泥鰍二倍體和四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育特征觀察

王雨辰， 練青平， 李 倩， 劉士力， 宓國(guó)強(qiáng)， 胡廷尖

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所， 浙江 湖州 313001)

泥鰍二倍體和四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育特征觀察

王雨辰， 練青平， 李 倩， 劉士力， 宓國(guó)強(qiáng)， 胡廷尖*

(浙江省淡水水產(chǎn)研究所， 浙江 湖州 313001)

為泥鰍多倍體育種及新品種的培育提供參考，在水溫為(26±0.5)℃條件下，對(duì)泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)二倍體、四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育過(guò)程及發(fā)育特征進(jìn)行觀察比較。結(jié)果表明:二倍體、四倍體、正交F1和反交F1受精卵分別經(jīng)過(guò)26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜，其發(fā)育過(guò)程和發(fā)育時(shí)序基本相同，受精發(fā)育經(jīng)過(guò)卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期、孵化出膜期等階段，各發(fā)育分期除發(fā)育時(shí)間不同外，其發(fā)育特征和發(fā)育分期沒(méi)有明顯差異。二倍體、四倍體初孵仔魚(yú)體長(zhǎng)分別為(2.56±0.121)mm和(3.145±0.277)mm,仔魚(yú)形態(tài)差別不大；正交F1仔魚(yú)和二倍體仔魚(yú)的形態(tài)特征基本相同，反交F1和四倍體仔魚(yú)基本相同。

泥鰍； 二倍體； 四倍體； 正反交； 胚胎發(fā)育

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鰍科(Cobitidae)、花鰍亞科(Cobitinae)、泥鰍屬(Misgurnus)[1]，其廣泛分布于我國(guó)各水系及附屬水域，棲息于稻田、河溝和池塘的底層，體型小，數(shù)量多，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，素有“水中人參”的美譽(yù)[2]。近年來(lái)，由于捕撈強(qiáng)度過(guò)大和自然環(huán)境的惡化，泥鰍自然野生資源不斷減少，在全國(guó)掀起了養(yǎng)殖泥鰍熱潮，雖然商品泥鰍的養(yǎng)殖取得了一定成功，但是泥鰍的苗種培育技術(shù)一直難以達(dá)到泥鰍產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)要求。目前，有關(guān)泥鰍的研究主要在生物學(xué)特性、早期胚胎發(fā)育、人工繁殖技術(shù)、養(yǎng)殖技術(shù)、多倍體育種和遺傳基因等方面[3-18]，而有關(guān)泥鰍多倍體雜交育種及胚胎發(fā)育方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。為探明泥鰍多倍體育種技術(shù)的可行性，筆者進(jìn)行了泥鰍正常二倍體和四倍體的雜交研究，同時(shí)對(duì)二倍體、四倍體和正反交F1的胚胎發(fā)育進(jìn)行觀察，比較其胚胎發(fā)育差異，以期為泥鰍的多倍體育種及新品種的培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 親魚(yú)培育

二倍體泥鰍為購(gòu)自浙江德清鐘管鎮(zhèn)附近河道的野生泥鰍，規(guī)格為15～20 g/尾；四倍體泥鰍為采集自湖北長(zhǎng)湖荊州段的野生泥鰍，規(guī)格為15～20 g/尾，均為2齡以上。

1.2 受精卵的獲得及孵化條件

2014年6月5—6日選取性腺成熟度好，黏液較多，健壯、體表無(wú)傷的試驗(yàn)?zāi)圉q，采用絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物(LHRH-A2)和地歐酮(DOM)在濃度為7‰的生理鹽水中混合溶解制成催產(chǎn)試劑，進(jìn)行人工催情。雌鰍每尾一次性注射0.5 mL，雄鰍劑量減半，后放入聚乙烯網(wǎng)箱中，用微流水進(jìn)行刺激。待效應(yīng)時(shí)間到達(dá)后，采用常規(guī)人工干法授精分別獲得二倍體、四倍體及二倍體和四倍體正反交F1的受精卵，分別將受精卵放入孵化桶中孵化，利用加熱棒控制水溫在(26.5±0.5)℃。

1.3 胚胎發(fā)育觀察

受精卵受精后在體視顯微鏡下對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程進(jìn)行連續(xù)觀察，每次取50粒受精卵，以50%以上受精卵進(jìn)入某個(gè)期記作該期的發(fā)育時(shí)間，并用CCD進(jìn)行拍照。同時(shí)，胚胎每進(jìn)入一個(gè)新的發(fā)育時(shí)期，取部分受精卵并用5%甲醛溶液進(jìn)行固定，以便日后復(fù)查。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)序胚胎發(fā)育特征

水溫在(26.5±0.5)℃條件下，二倍體、四倍體、正交F1和反交F1受精卵分別經(jīng)過(guò)26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜(表1)。根據(jù)胚胎發(fā)育特征，將泥鰍二倍體、四倍體和正反交F1的受精卵胚胎發(fā)育分為7個(gè)發(fā)育階段和26個(gè)發(fā)育分期，其發(fā)育分期的基本形態(tài)相似。

表 試驗(yàn)?zāi)圉q的胚胎發(fā)育時(shí)序

2.1.1 卵裂前期 二倍體和四倍體泥鰍受精卵為球形，卵膜透明，金黃色，微粘性(圖版-1、2)。正交F1和二倍體的受精卵大小一致，為(1.023±0.411)mm(圖版-3)。反交F1和四倍體的受精卵大小一致，為(1.35±0.037)mm(圖版-4)。受精卵的原生質(zhì)由植物極向動(dòng)物極流動(dòng)，并在動(dòng)物極形成隆起，形狀似盤，此時(shí)進(jìn)入胚盤期(圖版-5)。該階段各組胚胎發(fā)育形態(tài)相似，但是其發(fā)育速度不同，發(fā)育速度次序?yàn)樗谋扼w>二倍體>反交F1>正交F1。

2.1.2 卵裂期 四倍體泥鰍受精卵受精后29 min開(kāi)始卵裂，胚盤分裂成2個(gè)大小相等的分裂球，此后繼續(xù)分裂進(jìn)入4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期、32細(xì)胞期、64細(xì)胞期(圖版-6～10)，隨著細(xì)胞繼續(xù)分裂，分裂球分裂越來(lái)越小，細(xì)胞分裂形狀似桑椹狀，此時(shí)進(jìn)入桑椹期(圖版-11)。在此發(fā)育期內(nèi)，胚胎發(fā)育形態(tài)上差異不大，但時(shí)間有所區(qū)別，二倍體發(fā)育速度相對(duì)快，發(fā)育速度次序?yàn)槎扼w>反交F1>正交F1>四倍體。

2.1.3 囊胚期 隨著細(xì)胞分裂繼續(xù)進(jìn)行，細(xì)胞界線不清晰，在動(dòng)物極形成囊胚層被高高舉起，形似帽狀，此時(shí)進(jìn)入高囊胚期(圖版-12)。后囊胚層的高度下降，細(xì)胞分裂進(jìn)一步變小，此時(shí)進(jìn)入低囊胚期(圖版-13)。此期形態(tài)相似，發(fā)育時(shí)間不同，發(fā)育速度次序?yàn)槎扼w>四倍體>反交F1>正交F1。

2.1.4 原腸胚期 按胚層下包的狀態(tài)分為早、中、晚3期。當(dāng)囊胚層下包1/3～1/2時(shí)，出現(xiàn)胚環(huán)，此時(shí)進(jìn)入原腸早期(圖版-14、15)。當(dāng)囊胚層下包達(dá)2/3時(shí)，出現(xiàn)胚盾，即進(jìn)入原腸中期(圖版-16、17)。當(dāng)囊胚層下包達(dá)3/4時(shí)，此時(shí)進(jìn)入原腸晚期(圖版-18)。此期發(fā)育速度次序?yàn)槎扼w>四倍體>正交F1>反交F1。

2.1.5 神經(jīng)胚期 當(dāng)囊胚層下包達(dá)4/5時(shí)，神經(jīng)板形成，胚環(huán)一端膨大為頭部，即進(jìn)入神經(jīng)胚期(圖版-19)。當(dāng)胚層幾乎包裹住整個(gè)卵黃時(shí)，胚孔關(guān)閉，胚體雛形形成，胚體側(cè)臥，此時(shí)進(jìn)入胚孔封閉期(圖版-20)。此期發(fā)育速度次序?yàn)檎籉1>二倍體>四倍體>反交F1。

2.1.6 器官形成期 在胚體中部出現(xiàn)肌節(jié)3～4對(duì)，同時(shí)頭部稍隆起，此時(shí)進(jìn)入肌節(jié)出現(xiàn)期(圖版-21、22)。在胚體前端出現(xiàn)1對(duì)腎形突起(眼原基)，肌節(jié)出現(xiàn)6～7對(duì)，此時(shí)進(jìn)入眼基出現(xiàn)期(圖版-23)。在胚體前端，出現(xiàn)長(zhǎng)橢圓形且透明的眼囊，肌節(jié)出現(xiàn)8～9對(duì)，腦可分為前中后3部分，此時(shí)進(jìn)入眼囊期(圖版-24)。胚體尾部變圓，呈圓錐狀，出現(xiàn)雛形尾芽，肌節(jié)出現(xiàn)12～15對(duì)，此時(shí)進(jìn)入尾芽期(圖版-25、26)。在后腦部出現(xiàn)泡狀耳囊，此時(shí)進(jìn)入耳囊出現(xiàn)期(圖版-27)。隨著胚體的不斷發(fā)育，在胚體尾部出現(xiàn)尾鰭雛形，卵黃出現(xiàn)內(nèi)凹，胚體發(fā)育達(dá)卵黃囊5/6周，此時(shí)進(jìn)入尾鰭出現(xiàn)期(圖版-28)。在胚體眼囊內(nèi)出現(xiàn)圓形晶體，肌節(jié)為20～21對(duì)，即進(jìn)入晶體出現(xiàn)期(圖版-29)。胚體出現(xiàn)微弱的肌肉收縮，胚體扭動(dòng)次數(shù)為3～4次/min，卵黃囊內(nèi)凹更加明顯，此時(shí)進(jìn)入肌肉效應(yīng)期(圖版-30、31)。在耳囊內(nèi)出現(xiàn)兩粒黑色耳石，此時(shí)胚體發(fā)育伸長(zhǎng)，約繞卵黃囊達(dá)1周以上，尾鰭較明顯，此時(shí)進(jìn)入耳石出現(xiàn)期(圖版-32、33)。此期發(fā)育速度次序?yàn)樗谋扼w>二倍體>正交F1>反交F1。

2.1.7 孵化出膜期 胚體發(fā)育繼續(xù)伸長(zhǎng)，胚體在膜內(nèi)扭動(dòng)次數(shù)增加，胚體扭動(dòng)次數(shù)為7次/min，眼晶體明顯，此時(shí)進(jìn)入出膜前期(圖版-34)。隨著胚胎的扭動(dòng)次數(shù)逐漸增加，處在此階段的胚胎隨時(shí)可能出膜，以尾部先沖破卵膜或者頭部沖破卵膜的形式出膜，此時(shí)進(jìn)入出膜期。此期發(fā)育速度次序?yàn)樗谋扼w>二倍體>正交F1>反交F1。

注:1為二倍體受精卵，2、3分別為正交和反交F1受精卵，4為四倍體受精卵，5～10分別為正交F1的胚盤期、2細(xì)胞期、4細(xì)胞期、8細(xì)胞期、16細(xì)胞期和32細(xì)胞期，11～13分別為二倍體桑椹期、高囊胚期和低囊胚期，14、15分別為正交和反交F1原腸早期，16、17分別為反交和正交F1原腸中期，18為反交F1原腸晚期，19、20分別為四倍體神經(jīng)胚期和胚孔封閉期，21、22分別為正交和反交F1肌節(jié)出現(xiàn)期，23～25分別為正交F1眼基出現(xiàn)期、眼囊期和尾芽期，26～28分別為反交F1尾芽期、耳囊出現(xiàn)期和尾鰭出現(xiàn)期，29為四倍體晶體出現(xiàn)期，30為反交F1肌肉效應(yīng)期，31為四倍體肌肉效應(yīng)期，32、33分別為正交和反交F1耳石出現(xiàn)期，34為正交F1出膜前期，35為二倍體初孵仔魚(yú)，36、37分別為正交和反交F1初孵仔魚(yú)，38為四倍體初孵仔魚(yú)。

Note:1,fertilized egg of diploid; 2 and 3.fertilized eggs of F1in reciprocal crosses; 4, fertilized egg; 5～10, blastoderm, 2-cell stage, 4-cell stage, 8-cell stage, 16-cell stage and 32-cell stage of F1in reciprocal crosses; 11～13, morula stage, early blastula stage and late blastula stage of diploid; 14 and 15, early gastrula stage of F1in positive and reciprocal crosses; 16 and 17, mid gastrula stage of F1in positive and reciprocal crosses; 18, late gastrula stage of F1in reciprocal cross; 19 and 20, neurula stage and blastopore closing stage of tetraploid; 21 and 22, myomere formation stage of F1in reciprocal crosses; 23～25, optic rudiment stage, eyesac formation stage and tail bud stage of F1in positive cross; 26～28, tail bud stage, oyocyst stage and rudiment of tail stage of F1in reciprocal crosses; 29, eye lens formation stage of tetraploid; 30, muscular contraction stage of F1in reciprocal cross; 31, muscular contraction stage of tetraploid; 32 and 33, otolithes formation stage of F1in reciprocal crosses; 34, pre-hatching stage of F1in positive cross; 35, newly hatched larvae of diploid; 36 and 37, newly hatched larvae of F1in reciprocal crosses; 38, newly hatched larvae of tetraploid.

圖版 二倍體、四倍體及其正反交F1的胚胎發(fā)育過(guò)程

Fig The embryonic development process of diploid, tetraploid and their F1in reciprocal crosses inM.anguillicaudatus

2.2 初孵仔魚(yú)形態(tài)特征及活動(dòng)情況

二倍體初孵仔魚(yú)體透明且無(wú)色素，全長(zhǎng)(2.528±0.195)mm，體長(zhǎng)(2.56±0.121)mm，卵黃囊前部為橢圓形，后部為棒狀，無(wú)油球。仔魚(yú)(圖版-35)游泳能力不強(qiáng)，偶爾作間隙扭動(dòng)或者向前串動(dòng)，大部分時(shí)間為貼壁休息或者靜臥水底，很少游動(dòng)。四倍體初孵仔魚(yú)(圖版-38)與二倍體仔魚(yú)形態(tài)上差別不大，魚(yú)體透明無(wú)色素，全長(zhǎng)為(3.188±0.248)mm，體長(zhǎng)為(3.145±0.277)mm，卵黃囊同二倍體初孵仔魚(yú)，但是大小有差別。正交F1仔魚(yú)(圖版-36)和二倍體仔魚(yú)的形態(tài)特征基本相同，反交F1(圖版-37)和四倍體仔魚(yú)的形態(tài)特征基本相同。

3 結(jié)論與討論

有研究表明，在一定溫度范圍內(nèi)魚(yú)類胚胎發(fā)育的時(shí)間與孵化溫度呈負(fù)相關(guān)[19]；泥鰍胚胎在水溫24.5～27.5℃條件下，經(jīng)過(guò)31 h仔魚(yú)出膜[6]；在水溫19.5～23℃條件下，泥鰍多數(shù)受精卵經(jīng)26.67 h孵化出膜[7]，泥鰍胚胎在19～23℃條件下，經(jīng)過(guò)34 h發(fā)育出膜[8]。研究結(jié)果表明，孵化水溫在(26.5±0.5)℃條件下，泥鰍二倍體、四倍體、正交F1和反交F1受精卵分別經(jīng)過(guò)26.18 h、25.78 h、26.52 h和26.72 h孵化出膜。表明，泥鰍在不同溫度下的胚胎發(fā)育時(shí)間呈現(xiàn)一定差異，與上述溫度相比符合孵化溫度與胚胎發(fā)育時(shí)間呈負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

有研究表明，母本的遺傳物質(zhì)對(duì)后代影響力比較大，雜交后代性狀一般偏向于母本，而胚胎發(fā)育方面也所體現(xiàn)。如翹嘴鱖和斑鱖雜交子一代[20-21]、花魚(yú)骨和唇魚(yú)骨雜交子一代[22-23]的胚胎發(fā)育形態(tài)和時(shí)序都偏向于母本。唇魚(yú)骨和花魚(yú)骨雜交F1的形態(tài)偏向于作為母本的唇魚(yú)骨[24]，翹嘴鱖和斑鱖雜交后代的胚胎發(fā)育時(shí)序以母本為基準(zhǔn)[25]。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果吻合，即正反交F1的胚胎發(fā)育時(shí)序偏向于母本。

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(責(zé)任編輯： 馮 衛(wèi))

Observation of Embryonic Development Characteristics of Diploid, Tetraploid and Their F1in Reciprocal Crosses inMisgurnusanguillicaudatus

WANG Yuchen, LIAN Qingping, LI Qian, LIU Shili, MI Guoqiang, HU Tingjian*

(ZhejiangInstituteofFreshwaterFisheries,Huzhou,Zhejiang313001,China)

The embryonic development process and characteristics of diploid, tetraploid and their F1in reciprocal crosses inM.anguillicaudatuswere observed and compared at water temperature of (26 0.5)℃ to provide a reference for polyploidy breeding and new variety breeding ofM.anguillicaudatus. Results: The hatching time of fertilized eggs of diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1is 26.18 h, 25.78 h, 26.52 h and 26.72 h respectively and their development process and development time sequence are the same basically. The fertilization and embryonic development process of diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1includes early cleavage stage, cleavage stage, blastula stage, gastrula stage, neurula stage, organ formulation stage and hatching stage and there are no obvious differences in the development characteristics and stages among diploid, tetraploid, positive cross F1and reciprocal cross F1except different time in development stages. The body length of diploid and tetraploid newly hatched larvae is (2.56 0.121) mm and (3.145 0.277) mm respectively, which indicates that there is no obvious difference in newly hatched larvae between diploid and tetraploid.The morphological characteristics of larva fish of positive cross F1is similar to diploid larva fish but the morphological characteristics of larva fish of reciprocal cross F1is similar to tetraploid larva fish.

Misgurnusanguillicaudatus; diploid; tetraploid; reciprocal cross; embryonic development

2015-07-20； 2015-12-24修回

浙江省公益技術(shù)研究農(nóng)業(yè)項(xiàng)目(2012C22059，2010C32033)

王雨辰(1982-)，男，工程師，從事魚(yú)類遺傳育種和養(yǎng)殖技術(shù)研究。E-mail：faywallace@163.com

*通迅作者：胡廷尖 (1961-)，男，教授級(jí)高級(jí)工程師，從事魚(yú)類遺傳育種與生態(tài)養(yǎng)殖研究。E-mail：zjscmz@163.com

1001-3601(2016)01-0032-0121-04

S917

A