL-6 異常升高，其中2例患者IL-6在觀察終點(diǎn)高于檢測(cè)極限.SARS-CoV感染可誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的上調(diào)以及炎性趨化因子CCL3、CCL5、CCL2和CXCL10的上調(diào)[12]，SARS-CoV-2可能與SARS-CoV一樣.上調(diào)的IL-6等促炎性細(xì)胞因子刺激原始T淋巴細(xì)胞分化為具有高度促炎效應(yīng)的Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞增加導(dǎo)致細(xì)胞因子的過度分泌，形成級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng).由于炎癥反應(yīng)，肺部病變部位的血管通透性增大，導(dǎo)致病變部位的病原體更容易進(jìn)入血管，同時(shí)加速血管中液體的外滲，從而破壞組織.肺組織中炎癥反應(yīng)失控，過度免疫反應(yīng)使大量的免疫細(xì)胞在肺中激活、募集，這種異常升高的細(xì)胞因子與過度激活的免疫細(xì)胞，造成肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞彌漫性損傷，大量滲出液聚集而使氣道阻塞，最終導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)的發(fā)生[13].同時(shí)，嚴(yán)重的肺損傷、機(jī)體免疫功能的損害以及細(xì)胞因子在循環(huán)系統(tǒng)中導(dǎo)致的全身細(xì)胞因子風(fēng)暴會(huì)進(jìn)一步引起全身臟器的功能障礙，這很可能是導(dǎo)致COVID-19患者病情突然加重，甚至死亡的重要原因之一[14].因此，危重型病例的早期發(fā)現(xiàn)和及時(shí)治療至關(guān)重要，對(duì)炎癥因子持續(xù)升高、有ARDS傾向的患者，可嘗試盡早使用糖皮質(zhì)激素；而淋巴細(xì)胞減少，免疫功能受損，可嘗試使用免疫球蛋白來(lái)增強(qiáng)重癥患者的抗感染能力[6].開展細(xì)胞因子等指標(biāo)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，可能有助于早期發(fā)現(xiàn)是否出現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴，判斷是否需要連續(xù)腎臟替代治療(continuous renal replacement therapy,CRRT)、人工肝血液凈化等治療[15].目前COVID-19抗病毒治療和中醫(yī)治療是主要治療手段[16]，針對(duì)Th17細(xì)胞激活的IL-17抑制劑蘇金單抗[10]和直接靶向抗 IL-6 的藥物托珠單抗、司妥單抗等對(duì)COVID-19患者可能有作用[17-18].

研究顯示，淋巴細(xì)胞減少和T淋巴細(xì)胞亞群的持續(xù)消耗是SARS進(jìn)行性發(fā)展的表現(xiàn)之一，長(zhǎng)時(shí)間或更低水平的CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞與疾病加重甚至死亡呈正相關(guān)，低CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞被建議作為SARS嚴(yán)重程度的標(biāo)志[19-20].本研究多因素Logistic回歸分析顯示，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)減少、IL-6升高是COVID-19患者危重型轉(zhuǎn)化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.凌云等[21]亦發(fā)現(xiàn)，COVID-19重癥患者的細(xì)胞免疫功能顯著被抑制，進(jìn)一步的Logistic回歸分析顯示，低CD8+T淋巴細(xì)胞水平是COVID-19進(jìn)展為重癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素.提示T細(xì)胞亞群可作為COVID-19輕癥向重癥轉(zhuǎn)化的預(yù)測(cè)因子.因T細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化可提示病情輕重轉(zhuǎn)化，建議臨床醫(yī)生在診治過程中結(jié)合T細(xì)胞亞群，對(duì)患者進(jìn)行危險(xiǎn)分級(jí)，預(yù)判疾病程度，以便在病情惡化的早期實(shí)施有效干預(yù)，逆轉(zhuǎn)重癥發(fā)展，降低病死率.

本研究存在一定的局限性，首先，這是一項(xiàng)對(duì)入院患者的回顧性、小樣本研究；其次，本研究只檢測(cè)了T淋巴細(xì)胞，未檢測(cè)體液免疫、NK細(xì)胞等，細(xì)胞因子方面只檢測(cè)了IL-6，未檢測(cè)其他細(xì)胞因子及趨化因子；第三，合并細(xì)菌感染的COVID-19患者的免疫反應(yīng)結(jié)果可能會(huì)受影響.

盡管如此，本研究提示了一些有關(guān)COVID-19患者免疫反應(yīng)的新信息，即SARS-CoV-2可能主要作用于淋巴細(xì)胞引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，尤其是T淋巴細(xì)胞，并產(chǎn)生一系列免疫應(yīng)答.IL-6可能在誘發(fā)機(jī)體細(xì)胞因子風(fēng)暴方面有介導(dǎo)和促進(jìn)作用.因此對(duì)淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞亞群、IL-6等進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于及早識(shí)別危重傾向患者，及早治療.