市售肉蓯蓉飲片的鑒別及苯乙醇苷類的含量測定*

李 浩，肖 洋，段金芳，劉 影，竇志英

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

市售肉蓯蓉飲片的鑒別及苯乙醇苷類的含量測定*

李 浩，肖 洋，段金芳，劉 影，竇志英

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

[目的]建立市售肉蓯蓉飲片的高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，以期鑒別肉蓯蓉真?zhèn)?。建立HPLC方法測定其苯乙醇苷類含量。[方法]采用HPLC法,以標(biāo)準(zhǔn)藥材肉蓯蓉為參照圖譜,對肉蓯蓉飲片進(jìn)行指紋圖譜分析。采用Kromasil C18色譜柱，甲醇∶水（0.1%甲酸）梯度洗脫，檢測波長330 nm。[結(jié)果]該方法精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好,不同市場采購的肉蓯蓉指紋圖譜差異較大。苯乙醇苷類含量測定方法符合要求。[結(jié)論]福建、江蘇和山東省購買的肉蓯蓉飲片鑒定為偽品，其他省市購買的肉蓯蓉飲片苯乙醇苷類含量符合要求，初步評價質(zhì)量符合要求。

鑒別；指紋圖譜；質(zhì)量評價

肉蓯蓉為列當(dāng)科植物肉蓯蓉（Cistanche deserticola Y.C.Ma）或管花肉蓯蓉[Cistanche tubulosa（Schrenk）Wight]干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，別名大蕓，是傳統(tǒng)的補(bǔ)腎陽中藥，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有補(bǔ)腎陽、益精血、潤腸通便的功效。主治男子陽痿、女子不孕、血枯便秘等癥，有“沙漠人參”之美譽(yù)[1]。肉蓯蓉主要成分有苯乙醇苷類、環(huán)烯醚萜苷、木脂素及甾醇等[2-4]，其中苯乙醇苷類是評價肉蓯蓉質(zhì)量、鑒別肉蓯蓉真?zhèn)蔚闹匾笜?biāo)。苯乙醇苷類是肉蓯蓉抗衰老、抗疲勞、補(bǔ)腎助陽、抗老年性癡呆等藥理作用的主要活性成分[5-7]，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是肉蓯蓉苯乙醇苷類的含量較高的兩種有效成分，故本文通過測量松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量[8]，初步考察市場銷售的肉蓯蓉的苯乙醇苷含量。由于肉蓯蓉資源稀少，價錢昂貴，導(dǎo)致市場上肉蓯蓉質(zhì)量參差不齊，甚至出現(xiàn)一些偽品假品，本實驗對不同市場購買的肉蓯蓉飲片指紋圖譜鑒定[9]，進(jìn)而評價市售肉蓯蓉飲片初步評價，以期更好地指導(dǎo)臨床應(yīng)用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2010A HT高效液相色譜儀及工作站（島津公司），KQ-300B超聲清洗器（昆明市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A210型電子分析天平（上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)W100型高速萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥 甲醇（色譜純，天津市康克德科技有限公司），甲酸（色譜純，天津市元立化工有限公司），蒸餾水（廣州市屈臣氏食品飲料有限公司），肉蓯蓉松標(biāo)準(zhǔn)藥材（批號121101-200402），松果菊苷（批號AB739E），毛蕊花糖苷（批號AB732A）購自天津一方科技有限公司。肉蓯蓉飲片購自不同省市，見表1。

表1 肉蓯蓉樣品購買信息

2 指紋圖譜方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 KromasilC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈為流動相A，0.2%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序為（A）0～10 min，9%～15%A；10～45 min，15%～30%A；45～50min，30%～9%A；柱溫30℃，流速1．0 mL/min，檢測波長為330 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 供試品制備 取干燥的肉蓯蓉粉末（過60目篩）約0．5 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇25 mL，密塞，稱質(zhì)量，浸泡12 h，超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取30 min，放冷，再稱質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，上清液經(jīng)0．45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液置棕色瓶中，即得。

2.3 測定方法 各供試品溶液進(jìn)樣10 μL，在上述色譜條件下進(jìn)行分離測定，記錄色譜圖。色譜圖為參照圖譜，計算不同省市購買的肉蓯蓉飲片相似度。

2.4 穩(wěn)定性實驗 取同一樣品供試品，分別于0、2、8、12、24 h檢測，其主要共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3%，表明樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 精密度實驗 取同一樣品供試品，連續(xù)進(jìn)樣5次，其主要共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3%，表明其精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗 取同一樣品5份，分別處理測定，其主要共有峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于3%，表明其重復(fù)性良好。

2.7 指紋圖建立與分析 采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2004A版），對10個省市購買肉蓯蓉飲片的HPLC譜圖進(jìn)行綜合評價,見圖1，以標(biāo)準(zhǔn)藥材肉蓯蓉為參照圖譜，其相似度評價結(jié)果見表2。

2.8 結(jié)果 從指紋圖譜和相似度結(jié)果可得，福建、江蘇和山東其相似度較低，鑒定不是肉蓯蓉飲片，可能為偽品蛇菰和多蕊蛇菰的全草或者其替代品鹽生肉蓯蓉、沙蓯蓉和草蓯蓉等飲片。

3 含量測定方法與結(jié)果

3.1 色譜條件 KromasilC18色譜柱（4．6mm×250mm，5μm），以甲醇為流動相A，0．1%甲酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序為（A）0～10 min，27%A；10～13 min，27%～32%A；13～28 min，32%A；28～31 min，32%～35%A；31～47 min，35%A；47～49 min，35%～60%A；49～55min，60%A；柱溫30℃，流速0．8 mL/min，檢測波長為330 nm，進(jìn)樣量10 μL，色譜圖見圖2。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 精密稱定松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品5．05、5．24 mg，分別置于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，制成含有松果菊苷、毛蕊花糖苷分別為1．01、1．12 g/L的對照品儲備液。

3.3 供試品溶液的制備 將肉蓯蓉樣品粉碎，精密稱取粉末（過四號篩）1 g，置100 mL棕色量瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，稱定質(zhì)量，浸泡30min，超聲處理40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足失重，搖勻，靜置，取上清液過0．45 μm微孔濾膜，續(xù)濾液即為供試品溶液。

圖1 不同市場肉蓯蓉飲片指紋圖譜

表2 不同市場肉蓯蓉飲片相似度

3.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品儲備液適量置于5 mL容量瓶混勻，加入50%甲醇溶液稀釋得到一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)對照品溶液，松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)對照品濃度為10．1、20．2、40．4、101、202．0、505．0 mg/L，毛蕊花糖苷標(biāo)準(zhǔn)對照品濃度為10．4、20．9、41．9、104．8、209．6、524．0 mg/L，吸取10 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，松果菊苷回歸方程為0．998 5）線性范圍為0．101～5．050 μg毛蕊花糖苷回歸方程為線性范圍為0．104～5．240 μg。

圖2 肉蓯蓉HPLC色譜

3.5 精密度實驗 取濃度約為0．1 g/L的混合對照品，連續(xù)進(jìn)樣6次，松果菊苷、毛蕊花糖苷對照品峰面積RSD分別是0．18%和0．26%，表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性實驗 精密稱取肉蓯蓉粉末1 g，按供試品溶液制備項下方法制備供試品溶液，分別于0、1、2、6、12、24 h進(jìn)樣，供試品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1．60%和1．10%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復(fù)性實驗 取同一市場肉蓯蓉粉末6份，精密稱定，每份取樣量約為1 g，按樣品制備方法制備并測定每份的含量。供試品溶液中松果菊苷、毛蕊花糖苷含量的RSD分別為1．20%和0．79%，說明樣品分析的結(jié)果穩(wěn)定，該方法的重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收率實驗 精密稱取肉蓯蓉粉末約20 mg，按照表加入松果菊苷、毛蕊花糖苷的標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于肉蓯蓉藥材中松果菊苷、毛蕊花糖苷的80%、100%、120%的含量），按2．3項下操作制備供試品溶液，在2．1項的色譜條件下分析，計算回收率。見表3。

表3 松果菊苷、毛蕊花糖苷加樣回收率實驗

3.9 樣品測定 精密稱取肉蓯蓉粉末1g，平行3份，按2．3項下操作制備供試品溶液，在2．1項的色譜條件下分析，記錄峰面積，計算松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量。

3.10 結(jié)果 2010版《中國藥典》按干燥品計算肉蓯蓉含松果菊苷（C35H46O20）和毛蕊花糖苷（C35H46O20）的總量不得少于0．30%，本實驗結(jié)果，中山東購買的肉蓯蓉飲片苯乙醇苷類含量低于《中國藥典》要求。見表4。

表4 不同市場銷售的肉蓯蓉的松果菊苷、毛蕊花糖苷的含量

4 討論

本實驗通過中藥指紋圖譜鑒別不同省市購買的肉蓯蓉飲片的真?zhèn)危瑫r測定苯乙醇苷類有效成分含量，初步評價市售肉蓯蓉飲片質(zhì)量。根據(jù)本實驗的結(jié)果可知市售的肉蓯蓉飲片真?zhèn)未嬖趩栴}，市場銷售的肉蓯蓉飲片苯乙醇苷類的含量差異性，折射出肉蓯蓉的質(zhì)量差異很大，其原因可能為藥源不同、采收產(chǎn)地不同、季節(jié)不同等，這對臨床用藥影響很大。

實驗過程中，在不同市場采購的肉蓯蓉品相也不同，不同市場銷售的肉蓯蓉的炮制工藝不同導(dǎo)致其品相差異，顏色差異性很大，南方沿海地區(qū)的多為深棕色、黏性較大，北方地區(qū)多為黃色、黏性小、纖維性較強(qiáng)。炮制工藝的不同也可能導(dǎo)致苯乙醇苷類含量的差異。

松果菊苷和毛蕊花糖苷這兩種苯乙醇苷類都對光較敏感，其穩(wěn)定性較差，其對照品需要避光、冷凍、干燥儲藏，測量時盡量在短時間內(nèi)測完樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，以免發(fā)生異構(gòu)化等。實驗過程中，應(yīng)采用50%的甲醇溶液（即提取液），若純甲醇配制的標(biāo)準(zhǔn)品測量過程中松果菊苷容易出現(xiàn)峰的分裂或出現(xiàn)肩縫而采用50%的甲醇溶液后松果菊苷的分裂峰或者肩縫沒有出現(xiàn)。從分子結(jié)構(gòu)上看，松果菊苷含有較長的共軛體系和羥基，不穩(wěn)定，在純甲醇中可能發(fā)生異構(gòu)化，可能是造成分裂峰和肩縫的原因；50%的甲醇中含有水有大量的羥基，可能形成分子間氫鍵，使松果菊苷穩(wěn)定加強(qiáng)，峰型變好。實驗過程中，溫度對松果菊苷和毛蕊花糖苷的保留時間影響較大，保持較恒定的溫度較重要，也易于樣品中苯乙醇苷類的鑒別定位。

5 結(jié)論

從實驗的結(jié)果中分析不同市場銷售的肉蓯蓉飲片，福建、江蘇和山東購買的肉蓯蓉飲片為偽品，其他省市購買的肉蓯蓉飲片為正品且其苯乙醇苷類符合藥典要求，但含量差異性較大。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:126.

[2]郭雄飛,吳亞東,倪 慧,等.管花肉蓯蓉不同部位有效成分含量的考察比較[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2012,35(1): 48-50.

[3]夏熱帕提·吐孫.肉蓯蓉的中性和水溶性部位化學(xué)成分研究[D].烏魯木齊:新疆大學(xué),2010.

[4]周玉碧,田永禎,林鵬程,等.肉蓯蓉脂溶性成分分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2010,22(3):450-454.

[5]陳百泉,劉瑜新,康文藝.人工栽培肉蓯蓉保肝和抗氧化活性研究[J].精細(xì)化工,2010,27(4):342-345.

[6]李永超.肉蓯蓉有效部位抗疲勞作用機(jī)制研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué),2007.

[7]周海濤,曹建民,林 強(qiáng).肉蓯蓉對運(yùn)動訓(xùn)練大鼠睪酮含量、物質(zhì)代謝及抗運(yùn)動疲勞能力的影響[J].中國藥學(xué)雜志,2012,47(13):1035-1038.

[8]鞠愛華,敖格日樂圖,周 凱.內(nèi)蒙古鹽生肉蓯蓉中松果菊苷和麥角甾苷的含量測定[J].中華中醫(yī)藥雜志,2011, 26(1):178-180.

[9]馬志國.沙蓯蓉與肉蓯蓉飲片HPLC指紋圖譜鑒別研究[J].中國藥學(xué)雜志,2011,46(12):899-902.

Determination of commercially available Cistanche pieces identification and phenylethanoid glycosides content

LI Hao,XIAO Yang,DUAN Jin-fang,LIU Ying,DOU Zhi-ying
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]Establish commercial Cistanche Pieces of HPLC fingerprint identification cistanche authenticity.Establish HPLC method for the determination of benzene in commercial cistanche glycosides content.[Methods]Standard Cistanche herbs as a reference fingerprint,using high performance liquid chromatography to analyze the fingerprint of Cistanche Pieces;Using Kromasil C18column,methanol:water（containing 0.1%formic acid）for gradient elution and wave length of detection was at 330 nm.[Results]The method precision,stability, good reproducibility,different market purchases of Cistanche fingerprints large differences.Phenylethanoid glycosides determination method meet the requirements.[Conclusion]Cistanche Pieces that purchase in Fujian，Jiangsu and Shandong province identified as counterfeit.Cistanche Pieces of the other provinces glycosides benzene content to purchase to meet the requirements,a preliminary evaluation of the quality to meet the requirements.

HPLC;echinacoside;actcoside;quality evaluation

R284.1

A

1673－9043（2016）06－0409-04

2016-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2016.06.12

科技基礎(chǔ)性工作專項（2014FY111100）。

李 浩（1990-），男，碩士研究生，主要研究方向為中藥炮制和質(zhì)量控制。

竇志英，E-mail：zhiyingdou@163.com。