升紅顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

廖曾珍　鄧俊剛　李江　鄧航　付翔　毛柳珺　甘潔靜　林家怡

【摘要】目的：建立升紅顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)制劑中雞血藤、花生紅衣進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)制劑中兒茶素進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱：SEPAX Amethyst C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；流速：0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：35℃。結(jié)果：TLC譜斑點(diǎn)清晰，分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。兒茶素進(jìn)樣量在0.0982～3.9269μg范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r=0.9999）；平均加樣回收率為92.32%，RSD=2.72%（n=6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快捷、重現(xiàn)性好，可用于升紅顆粒的質(zhì)量控制。

【關(guān)鍵詞】升紅顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；兒茶素；高效液相色譜法

【中圖分類號(hào)】R286 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2016）03-0014-03

升紅顆粒是根據(jù)我院腫瘤科臨床驗(yàn)方開發(fā)的純中藥復(fù)方制劑，由雞血藤、花生紅衣、大棗、枸杞子4味藥材制成，具有活血補(bǔ)血、健脾養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎的功效，臨床用于治療腫瘤患者化療所致的血小板、白細(xì)胞減少等癥。研究證實(shí)，方中的雞血藤[1]、花生紅衣[2]均含有刺激造血祖細(xì)胞增殖的兒茶素類成分，且雞血藤的黃酮類成分還具有促進(jìn)血虛動(dòng)物模型造血功能[3]。研究采用薄層色譜法對(duì)制劑中的雞血藤、花生紅衣進(jìn)行鑒別，采用HPLC法對(duì)制劑中兒茶素進(jìn)行含量測(cè)定，取得了滿意的效果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent HP1100系列高效液相色譜儀（包括Agilent G1310A單元泵、Agilent G1316A柱溫箱、Agilent G1314A可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司） ；威瑪色譜工作站；B2500S-MT型超聲波清洗器 （必能信超聲上海有限公司）；FA2004電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；

1.2 材料 升紅顆粒（批號(hào)： 141010、141018、141027，自制）；兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：110877-201203）、芒柄花素對(duì)照品（批號(hào)：111703-200603）、雞血藤對(duì)照藥材（批號(hào)：121173-201103）、花生紅衣對(duì)照藥材（批號(hào)：121491-200401）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑為分析純；高效硅膠G薄層板（10cm×10cm，青島海洋化工廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 雞血藤的TLC鑒別[4-5] 取本品3.0g，加二氯甲烷25ml，浸泡30min后，超聲 （功率：100W；頻率：40kHz）處理 20min，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。另取芒柄花素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1ml含0.5mg芒柄花素的溶液，作為芒柄花素對(duì)照品溶液。另取雞血藤對(duì)照藥材2.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成雞血藤對(duì)照藥材溶液。按處方量稱取不含雞血藤的其他飲片各適量，照升紅顆粒的制備方法，制成缺雞血藤陰性樣品，取缺雞血藤陰性樣品3.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成缺雞血藤的陰性樣品溶液。按照2010年版 《中國(guó)藥典》（一部） 附錄VIB的薄層色譜（TLC）法試驗(yàn)，吸取上述4 種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇（5∶15∶1） 為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm 紫外光燈下檢視。結(jié)果供試品色譜中在與對(duì)照品色譜及對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照色譜無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。見圖1。[JP]

2.1.2 花生紅衣的TLC鑒別[6] 取本品3.0g，加乙酸乙酯25ml，浸泡30min后，超聲 （功率：100W，頻率：40kHz） 處理20min，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，搖勻，作為供試品溶液。另取花生紅衣對(duì)照藥材2.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成花生紅衣對(duì)照藥材溶液。按處方量稱取不含花生紅衣的其他飲片各適量，照升紅顆粒的制備方法，制成缺花生紅衣陰性樣品，取缺花生紅衣陰性樣品3.0g，照上述供試品溶液的制備方法制成缺花生紅衣陰性樣品溶液。按照2010年版 《中國(guó)藥典》（一部） 附錄VIB的薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各10μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，放冷，置日光下檢視。結(jié)果供試品色譜中， 在與花生紅衣對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照液色譜無(wú)相應(yīng)的斑點(diǎn)。見圖2。

2.2 含量測(cè)定[7]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：SEPAX Amethyst C18 （250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；流速：0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20μl。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取兒茶素對(duì)照品適量，精密稱定，置于量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.9817mg的溶液，即得。[JP]

2.2.3 供試品溶液的制備 取樣品研細(xì)，精密稱定約1g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，稱定質(zhì)量，浸泡30min后，超聲（功率：100W，頻率：40kHz）處理20min，放冷，再次精密稱定，加50% 甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 取缺雞血藤和花生紅衣的陰性樣品適量，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液，即得。[JP]

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20μl，分別按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，色譜峰基線平穩(wěn)，供試品溶液中兒茶素與其它組分分離度良好，陰性無(wú)干擾；理論塔板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算應(yīng)不低于4000，分離度>1.5，拖尾因子：0.96。色譜見圖3。

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下的兒茶素對(duì)照品溶液適量，加甲醇依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.0049、0.0098、0.0196、0.0491、0.0982、0.1963mg/ml的溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量 （x，μg） 為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=666049x-23116（r=0.9999）。結(jié)果表明，兒茶素的進(jìn)樣量在0.0982～3.9269μg范圍內(nèi)與其峰面積的積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取“2.2.6”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.0491mg/ml的兒茶素對(duì)照品溶液20μl，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，兒茶素峰面積的RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別于制備0、1、2、4、6、8h時(shí)，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，兒茶素峰面積的RSD為2.46%，表明供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次（批號(hào)：141010）升紅顆粒1g，共6份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積，并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，兒茶素的平均含量為0.9255mg/g，RSD為1.13%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知兒茶素含量（0.9255mg/g）的升紅顆粒（批號(hào)： 141010） 1.0g，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入兒茶素對(duì)照品溶液（1.0012mg/ml）0.9ml，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定， 記錄峰面積，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品含量測(cè)定 取3批樣品各適量，分別按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 花生紅衣的薄層色譜鑒別 考察花生紅衣的薄層色譜鑒別方法時(shí)，參照文獻(xiàn)[6]的方法，但該方法制備供試品須經(jīng)水煎煮提取、酸化及乙酸乙酯萃取等操作過程，比較繁瑣費(fèi)時(shí)，因此直接用乙酸乙酯進(jìn)行超聲提取，實(shí)踐證明改進(jìn)后的方法不僅操作簡(jiǎn)便，而且斑點(diǎn)清晰，分離效果同樣比較理想。另外，原方法采用的展開劑為甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1），考慮到甲苯毒性較大，對(duì)環(huán)境和實(shí)驗(yàn)人員健康的影響較大，因此嘗試用極性相似的溶劑系統(tǒng)進(jìn)行替代。實(shí)驗(yàn)考查了二氯甲烷-甲醇-乙酸（8∶1∶1.5、5∶1∶1、3∶1∶1）及二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2、8∶6∶1∶2.5）等系統(tǒng)，結(jié)果以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2）的展開效果比較理想，斑點(diǎn)清晰，Rf值適中。

3.2 HPLC法測(cè)定兒茶素含量 HPLC法測(cè)定升紅顆粒中兒茶素含量的色譜條件借鑒了本課題的前期研究中摸索出的HPLC法測(cè)定花生紅衣中兒茶素含量的色譜條件[8]，經(jīng)驗(yàn)證，該條件同樣適合升紅顆粒中兒茶素含量的測(cè)定，分離度、脫尾因子均符合要求。

在研究供試品的制備條件時(shí)，提取溶劑分別考察了水、乙醇、50%甲醇、50%乙醇等溶劑的提取效果，提取方法考察了回流提?。?、1.5、2h）及超聲提?。?0、30min）。結(jié)果以先用50%甲醇浸泡30min后，再超聲提取20min的方法比較好，操作簡(jiǎn)便且兒茶素提取比較完全。

3.3 由于本制劑制備的批次較少，隨著投料量的變化和制備工藝的改進(jìn)，兒茶素的含量仍不穩(wěn)定，需穩(wěn)定工藝后進(jìn)一步積累數(shù)據(jù)，以確定兒茶素的含量限度，才能用于本制劑的質(zhì)量控制。

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（收稿日期：2015.12.20）