加味香連丸的質(zhì)量控制研究*

張曉雪，武 婕，余河水，張麗娟，李 薇，宋新波，2

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2．天津中一制藥有限公司，天津 300193）

加味香連丸的質(zhì)量控制研究*

張曉雪1，武 婕1，余河水1，張麗娟1，李 薇1，宋新波1，2

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2．天津中一制藥有限公司，天津 300193）

[目的]對(duì)加味香連丸質(zhì)量控制進(jìn)行研究。[方法]采用薄層色譜法對(duì)加味香連丸中白芍、當(dāng)歸、黃芩進(jìn)行定性鑒別，建立高效液相色譜法同時(shí)測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的含量。[結(jié)果]白芍、當(dāng)歸、黃芩的薄層色譜鑒別斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無干擾；高效液相色譜方法測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚分別在0．011 68～0．116 8、0．022～0．22、0．255～0．025 5、0．004 1～0．041 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均回收率分別為98．75%、99．79%、99．22%、99．36%（n=6）；RSD分別為1．63%、1．3%、1．57%、1．6%。[結(jié)論]本法簡便易行、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性良好，為加味香連丸的質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。

加味香連丸；薄層色譜；高效液相色譜法；芍藥苷；柚皮苷；黃芩苷；厚樸酚

痢疾是痢疾桿菌引起的腸道傳染病。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、里急后重、排黏液膿血樣大便。痢疾夏季發(fā)病率高，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為多由濕熱之邪所致[1-8]。其中加味香連丸就是常用于治療大腸濕熱所致痢疾的中成藥之一。具有清熱祛濕，化滯止痛的功效，現(xiàn)代應(yīng)用多用于治療泄瀉、慢性結(jié)腸炎[9-10]。收載于2015版《中國藥典》[11]。本品由木香、黃芩、白芍、姜厚樸、檳榔、制吳茱萸、炙甘草、姜黃連、黃柏、當(dāng)歸、麩炒枳殼、醋延胡索等12味藥物組成。其中白芍、當(dāng)歸、枳殼、黃芩、厚樸均為主要藥味，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有木香、厚樸、枳殼和延胡索的薄層色譜定性鑒別項(xiàng)及鹽酸小檗堿的含量測定項(xiàng)[12-13]，所以本實(shí)驗(yàn)對(duì)加味香連丸中的白芍、黃芩、當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，并采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定加味香連丸中芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的含量。為進(jìn)一步提高加味香連丸用藥安全和質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 LC-2010AHT型液相色譜儀（日本島津公司），島津LC-2010色譜工作站；AB135-S電子分析天平（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；HH．S21-6數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；1AB恒溫干燥箱（天津市天宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；SHB－Ⅲ循環(huán)水式真空泵（天津科諾儀器設(shè)備有限公司）。薄層層析硅膠GF254板、G板（青島鼎康硅膠有限公司）。

1.2 試藥 加味香連丸（批號(hào)3082226、3082225、2083019），購自北京同仁堂制藥有限公司；陰性樣品均為實(shí)驗(yàn)室自制。芍藥苷（批號(hào)AB017P）、阿魏酸（批號(hào)AB156F）、藁本內(nèi)酯（批號(hào)AB177W），均購自天津一方科技有限公司；黃芩苷（批號(hào)110715-201312）、黃芩素（批號(hào)111595-20130905)、漢黃芩素（批號(hào)111514-20130403)、柚皮苷（批號(hào)110722-2013012)、厚樸酚（批號(hào)110729-201309）、當(dāng)歸對(duì)照藥材（批號(hào)120927-201516），均購自中國藥品生物制品檢定所。芍藥對(duì)照藥材（批號(hào)2013-006）、黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)2013-010），均購自天津中醫(yī)藥大學(xué)。

1.3 試劑 甲醇（色譜級(jí)、美國Fisher Scientific公司）；甲苯、三氯甲烷、二氯甲烷、環(huán)己烷、乙醚、乙酸乙酯、乙醇、磷酸、鹽酸、甲酸（分析級(jí)、天津百世化工有限公司）；超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 白芍的薄層鑒別 取3種批號(hào)的加味香連丸研勻，取粉末1 g，加無水乙醇20 mL，振蕩10 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)訜o水乙醇2 mL溶解，作為供試品溶液。取按加味香連丸處方及制備工藝制備缺白芍的陰性樣品1 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取白芍對(duì)照藥材0．5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取芍藥苷對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述6種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶15∶0．2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，于105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與白芍陰性對(duì)照色譜中，無此斑點(diǎn)。色譜圖見圖1。

圖1 白芍薄層色譜

2.1.2 當(dāng)歸的薄層鑒別 取3種批號(hào)的加味香連丸研勻，取粉末0．5 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)由倭克芙猓孟←}酸調(diào)pH2～3左右，用30、20、20 mL乙醚分別萃取3次，合并萃取液，揮干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。取按加味香連丸處方及制備工藝制備缺當(dāng)歸的陰性樣品1 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液。取當(dāng)歸對(duì)照藥材0．5 g，加乙醚超聲20 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)? mL無水乙醇溶解，作為當(dāng)歸對(duì)照藥材溶液。另取阿魏酸和藁本內(nèi)酯對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述7種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)乙烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（40∶25∶10∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254、365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與當(dāng)歸陰性對(duì)照色譜中，無此斑點(diǎn)。色譜圖見圖2。

圖2 當(dāng)歸薄層色譜

2.1.3 黃芩的薄層鑒別 取3種批號(hào)的加味香連丸研勻，取粉末1 g，加乙酸乙酯-甲醇（3∶1）的混合溶液30 mL，加熱回流30 min，放冷，濾過，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，取上清液為供試品溶液。取按加味香連丸處方及制備工藝制備缺黃芩的陰性樣品1 g，另取黃芩對(duì)照藥材1 g，同法制成陰性對(duì)照品溶液及黃芩對(duì)照藥材溶液。另取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品加甲醇制成每1 mL含1、0．5、0．5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取上述8種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶2∶1）為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與黃芩陰性對(duì)照色譜中，無此斑點(diǎn)。色譜圖見圖3。

圖3 黃芩薄層色譜圖

2.2 定量分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：SHIMADZU VP-ODS（250 mm×4．6 mm，5 μm）；以甲醇（A）：0．1%磷酸水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫（0～15 min，20%～30%A；15～50 min，30%～75%A；50～65 min，75%～100%A）；檢測波長為230 nm；流速：1．0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10 μL，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1 mL含0．116 8 mg芍藥苷、0．22 mg柚皮苷、0．255 mg黃芩苷、0．041 mg厚樸酚的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取加味香連丸，研成細(xì)末，精密稱定0．5 g，置25 mL容量瓶中，加入適量甲醇，浸漬2 h，在45℃下，超聲提?。üβ?50 W，頻率40 kHz)30 min，放至室溫，再用甲醇定容至刻度線，過濾，濾液用微孔濾膜（0．45 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按照加味香連丸處方量和制備工藝制備缺白芍、枳殼、黃芩、厚樸的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液進(jìn)樣，結(jié)果陰性樣品無干擾，證明此色譜條件可行。見圖4。

圖4 加味香連丸供試品、陰性樣品吸混合對(duì)照品的色譜圖

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取1、2、4、6、8、10 mL“2．2．2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品貯備液，分別置于不同的10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，在“2．2．1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），計(jì)算線性回歸方程，得到芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的回歸方程分別，線性范圍為0．01168～0．116 8 g/L，線性范圍為0．022～0．22 g/L；0．999 8），線性范圍為0．025 5～0．255 g/L；厚樸酚30000000X+677．54（r2=0．9997），線性范圍為0．004 1～0．041 g/L。

2.2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液，即“2．2．2”制備的對(duì)照品溶液，按“2．2．1”項(xiàng)下方法測定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6次。測得芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚峰面積值得RSD為0．34%、0,86%、0．54%、0．27%，精密度符合要求。

2.2.5.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣1次，依法進(jìn)行含量測定，測定芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚峰面積RSD分別為0．43%、0．72%、1．24%、0．48%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（3082226）樣品6份，按“2．2．3”項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，按“2．2．1”項(xiàng)下方法測定分析，結(jié)果6份樣品中芍藥苷的平均含量1．98 mg/g，RSD=0．85%，柚皮苷的平均含量4．42 mg/g，RSD=1．24%，黃芩苷的平均含量3．02 mg/g，RSD=0．69%，厚樸酚的平均含量0．28 mg/g，RSD=0．74%，結(jié)果表明重復(fù)性符合要求。

2.2.5.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)（3082226）的樣品6份，各0．5 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，分別精密加入芍藥苷0．001 05 g、柚皮苷0．002 45 g、黃芩苷0．001 40 g、厚樸酚0．000 13 g，按“2．2．3”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，依法測定樣品中的芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸苷的含量，計(jì)算回收率。結(jié)果芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸苷平均回收率為98．75%、99．79%、99．22%、99．36%；RSD分別為1．63%、1．30%、1．57%、1．60%。結(jié)果見表1。

2.2.5.6 樣品測定 取3批樣品（批號(hào)3082226、3082225、2083019），按“2．2．3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷、厚樸酚的峰面積，結(jié)果芍藥苷的含量分別為2．0400、2．0394、2．035 3 mg/g，柚皮苷的含量分別為4．909 1、5．010 9、4．904 8 mg/g，黃芩苷的含量分別為3．018 2、3．034 2、3.012 6 mg/g，厚樸酚含量分別為0.279 6、0.283 0、0.276 7 mg/g。

表1 回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1 薄層色譜的選擇 因?yàn)榧游断氵B丸處方中白芍、當(dāng)歸、黃芩均為主要藥味，但查閱《中國藥典》及參考文獻(xiàn)均未對(duì)處方中白芍、當(dāng)歸、黃芩進(jìn)行薄層色譜鑒別。所以本實(shí)驗(yàn)選擇三者進(jìn)行定性鑒別，對(duì)加味香連丸中定性鑒別進(jìn)行補(bǔ)充。在展開劑的選擇上，分別參考了《中國藥典》中單味藥材的薄層鑒別方法，但發(fā)現(xiàn)芍藥苷、阿魏酸、黃芩苷等的比移（Rf）值太小，所以適當(dāng)?shù)恼{(diào)整了展開劑的極性比例，發(fā)現(xiàn)分離成分的Rf值和分離度較好。

3.2 色譜條件的選擇 參考文獻(xiàn)[14-16]芍藥苷、柚皮苷、黃芩苷及厚樸酚最佳吸收波長分別為230、274、284、294 nm，通過比較4個(gè)波長下4種成分的含量變化，最終選擇230 nm為最佳檢測波長，此時(shí)4種成分含量均較高，且與雜峰分離較好。

在流動(dòng)相的選擇上，考察了甲醇-0.1%冰醋酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液[17-20]，結(jié)果表明甲醇-0.1%磷酸水溶液的峰形較好，又考察了此條件下流動(dòng)相的洗脫程序，發(fā)現(xiàn)梯度程序比等度程序能更好將四種成分與雜質(zhì)峰分離，峰形較好，且陰性樣品無干擾。

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·啟 事·

《天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》2017年征訂征稿啟事

《天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》（CN 12-1391/R，ISSN 1673-9043）由天津市教委主管，天津中醫(yī)藥大學(xué)主辦，主編為中國工程院院士、中國中醫(yī)科學(xué)院院長、天津中醫(yī)藥大學(xué)校長張伯禮教授。本刊為“中國科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊”（中國科技核心期刊），美國《化學(xué)文摘》收錄期刊，獲得國家中醫(yī)藥管理局第四屆全國中醫(yī)藥優(yōu)秀期刊獎(jiǎng)，天津市一級(jí)期刊。

本刊創(chuàng)刊于1982年，主要欄目有：理論研究、臨床研究、實(shí)驗(yàn)研究、中藥研究、教育質(zhì)量與改革、學(xué)生園地和綜述等。本刊加強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)建設(shè)，建立一級(jí)域名獨(dú)立網(wǎng)站，并啟動(dòng)網(wǎng)上采編系統(tǒng)，投稿網(wǎng)址為：http://www．tjzhongyiyao．com。作者可以在系統(tǒng)中進(jìn)行稿件狀態(tài)查詢，隨時(shí)了解稿件進(jìn)度，與編輯部溝通。本刊網(wǎng)站提供創(chuàng)刊以來所有已刊發(fā)文章的免費(fèi)下載，歡迎瀏覽。此網(wǎng)上采編系統(tǒng)為本刊唯一收稿方式，本刊未委托任何其他單位和個(gè)人代理收稿。

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The research of quality contral of Jiawei Xianglian pill

ZHANG Xiao-xue1,WU Jie1,YU He-shui1,ZHANG Li-juan1,LI Wei1,SONG Xin-bo1,2
（1.Tianjin university of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.Tianjin Zhongyi pharmaceutical Co.Ltd,Tianjin 300193,China）

[Objective]To research the quality control of Jiawei Xianglian pill．[Methods]Paeoniae Radix Alba,Angelicae Sinesis Radix and Scutellaria Radix of Jiawei Xianglian pill was identified by TLC．HPLC was applied to determine the content of paeoniflorin,naringin,baicalin and magnolol．[Results]TLC identification methods had good specificities without interference from negative control．The calibration curves of paeoniflorin, naringin,baicalin and magnolol were linear in the ranges of 0．011 68～0．116 8,0．022～0．22,0．255～0．025 5 and 0．004 1～0．041 mg/mL．The average recoveries wear 98．75%(RSD=1．63%),99．79%(RSD=1．3%),99．22%(RSD= 1．57%),99．36%（RSD=1．6%）．[Conclusion]This method was simple,pricise and repeatablewhich can be used for quality control of Jiawei Xianglian pill．

Jiawei Xianglian pill;TLC;HPLC;Paeoniflorin;Naringin;Baicalin;Magnolo

R284

A

1673－9043（2016）06－0413-05

2016-07-11）

10．11656/j．issn．1673-9043．2016．06．13

天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（14TXZYJH00440）。

張曉雪（1988-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

宋新波，E-mail：songxinbo@tjutcm．edu．cn。