飛機(jī)草總黃酮提取工藝及其急性毒性研究

王小寧， 陳進(jìn)軍， 葉紹棠， 鄭錦慶， 鞏棟梁， 俞云鵬， 林紅英

(廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東湛江 524088)

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飛機(jī)草總黃酮提取工藝及其急性毒性研究

王小寧， 陳進(jìn)軍， 葉紹棠， 鄭錦慶， 鞏棟梁， 俞云鵬， 林紅英*

(廣東海洋大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，廣東湛江 524088)

摘要[目的]優(yōu)化飛機(jī)草總黃酮提取工藝，并研究飛機(jī)草總黃酮提取物對(duì)小鼠的急性毒性。[方法]以飛機(jī)草總黃酮提取率為關(guān)鍵指標(biāo)，采用超聲波輔助乙醇溶劑提取法，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度等提取條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選飛機(jī)草總黃酮提取的最佳工藝；以昆明種小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行飛機(jī)草總黃酮提取物口服急性毒性試驗(yàn)，測定半數(shù)致死LD50和最大耐受量。[結(jié)果]飛機(jī)草總黃酮的最佳提取工藝為提取時(shí)間5 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶60(g∶mL)、乙醇濃度70%，飛機(jī)草總黃酮提取率為7.13%；飛機(jī)草總黃酮提取物對(duì)昆明種小鼠的口服LD50未測得，其小鼠口服最大耐受量為80 000 mg/kg。[結(jié)論]飛機(jī)草總黃酮屬于實(shí)際無毒物質(zhì)。

關(guān)鍵詞飛機(jī)草；總黃酮；提取工藝；急性毒性；小鼠

飛機(jī)草(EupatoriumodoratumLinn)別名香澤蘭，是菊科澤蘭屬多年生草本或亞灌木植物，原產(chǎn)于中、南美洲，1934年在云南首次發(fā)現(xiàn)[1]，已快速蔓延至廣東、海南等華南廣大地區(qū)，是我國外來入侵種中危害最為嚴(yán)重的植物之一。迄今從飛機(jī)草中分離、鑒定出的化學(xué)成分主要有黃酮類、萜類、揮發(fā)油和植物甾醇類，未檢出糖類和生物堿類，其中黃酮類化合物含量特別豐富[2-5]。黃酮類化合物是一類多酚類物質(zhì)，廣泛存在于高等植物及以植物為原料的食品中，具有清除自由基、抗炎、抗菌、抗病毒等生物活性，是一類極具開發(fā)前景的天然藥物[6-8]。

飛機(jī)草入侵性極強(qiáng)，可入侵草地、農(nóng)田、林地等，并很快成為優(yōu)勢(shì)種群。飛機(jī)草能產(chǎn)生化感物質(zhì)，抑制鄰近植物的生長，對(duì)畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和生物多樣性產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害，還會(huì)造成二次環(huán)境污染(如化學(xué)除草劑)和生態(tài)破壞(如挖除)[9]。飛機(jī)草提取物對(duì)害蟲具有良好的產(chǎn)卵驅(qū)避作用和殺蟲、抑菌作用，其葉的浸提液抑制作用最大[10]。飛機(jī)草還具有散瘀、消腫、解毒和止血功效，主要用于跌打腫痛、瘡瘍腫毒、皮炎和外傷出血等，是我國民間常用草藥之一[10-11]。此外，飛機(jī)草的提取物可抑制綠膿桿菌、大腸桿菌、淋球菌、金黃色葡萄球菌等的生長，并對(duì)傷口的愈合具有一定的治療效果[11]。因此，對(duì)飛機(jī)草進(jìn)行藥學(xué)和毒性研究是將其“變害為寶”的有益嘗試。筆者采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取條件進(jìn)行篩選，優(yōu)化飛機(jī)草總黃酮提取工藝，探索提取飛機(jī)草總黃酮的最佳條件，并對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取物進(jìn)行小鼠口服急性毒性試驗(yàn)，進(jìn)而為飛機(jī)草總黃酮提取物在臨床用藥劑量及其不良反應(yīng)監(jiān)測提供試驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。飛機(jī)草，于夏季采自廣東省湛江市湖光巖東，經(jīng)廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物學(xué)教研室鑒定為飛機(jī)草(EupatoriumodoratumLinn)。普通級(jí)昆明種小鼠，80只，雌雄各半，體重為 18~22 g，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飛機(jī)草總黃酮提取物，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出的最優(yōu)提取工藝流程得到飛機(jī)草乙醇提取物溶液，根據(jù)小鼠急性毒性試驗(yàn)要求，配置成相應(yīng)濃度溶液分裝于試管中，進(jìn)行密封保存于4 ℃冰箱中冷藏，用于小鼠急性毒性試驗(yàn)。

1.1.2儀器。YS-701型超微粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；電子分析天平(AY120)，日本島津電子科技有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司(頻率40 kHz)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA)，上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水多用真空泵(SHZ-Ⅱ)，河南鞏義市英峪予華儀器廠；分光光度計(jì)(V-1000型)，翱藝儀器(上海)有限公司。

1.1.3試劑。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(MUST-14082710，世紀(jì)奧科廣州分公司)；無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁，均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2方法

1.2.1單因素試驗(yàn)。

1.2.1.1提取時(shí)間對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥恒重的飛機(jī)草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預(yù)先輔助提取(超聲波輔助條件為時(shí)間30 min、溫度30 ℃、功率300 W)[12-13]，然后在60%乙醇、料液比1∶40、溫度70 ℃條件下提取2、3、4、5、6、7 h，測定飛機(jī)草總黃酮的提取率。

1.2.1.2提取溫度對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥恒重的飛機(jī)草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預(yù)先輔助提取，在60%乙醇、料液比1∶40、不同溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)的條件下提取4 h，測定飛機(jī)草總黃酮的提取率。

1.2.1.3料液比對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥恒重的飛機(jī)草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預(yù)先輔助提取，在60%乙醇、溫度70 ℃、不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)的條件下提取4 h，測定飛機(jī)草總黃酮的提取率。

1.2.1.4乙醇濃度對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥恒重的飛機(jī)草6份，分別置于圓底燒瓶中，先用超聲波預(yù)先輔助提取，在不同乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%、90%)、料液比1∶40、溫度70 ℃的條件下提取4 h，測定飛機(jī)草總黃酮的提取率。

1.2.2正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上確定正交試驗(yàn)工藝參數(shù)范圍，進(jìn)行正交試驗(yàn)，設(shè)計(jì)提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度4個(gè)因素，以飛機(jī)草總黃酮提取率為指標(biāo)，進(jìn)行 L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平如表1所示。若該正交試驗(yàn)未出現(xiàn)最佳提取條件組合，則進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證性試驗(yàn)，綜合判定和選擇優(yōu)化提取條[14]。

表1飛機(jī)草總黃酮提取工藝正交因素水平

Table 1Factors and levels of orthogonal test of the extraction technology of total flavonoids fromEupatoriumodoratumLinn

水平Level因素FactorA(提取時(shí)間Extractiontime)∥hB(提取溫度Extractiontemperature)∥℃C(料液比Solid-liquidratio)D(乙醇濃度Ethanolconcentration)%15601∶405026701∶506037801∶6070

1.2.3蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確量取烘箱干燥、恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 20 mg，用 20%乙醇超聲波溶解，并定容至250 mL，配成 0.08 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分別于 25 mL容量瓶中，加入0.05 g/mL亞硝酸鈉1.0 mL，混合均勻，靜置 5 min，加入0.10 g/mL的硝酸鋁 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加入0.04 g/mL的氫氧化鈉 10 mL，加入體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇定容至 25 mL，搖勻，放置 10 min，于 510 nm波長處測定吸光度[15]，以空白試劑為參比液。橫坐標(biāo)為蘆丁濃度、縱坐標(biāo)為吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用 Excel線性回歸得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.587x-0.002 8(R2=0.998 9)，可見蘆丁檢測濃度范圍在 0.001 4~0.019 6 mg/mL吸光度與蘆丁的含量呈線性關(guān)系(圖1)。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin

1.2.4飛機(jī)草總黃酮提取率的測定。飛機(jī)草總黃酮提取率測定方法采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法[16-17]。將2 g粉末狀飛機(jī)草提取物加入蒸餾水定容至 250 mL，準(zhǔn)確吸取 1 mL于 25 mL的容量瓶中，加入0.05 g/mL亞硝酸鈉1.0 mL，搖勻，放置 5 min，加入0.10 g/mL的硝酸鋁1.0 mL，搖勻，放置6 min，加入0.04 g/mL的氫氧化鈉 10 mL，搖勻，放置10 min，于 510 nm波長處測定吸光度。同時(shí)以空白試劑作為參比液，由制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線算出總黃酮提取率。飛機(jī)草總黃酮提取率= (A+0.002 8)×25×250×100/(11.587×1 000×2),式中,A為吸光度值。

1.2.5飛機(jī)草總黃酮提取物L(fēng)D50測定。

1.2.5.1預(yù)試驗(yàn)。取小鼠 9只，雌雄兼有，隨機(jī)等分為 3組，分別按 0、5 000、10 000 mg/kg灌服飛機(jī)草總黃酮提取物。給藥后 3~4 h復(fù)食，停藥 7 d期間觀察并記錄中毒狀況、死亡時(shí)間及數(shù)量[18]。

1.2.5.2正式試驗(yàn)。取小鼠50只，隨機(jī)等分為空白對(duì)照組和 4個(gè)試驗(yàn)組，每組 10只，雌雄各半。小鼠禁食 8 h后進(jìn)行經(jīng)口給藥，分別對(duì)試驗(yàn)組Ⅰ、試驗(yàn)組Ⅱ、試驗(yàn)組Ⅲ和試驗(yàn)組Ⅳ小鼠按 10 240、12 800、16 000、20 000 mg/kg(組間劑量比為1∶0.8[19])灌服飛機(jī)草總黃酮提取物，對(duì)照組小鼠灌服等量飲用水。給藥后 3~4 h復(fù)食，停藥 7 d期間觀察小鼠精神、食欲、飲水、糞便、活動(dòng)等情況，記錄中毒狀況、死亡時(shí)間及數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)束后，剖檢各組小鼠[18]。

1.2.5.3最大耐受量的測定。取小鼠 20只，隨機(jī)等分為 1個(gè)空白對(duì)照組及 1個(gè)試驗(yàn)組，每組 10只，雌雄各半。小鼠禁食 8 h后進(jìn)行經(jīng)口給藥，試驗(yàn)組以 1 d內(nèi)按最大給藥濃度(20 000 mg/kg)、最大給藥劑量(40 mL/kg)灌胃一次。對(duì)照組給予同量飲用水。給藥后 3~4 h復(fù)食，停藥 7 d期間觀察小鼠精神、食欲、飲水、糞便、活動(dòng)等情況，記錄中毒狀況、死亡時(shí)間及數(shù)量。試驗(yàn)結(jié)束后，剖檢各組小鼠。

1.3數(shù)據(jù)分析采用Excel、SPSS19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和表圖制作。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1提取時(shí)間對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，飛機(jī)草總黃酮提取率逐漸增大，在6 h達(dá)最大值，為 7.08%，繼續(xù)增加時(shí)間，總黃酮提取率反而降低。因此 6 h為提取的最優(yōu)時(shí)間。

圖2　提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2　Effects of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.1.2提取溫度對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，隨著提取溫度的升高，飛機(jī)草總黃酮提取率逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá) 70 ℃時(shí)，飛機(jī)草的總黃酮提取率達(dá)最大值，為 6.81%。

圖3　提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3　Effects of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.1.3料液比對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。由圖4可知，在一定范圍內(nèi)，隨著料液比的增加，飛機(jī)草總黃酮提取率先增加后減少，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)飛機(jī)草總黃酮提取率達(dá)最大值(7.05%)。

圖4　料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4　 Effects of solid-liquid rate on the extraction rate of total flavonoids

2.1.4乙醇濃度對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率的影響。由圖5可知，在一定范圍內(nèi)，飛機(jī)草總黃酮提取率隨著乙醇濃度升高而升高。提高乙醇濃度達(dá) 60%時(shí)，飛機(jī)草總黃酮提取率為最大值(6.62%)，繼續(xù)提高濃度，總黃酮提取率反而下降。因此乙醇濃度60%為最佳提取濃度。

圖5　乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.5　Effects of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2正交試驗(yàn)結(jié)果從表2可知，每個(gè)因素對(duì)飛機(jī)草總黃酮提取率均有一定的影響，各因素對(duì)總黃酮提取率影響的相關(guān)性排列順序?yàn)镃>D>A>B，即料液比>乙醇濃度>提取時(shí)間>提取溫度，各因素最佳提取條件組合為A1B2C3D3，即提取時(shí)間5 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶60、乙醇濃度70%。由于正交試驗(yàn)中不包含A1B2C3D3組合，因而又進(jìn)行了相關(guān)驗(yàn)證性試驗(yàn)[14]，進(jìn)行了3次平行試驗(yàn)，通過驗(yàn)證試驗(yàn)，在A1B2C3D3組合下的飛機(jī)草總黃酮得率為7.13%，高于正交試驗(yàn)中最高值。說明利用正交試驗(yàn)優(yōu)化飛機(jī)草總黃酮提取工藝成功。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3飛機(jī)草總黃酮提取物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果 在預(yù)試驗(yàn)中小鼠無死亡，且剖檢無明顯病理變化，可知飛機(jī)草乙醇提取物L(fēng)D50>10 000 mg/kg[18]。在半數(shù)致死量測定的正式試驗(yàn)中，小鼠無死亡，剖檢無明顯病理變化，未測出LD50，說明LD50> 20 000 mg/kg[20]。

3結(jié)論與討論

飛機(jī)草黃酮類化合物含量豐富，具有較高的利用價(jià)值。該研究采用超聲波輔助乙醇浸提法提取飛機(jī)草總黃酮，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和L9(34)正交試驗(yàn)，得到最佳提取條件組合為A1B2C3D3，即提取時(shí)間5 h、提取溫度70 ℃、料液比1∶60、乙醇濃度70%，且提取的飛機(jī)草總黃酮得率為7.13%。優(yōu)化后的提取工藝與王韻等[4,20-22]研究的結(jié)果相比，降低了提取溫度，節(jié)約能源，降低了提取工藝成本，適合提取飛機(jī)草總黃酮。

飛機(jī)草總黃酮對(duì)小鼠經(jīng)口急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明在預(yù)試驗(yàn)中小鼠無死亡，且剖檢無明顯病理變化，根據(jù)化合物經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[23]，一次經(jīng)口LD50>15 000 mg/kg，說明是無毒物質(zhì)。在該研究中，因未測出LD50，故在1 d內(nèi)以最大給藥濃度(20 000 mg/kg)、小鼠最大口服容量(40 mL/kg)灌服藥物1次，供試小鼠在7 d觀察期中均無出現(xiàn)死亡，精神、飲水、采食和活動(dòng)等均良好，偶見稀便，且剖檢無明顯病理變化。根據(jù)最大給藥濃度和最大給藥體積[24-25]，計(jì)算得小鼠口服飛機(jī)草總黃酮提取物的最大耐受量為80 000 mg/kg，表明飛機(jī)草總黃酮屬于實(shí)際無毒物質(zhì)。

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Extraction Trocess Optimization and Acute Toxicity of Total Flavones fromEupatoriumodoratumLinn

WANG Xiao-ning,CHEN Jin-jun,YE Shao-tang,LIN Hong-ying*et al (Dept.of Veterinary Medicine,Guangdong Ocean University,Zhanjiang,Guangdong 524088)

Abstract[Objective]To optimize the extraction process of total flavones fromEupatoriumodoratumLinn and study the acute toxicity of the total flavones extract to mice.[Method] The extraction yield of the total flavones was taken as the key index,using the ultrasonic assisted ethanol solvent extraction method,the extraction time,extraction temperature,liquid to solid ratio and ethanol concentration were optimized through single factor test and orthogonal test design,the optimum process of the total flavones extract fromEupatoriumodoratumLinn was selected.And a range of KM mice were orally administered with the total flavones extract fromEupatoriumodoratumLinn to determine the median lethal dose (LD50) and maximum tolerated dose.[Result]The optimized extraction process for the total flavones fromwere the extraction time of 5 h,extraction temperature of 70 ℃,liquid to solid ratio of 1∶60 and solvent of 70% ethanol,and the total flavones extraction rate was 7.13%.The oral acute toxicity of the total flavones extracted fromEupatoriumodoratumLinn to KM mice was not determined and the maximum tolerated dose was 80 000 mg/ml.[Conclusion]The total flavones fromEupatoriumodoratumLinn was the actual non-toxic substances.

Key wordsEupatoriumodoratumLinn;Total flavones;Extraction process;Acute toxicity;Mice

收稿日期2015-12-24

作者簡介王小寧(1988-)，女，山西朔州人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)。*通訊作者，副教授，從事動(dòng)物醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)競爭性分配項(xiàng)目(A14031)。

中圖分類號(hào)S 567.23+9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611(2016)02-162-04