改進(jìn)HPLC法測定注射用多種維生素（12）中維生素B12的含量

徐家根，刁巖忠（1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院藥學(xué)部，南京 10008；.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，南京 10009）

改進(jìn)HPLC法測定注射用多種維生素（12）中維生素B12的含量

徐家根1＊，刁巖忠2（1.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210008；2.南京優(yōu)科生物醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，南京 210009）

目的：改進(jìn)高效液相色譜法測定注射用多種維生素（12）中維生素B12的含量。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil 100-5 C18，流動相為水（用10%稀磷酸調(diào)節(jié)pH為4.5）-乙腈（梯度洗脫），流速為1.2 ml/min，檢測波長為361 nm，柱溫為35Ⅱ，進(jìn)樣量為50 μl。結(jié)果：維生素B12檢測進(jìn)樣量線性范圍為15.03～45.09 ng（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1%；回收率為99.31%～100.90%（RSD＝0.42%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于注射用多種維生素（12）中維生素B12的含量測定。

注射用多種維生素（12）；維生素B12；含量測定；高效液相色譜法；方法改進(jìn)

維生素B12（Vitamin B12）又稱氰鈷胺素（Cyanocobalamin）[1]，是人體必需的水溶性維生素之一[2]，參與體內(nèi)多種代謝，還可有效預(yù)防惡性貧血、老年癡呆、抑郁癥等疾病，對保持人體健康起著重要作用[3]。維生素B12原料藥及單方制劑標(biāo)準(zhǔn)在《中國藥典》《美國藥典》《歐洲藥典》《日本藥典》中均有收載，但均采用紫外-可見分光光度法測定含量，該方法專屬性差，干擾因素多。國內(nèi)外上市的注射用復(fù)合維生素制劑有注射用水溶性維生素、注射用12種復(fù)合維生素、注射用多種維生素（12）、多種維生素注射液（13）[4-5]等。這些制劑的標(biāo)準(zhǔn)均為國家藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)[6-8]，尚無藥典標(biāo)準(zhǔn)；國家藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)[9]中，均

1 材料

1.1 儀器

LC-20AB型HPLC儀，包括CBM-20A系統(tǒng)控制器、DGU-20A3真空脫氣機(jī)、SPD-M20A二極管陣列檢測器、LC-20AB輸液單元、SIL-20AC自動進(jìn)樣器、CTO-20AC柱溫箱、LabSolutions色譜工作站（日本島津公司）；XS205型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

注射用多種維生素（12）（南京優(yōu)科制藥有限公司，批號：20130201、20130202、20130203，規(guī)格：復(fù)方）；維生素B12對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100248-200802，純度：95.5%）；乙腈（色譜純，美國Sigma公司）；磷酸為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil 100-5 C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：水（用10%稀磷酸調(diào)節(jié)pH為4.5）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 min，91.5%A；25.00 min，91.5%A；30.00 min，20.0%A；40.00 min，20.0%A；40.01 min，91.5%A）；流速：1.2 ml/min；檢測波長：361 nm；柱溫：35Ⅱ；進(jìn)樣量：50 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取維生素B12對照品約12 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置于200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml約含維生素B120.6 μg的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品內(nèi)容物約650 mg，置于10 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 陰性對照溶液 按樣品的配方比例取不含維生素B12的空白制劑（含處方中的其他維生素主成分及所有輔料）約650 mg，置于10 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，維生素B12與其他維生素主成分及輔料之間均能達(dá)到基線分離，分離度＞2.0；理論板數(shù)以維生素B12峰計(jì)為12 395，保留時(shí)間為22.6 min。結(jié)果表明，輔料及其他維生素主成分對維生素B12的測定無干擾。

2.4 破壞性試驗(yàn)

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.陰性對照；B.對照品；C.供試品；1.維生素B12Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.negative control；B.reference substance；C.test sample；1.vitamin B12

為驗(yàn)證降解產(chǎn)物與維生素B12主峰的分離度情況，對本品進(jìn)行破壞性試驗(yàn)。（1）酸破壞溶液：取樣品內(nèi)容物約650 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液1 ml，于室溫下放置4 h后用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；（2）堿破壞溶液：取樣品內(nèi)容物約650 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液1 ml，于室溫下放置2 min后用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至中性，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；（3）氧化破壞溶液：取樣品內(nèi)容物約650 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加30%過氧化氫溶液1 ml，于室溫下放置2 h后加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；（4）高溫破壞溶液：取樣品內(nèi)容物約650 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加水1 ml，于80Ⅱ水浴加熱10 min后取出，放冷，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得；（5）光照破壞溶液：取樣品內(nèi)容物約650 mg，精密稱定，置于10 ml量瓶中，加水1 ml，于室溫下在5 000 lx強(qiáng)光下照射4 h后，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。取各破壞溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，本品在酸、堿、氧化、高溫及光照破壞條件下均有不同程度的破壞，維生素B12含量均有下降；其中，堿破壞條件降解幅度最大，其次為氧化、光照和酸破壞，各降解產(chǎn)物峰與維生素B12峰分離度均符合要求。

2.5 線性關(guān)系考察

取維生素B12對照品約12 mg，精密稱定，置于100 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 ml，置于50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。精密量取對照品貯備液適量，分別加水稀釋制成每1 ml中約含維生素B120.30、0.48、0.60、0.72、0.90 μg的系列線性工作溶液。精密量取上述溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以維生素B12進(jìn)樣量（x，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得維生素B12的回歸方程為y＝952.2x+ 243.2（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，維生素B12檢測進(jìn)樣量線性范圍為15.03～45.09 ng。

2.6 定量限與檢測限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限為4.355 ng；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測限為1.452 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B12峰面積的RSD＝0.21%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖A.酸破壞；B.堿破壞；C.氧化破壞；D.高溫破壞；E.光照破壞；1.維生素B12Fig 2 HPLC chromatogram of destructive testsA.destructed by acid；B.destructed by alkali；C.destructed by oxidation；D.destructed by high temperature；E.destructed by light；1.vitamin B12

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（批號：20130201）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B12峰面積的RSD＝0.31%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20130201）適量，共6份，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，維生素B12峰面積的RSD＝0.29%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

取“2.2.3”項(xiàng)下陰性對照溶液適量，加入一定質(zhì)量的維生素B12對照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成80%、100%、120%的低、中、高質(zhì)量濃度的溶液。取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算維生素B12的回收率，結(jié)果見表1。試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算維生素B12的含量。結(jié)果，3批樣品（批號：20130201、20130202、20130203）中維生素B12的含量分別為100.4%、100.7%、100.1%（n＝3）。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

3 討論

3.1 流動相的選擇

有文獻(xiàn)[6]采用0.001 5 mol/L己烷磺酸鈉-甲醇（83∶17，V/V）為流動相，而該系統(tǒng)中的離子對試劑對HPLC儀有損傷，且重復(fù)性差。也有文獻(xiàn)[9]采用0.02 mol/L磷酸氫二鈉溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為3.5）-甲醇（74∶26，V/V）為流動相，或采用0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH為6.4）-乙腈（90∶10，V/V）為流動相[10]，而這些系統(tǒng)中的緩沖鹽可縮短色譜柱的使用壽命，同時(shí)易造成HPLC儀的堵塞。為延長色譜柱的使用壽命，減少對HPLC儀的損傷，降低檢驗(yàn)成本，本試驗(yàn)采用水（用10%稀磷酸調(diào)節(jié)pH為4.5）-乙腈（梯度洗脫）為流動相，可縮短分析時(shí)間，且各色譜峰的分離度均較好。

3.2 檢測波長的選擇

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，進(jìn)行全波長紫外掃描。結(jié)果，維生素B12在278、361、550 nm波長處有最大吸收，但在361 nm波長處的吸收值最大。結(jié)合各國藥典中維生素B12含量測定項(xiàng)下檢測波長，最終確定本試驗(yàn)的檢測波長為361 nm。

綜上所述，本方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于注射用多種維生素（12）中維生素B12的含量測定。

[1] 劉惠，張穎，薛稚明，等.食物中維生素B12的測定方法研究進(jìn)展[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2013，23（11）：2 556.

[2] 秦尚.淺談維生素與人體健康[J].中國醫(yī)藥指南，2015，13（28）：294.

[3] 馮曉葶.維生素B12缺乏與相關(guān)疾病的關(guān)系[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2014，17（1）：96.

[4] 白靖，何朝星，向柏，等.維生素制劑學(xué)研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（16）：1 396.

[5] 中華醫(yī)學(xué)會腸外腸內(nèi)營養(yǎng)學(xué)分會，北京醫(yī)學(xué)會腸外腸內(nèi)營養(yǎng)學(xué)分會.維生素制劑臨床應(yīng)用專家共識[J].中華外科雜志，2015，53（7）：481.

[6] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH06412009 [S].2009.

[7] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)YBH36742005 [S].2009.

[8] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-784（X-629）-2001（2）[S].2009.

[9] 宋新康，姚海燕，陳彤.HPLC法測定維生素B12片含量及含量均勻度[J].中國藥師，2014，17（9）：1 598.

[10] 宋金春，陸迅，曾俊芬，等.HPLC測定注射用13種復(fù)合維生素中維生素H、葉酸及維生素B12含量[J].中國藥學(xué)雜志，2007，42（17）：1 345.

（編輯：劉 柳）

2.11 樣品含量測定

取3批樣品內(nèi)容物各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供

Improvement of the Method for Content Determination of Vitamin B12in Multivitamin for Injection（12）by HPLC

XU Jiagen1，DIAO Yanzhong2（1.Dept.of Pharmacy，Stomatological Hospital Affiliated to Medical College of Nanjing University，Nanjing 210008，China；2.Nanjing YOKO Pharmaceutical Group Co.，Ltd.，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To improve the method for the content determination of vitamin B12in Multivitamin for injection（12）.METHODS：HPLC was performed on the column of Kromasil 100-5 C18with mobile phase of water（adjusted to pH4.5 with 10%diluted phosphoric acid）-acetonitrile（gradient elution）at a flow rate of 1.2 ml/min，the detection wavelength was 361 nm，column temperature was 35Ⅱ，and injection volume was 50 μl.RESULTS：The linear range of vitamin B12was 15.03-45.09 ng（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no lower than 1%；recovery was 99.31%-100.90%（RSD＝0.42%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，sensitive，reproducible，and can be used for the content determination of vitamin B12in Multivitamin for injection（12）.

Multivitamin for injection（12）；Vitamin B12；Content determination；HPLC；Method improvement

R917；R927.2

A

1001-0408（2016）36-5159-03

2016-05-25

2016-09-27）

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2016.36.38

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：025-83620369。E-mail：Xjg.234@163.com采用高效液相色譜法（HPLC），以等度洗脫的方式測定上述制劑中維生素B12的含量，但由于其流動相中含有大量緩沖鹽和離子對試劑，對色譜柱和儀器損傷較大，同時(shí)大部分脂溶性主成分及輔料會在色譜柱中殘留，累積產(chǎn)生污染，導(dǎo)致方法準(zhǔn)確度、重復(fù)性差。另有文獻(xiàn)[10]介紹了同時(shí)測定多種維生素的方法，但在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其他維生素主成分對維生素B12含量測定有明顯干擾。為消除測定干擾，延長色譜柱使用壽命，減少對HPLC儀的損傷，縮短分析時(shí)間，降低檢驗(yàn)成本，筆者對注射用多種維生素（12）中維生素B12的含量測定方法進(jìn)行了改進(jìn)，采用HPLC法以梯度洗脫的方式進(jìn)行測定。