人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因的構(gòu)建與分析

王孝蕓，藍(lán)楠，張沄，王星，李國(guó)平

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因的構(gòu)建與分析

王孝蕓，藍(lán)楠，張沄，王星，李國(guó)平

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院炎癥與變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室，四川 瀘州 646000)

目的 構(gòu)建人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因并進(jìn)行分析。方法 PCR技術(shù)克隆人MUC5AC啟動(dòng)子[(-1 300)～(+48)bp]長(zhǎng)度片段的基因，將純化的PCR產(chǎn)物與T載體連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并利用酶切和測(cè)序進(jìn)行重組質(zhì)粒鑒定；將該重組質(zhì)?？寺≈羛GL3-ehancer熒光報(bào)告基因載體上，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將熒光報(bào)告基因轉(zhuǎn)染至人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE細(xì)胞)，分別用1 ng/mL的重組細(xì)胞因子IL-4和IL-13刺激細(xì)胞24 h，并設(shè)不做任何處理的對(duì)照組；用Promega雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性(Rlus1/Rlus2)。結(jié)果 人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因構(gòu)建成功，IL-4和IL-13刺激組的相對(duì)熒光素酶活性均高于對(duì)照組[IL-4(21.666 7±2.081 67)，IL-13(26.567 8±1.527 53)，對(duì)照組(8.33±1.527 53)；F=89.815，P= 0.000]。結(jié)論 MUC5AC啟動(dòng)子核心區(qū)域?yàn)?-1 300)～(+48)bp范圍，IL-4和IL-13可作用于該區(qū)域并促進(jìn)MUC5AC高表達(dá)。

MUC5AC；啟動(dòng)子；熒光報(bào)告基因；IL-4；IL-13

氣道黏液高分泌是哮喘的一大特征。黏蛋白是黏液中的主要成分，是一種糖基化蛋白，其編碼基因?yàn)镸UC。MUC5AC是氣道表達(dá)最多的一種蛋白，在氣道杯狀細(xì)胞中高表達(dá)，是黏液增生和化生的標(biāo)志[1-2]。IL-4和IL-13均屬于TH2型細(xì)胞因子，促進(jìn)哮喘的發(fā)生和發(fā)展，對(duì)氣道黏液高分泌有重要調(diào)節(jié)作用。氣道黏液高分泌存在多種作用機(jī)理，如IL-13/IL-4R信號(hào)途徑和表皮因子受體(EGFR)途徑等[3-4]，而具體調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

本研究旨在通過序列分析，構(gòu)建人MUC5AC啟動(dòng)子[(-1 300)～(+48)bp]長(zhǎng)度片段的熒光報(bào)告基因，將該基因轉(zhuǎn)染至16HBE細(xì)胞，并分別用IL-4和IL-13刺激，然后采用Promega雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性，從而確定MUC5AC啟動(dòng)子核心區(qū)域，為今后進(jìn)一步研究其功能和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)及調(diào)控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 限制性內(nèi)切酶(美國(guó)MBI公司)；T4DNA連接酶，dNTP，Taq酶及buffer(中國(guó)Takra公司)；質(zhì)粒小量提取試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒(美國(guó)Omega公司)；質(zhì)粒大量提取試劑盒(中國(guó)Beyotime公司)；動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒，DNA Marker(中國(guó)YRBIO公司)；人重組細(xì)胞因子IL-4、IL-13 (美國(guó)Peprotech公司)；脂質(zhì)體2000(美國(guó)Invitrogen公司)；pMD19-TS載體，pRl-TK質(zhì)粒，pGL3-enhancer (中國(guó)百替公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Promega公司)；16HBE細(xì)胞，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保存)。

1.2 方法

1.2.1 hMUC5AC/-1 300/+48啟動(dòng)子序列調(diào)取

1.2.1.1 A549細(xì)胞基因組DNA提取 收集(1× 106)～(1×107)個(gè)A549細(xì)胞，使用YRBIO動(dòng)物細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒，按照說明書提取基因組DNA。電泳檢測(cè)提取的基因組DNA質(zhì)量。

1.2.1.2 PCR擴(kuò)增MUC5AC基因-1300/+48位啟動(dòng)序列 通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)找到MUC5AC基因序列，根據(jù)資料確定啟動(dòng)子區(qū)域(-1300/+48)[5]，并通過UCSC軟件找到該啟動(dòng)子區(qū)域。用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增-1 300/+48啟動(dòng)子的引物，并分別在上下游引入Knp和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物序列如下：hMUC5AC(-1 300/+48)上游：CGGGTACCAGAGCTTGGGACGGGTCC；hMUC5AC(-1300/+48)下游：CCGCTCGAGTGTGTGGACGGCGGGGAAGA。用高保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×PCR buffer：5 μL；10 μmol/L dNTP：2 μL；10 μmol/L上游引物：0.5 μL；10 μmol/L下游引物：0.5 μL；基因組DNA：0.5 μL；Taq酶：0.5 μL；ddH2O：41 μL；共計(jì)：50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性：5 min；94℃變性：30 s；58℃退火：30 s；72℃延伸：80 s；變性-退火-延伸三步驟重復(fù)循環(huán)35次，最后72℃延伸。

1.2.1.3 PCR產(chǎn)物的純化 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核酸水平電泳，凝膠濃度為1%。電泳30 min后將膠切下用以回收目的基因條帶。

1.2.1.4 PCR產(chǎn)物連接T載體 反應(yīng)體系：MUC5AC/-1300/+48 PCR產(chǎn)物：7 μL；pMD19-TS載體：1 μL；10×緩沖液：1.5 μL；T4DNA連接酶：1 μL；ddH2O：4.5 μL；共計(jì)：15 μL。反應(yīng)條件：將反應(yīng)體系于1.5 mL EP管中輕微混勻，再將該EP管置于低溫恒溫水浴箱，于16℃下進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間過夜，次日混合液直接用于轉(zhuǎn)化。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.1.5 重組質(zhì)粒的鑒定 用KpnⅠ和XhoⅠ做雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物凝膠水平電泳，用凝膠成像儀檢測(cè)DNA片段大小，同時(shí)將鑒定的陽(yáng)性菌種送公司測(cè)序。

1.2.2 pGL3-hMUC5AC/-1300/+48克隆

1.2.2.1 雙酶切中間載體和克隆載體 酶切反應(yīng)體系：①pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48：20 μL；10× buffer：4 μL；10×BSA：4 μL；KpnⅠ：1 μL；Xho I：1 μL；ddH2O：10 μL；共計(jì)：40 μL。②pGL3-enhancer：20 μL；10×buffer：4 μL；10×BSA：4 μL；KpnⅠ：1 μL；Xho I：1 μL；ddH2O：10 μL；共計(jì)：40 μL。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)載體是否切開。酶切反應(yīng)徹底后，用DNA片段快速純化/回收試劑盒回收pGL3-enhancer載體及MUC5AC/-1300/+48條帶。

1.2.2.2 連接反應(yīng) 連接反應(yīng)體系體積15μL：MUC5AC/-1 300/+48酶切產(chǎn)物：7 μL；pGL3-enhancer酶切產(chǎn)物：1 μL；10×buffer：1.5 μL；T4DNA連接酶：1 μL；ddH2O：4.5 μL。反應(yīng)條件同前述連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，操作步驟如前述轉(zhuǎn)化步驟。

1.2.2.3 重組質(zhì)粒鑒定 重組質(zhì)粒鑒定的方法同hMUC5AC/-1300/+48啟動(dòng)子序列調(diào)取時(shí)重組質(zhì)粒鑒定。

1.2.3 人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因檢測(cè)

1.2.3.1 質(zhì)粒大提 碧云天質(zhì)粒大提試劑盒大提pGL3-hMUC5AC/-1300/+48質(zhì)粒和pRL-TK質(zhì)粒：用Bio-Tech核酸定量?jī)x測(cè)定相應(yīng)的DNA濃度。

1.2.3.2 pGL3-hMUC5AC/-1300/+48和pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞 用不含抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基在24孔板內(nèi)培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。等細(xì)胞融合度為80%～90%時(shí)，用Invitrogen脂質(zhì)體2000試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4 h后換含血清的新鮮DMEM培養(yǎng)基。

1.2.3.3 IL-4和IL-13刺激16HBE及熒光報(bào)告基因檢測(cè) 將上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞換不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。分別用濃度為1 ng/mL的IL-4和IL-13刺激細(xì)胞24 h，每種刺激物各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)不做任何處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照。24 h后，用Promega雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，記錄相對(duì)熒光素酶活性Rlus1/Rlus2。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用方差分析法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 A549細(xì)胞基因組DNA提取 電泳檢測(cè)提取的A549細(xì)胞基因組DNA，質(zhì)量較好，效果如圖1。

圖1 電泳檢測(cè)提取的A549細(xì)胞基因組DNA注：M，2 kb plusⅡ；1，基因組DNA。

2.2 MUC5AC/-1300/+48啟動(dòng)子擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增到約1 340 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖2。

圖2 MUC5AC/-1 300/+48 PCR擴(kuò)增結(jié)果注：M，D2000；1，PCR結(jié)果。

2.3 pMD19-TS-MUC5AC/-1 300/+48載體鑒定 將MUC5AC/-1 300/+48片段亞克隆至pMD19-TS載體，陽(yáng)性克隆經(jīng)Knp I和Xho I雙酶切鑒定，可切出約1 340 bp的MUC5AC/-1 300/+48片段條帶和約2.7 kb的載體條帶，見圖3。

圖3 pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48酶切鑒定注：M，2 kb plusⅡ；1，pMD19-TS-MUC5AC/-1 300/+48酶切片段。

2.4 pGL3-MUC5AC/-1 300/+48載體鑒定 將pMD19-TS-MUC5AC/-1300/+48亞克隆pGL3-enhance載體，陽(yáng)性克隆經(jīng)KnpⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，可切出約1 340 bp的MUC5AC/-1 300/+48片段條帶和約5.0 kb的載體條帶，見圖4。

圖4 pGL3-MUC5AC/-1 300/+48酶切鑒定注：M，2 kb plusⅡ；1，pGL3-MUC5AC/-1 300/+48酶切片段。

2.5 相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè) 將構(gòu)建的重組報(bào)告基因轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞，分別用IL-4和IL-13刺激細(xì)胞24 h，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果表明：IL-4和IL-13刺激組的相對(duì)熒光素酶活性均高于對(duì)照組[IL-4 (21.666 7±2.081 67)，IL-13(26.567 8±1.527 53)，對(duì)照組(8.33±1.527 53)；F=89.815，P=0.000＜0.05]，見圖5。

圖5 人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因檢測(cè)

3 討論

哮喘是當(dāng)前世界面臨的重要健康問題。氣道黏液高分泌是哮喘的重要特征，在重癥哮喘發(fā)作時(shí)尤其明顯。如何抑制氣道黏液高分泌成為哮喘防治需解決的關(guān)鍵問題[6]。MUC5AC是一種黏蛋白，編碼基因?yàn)镸UC。已有研究表明，MUC5AC在氣道中表達(dá)最多，對(duì)氣道黏液高分泌有重要作用[2]，因此對(duì)MUC5AC作用機(jī)理的研究對(duì)于哮喘的防治具有重要意義。

基因表達(dá)的調(diào)節(jié)是研究細(xì)胞組織功能的分子基礎(chǔ)，尤其是基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控對(duì)于基因表達(dá)是一種最有效的調(diào)節(jié)方式[7]。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控是真核基因表達(dá)調(diào)控的重要環(huán)節(jié)。研究表明MUC5AC表達(dá)的增加主要依賴于MUC5AC基因的轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)。MUC5AC的啟動(dòng)子區(qū)域有特異性蛋白1(Sp1)和NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)[8-9]。這些轉(zhuǎn)錄因子蛋白的表達(dá)可促進(jìn)MUC5AC啟動(dòng)子的活化，誘導(dǎo)MUC5AC基因轉(zhuǎn)錄，從而促使MUC5AC黏蛋白的高表達(dá)。因此在MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域做哮喘相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)一步探索對(duì)于哮喘黏液高分泌的作用機(jī)制研究具有重要作用。在本次研究中，筆者首先通過NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)找到MUC5AC基因序列，確定MUC5AC的啟動(dòng)子區(qū)域(-1 300/+48)，并通過UCSC軟件找到該啟動(dòng)子區(qū)域。用Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增-1300/+48啟動(dòng)子的引物，通過基因重組及PCR技術(shù)，構(gòu)建了人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因，為后續(xù)哮喘相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的尋找打下基礎(chǔ)。

IL-4和IL-13屬于Th2細(xì)胞因子，對(duì)哮喘的發(fā)生和發(fā)展有促進(jìn)作用，二者均通過IL-4Rα傳遞信號(hào)。IL-4Rα是一種受體復(fù)合物，分為兩類：Ⅰ型(IL-4Rα和γc)及Ⅱ型(IL-4Rα和IL-13Rα1)。IL-4和IL-13共享Ⅱ型受體。IL-4R途徑與STAT6活化有關(guān)。磷酸化的STAT6二聚體向核遷移并與IL-4和IL-13啟動(dòng)子結(jié)合，由此影響Th2細(xì)胞分化，氣道高反應(yīng)和氣道黏液高分泌[10]。Douglas等[11]研究表明，變應(yīng)原誘導(dǎo)的氣道黏液高分泌與Clara細(xì)胞中的IL-4Rα信號(hào)途徑密切相關(guān)。當(dāng)Clara細(xì)胞缺失IL-4Rα?xí)r，小鼠黏液基因的表達(dá)和上皮細(xì)胞中黏液的含量都顯著減少。關(guān)于IL-13，或其相似因子如IL-4等介導(dǎo)的氣道黏液高分泌的研究報(bào)道很多，但結(jié)果都不盡相同。有的研究報(bào)道它們對(duì)黏液產(chǎn)生沒有影響；有的報(bào)道這些細(xì)胞因子會(huì)減少黏液產(chǎn)生和黏蛋白表達(dá)[12]。Atherton等[13]研究報(bào)道只有在低濃度(1 ng/mL)，而不是高濃度(10 ng/mL)時(shí)，細(xì)胞因子才能增加黏液產(chǎn)生。本研究采用濃度為1 ng/mL的重組人IL-4和IL-13細(xì)胞因子，分別刺激轉(zhuǎn)染了人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因的16HBE細(xì)胞，用雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示IL-4和IL-13刺激組的相對(duì)熒光素酶活性要高于對(duì)照組的相對(duì)熒光素酶活性，證明人MUC5AC啟動(dòng)子熒光報(bào)告基因構(gòu)建成功，且表明IL-4和IL-13在MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域有作用位點(diǎn)，具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

本研究通過基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了人MUC5AC啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因，并用細(xì)胞因子IL-4和IL-13對(duì)其進(jìn)行活性分析，為以后在MUC5AC啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)研究哮喘相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子奠定基礎(chǔ)，對(duì)闡明哮喘氣道高分泌作用機(jī)理具有重要作用。

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Construction and analysis of the luciferase reporter gene of human MUC5AC promoter.

WANG Xiao-yun,LAN Nan,ZHANG Yun,WANG Xing,LI Guo-ping.Inflammation&Allergy laboratory,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA

Objective To construct and analyze the luciferase reporter gene of human MUC5AC promoter. Methods Fragment of human MUC5AC promoter[(-1 300)～(+48)bp]was cloned by PCR technology.Purified product of PCR was connected with T vector.The connection product was transformed into Escherichia coli DH5α competent cells and identified by enzyme digestion and sequencing.The recombinant plasmid was cloned into luciferase reporter vector of pGL3-ehancer and transfected into 16HBE cells.Then recombinant cytokines of IL-4 and IL-13 were respectively used to stimulate cells at concentration of 1 ng/mL for 24 hours.Meanwhile,cells without any stimulation were used as control.After 24 hours,cells were tested for relative luciferase activity(Rlus1/Rlus2)by dual luciferase reporter gene detection kit of Promega.Results Human MUC5AC promoter was constructed successfully.Relative luciferase activity(Rlus1/Rlus2)of cells with stimulation of IL-4 and IL-13 was higher than that of control cells[IL-4 (21.666 7±2.081 67),IL-13(26.567 8±1.527 53),(8.33±1.527 53);F=89.815，P=0.000].Conclusion The core region of MUC5AC promoter is in(-1 300)～(+48)bp section.IL-4 and IL-13 have function in such region and promote expression of MUC5AC.

MUC5AC;Promoter;Luciferase reporter gene;IL-4;IL-13

R394

A

1003—6350（2016）15—2409—04

2016-03-11)

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81170032）

李國(guó)平。E-mail：lzlgp@163.com