陜北地區(qū)提高石油采收率菌株篩選及其降解性能評(píng)價(jià)

鄧振山 商榮芳 陳凱凱 王小江

（延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，延安 716000）

石油（Petroleum）開采過程中造成的污染引起了全世界的關(guān)注［1］。近年來，微生物提高石油采收率（Microbial enhanced oil recovery，MEOR）是目前采油行業(yè)研究的熱門［2］。產(chǎn)表面活性劑的菌種所產(chǎn)生的表面活性劑能增大石油烴類化合物在水中的溶解度，生物表面活性劑相比于化學(xué)表面活性劑，有低毒、更易于生物降解和可在原地合成等諸多優(yōu)點(diǎn)［3］。利用微生物自身產(chǎn)生的表面活性劑增強(qiáng)石油烴類物質(zhì)降解效果，已成為外源微生物采油技術(shù)（MEOR）的一個(gè)重要研究方向［4］。微生物代謝產(chǎn)生的酸、二氧化碳等氣體能增強(qiáng)原油的流動(dòng)能力，或把重質(zhì)組分分解為易流動(dòng)的組分，以達(dá)到降低原油黏度的目的，并通過菌體自身生物特征和封堵作用提高原油采收率［5］。

現(xiàn)在微生物提高采收率的研究主要集中在細(xì)菌方面。自20世紀(jì)50年代起，前蘇聯(lián)和東歐等一些國家就進(jìn)行了微生物采油領(lǐng)域的研究；到20世紀(jì)80年代，美國及前蘇聯(lián)的微生物采油技術(shù)已在礦場實(shí)驗(yàn)中取得了相應(yīng)成功。我國的微生物采油技術(shù)是從20世紀(jì)60年代開始，到90年代在大慶、新疆、大港及勝利等地的油田進(jìn)行實(shí)地礦場實(shí)驗(yàn)，這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用已取得一定的成績［6］。但目前對(duì)陜北地區(qū)微生物提高原油采收率的報(bào)道還是相對(duì)較少。

本研究從陜西省延安市安塞區(qū)某油田的附近的油污泥及含油廢水中篩選出以原油為唯一碳源、能夠產(chǎn)生提高原油采收率代謝產(chǎn)物的增油菌，并對(duì)其生長條件和增油代謝產(chǎn)物如發(fā)酵液排油特性、產(chǎn)生物表面活性劑特性、表面張力、降油能力及降黏特性進(jìn)行了測定，旨在為后期的礦場試驗(yàn)和現(xiàn)場應(yīng)用提供有效的指導(dǎo)，確保礦場實(shí)驗(yàn)的成功。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 采自陜北某油田采油過程中所污染的土壤、含油廢水和油污泥。0#柴油：延安某加油站。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 無機(jī)鹽溶液（BMSM）（g/L）：KH2PO410.0 g，NaNO32.0 g，（NH4）2SO41.0 g，MgSO40.3 g，Na2HPO44.0 g，NaCl 5.0 g， 自 來 水1 000 mL，調(diào)節(jié) pH 為 7.0［7］。

富集培養(yǎng)液：在無機(jī)鹽營養(yǎng)液中加入20 g/L原油。分離培養(yǎng)基：在富集培養(yǎng)液中加入10 g/L瓊脂粉，加熱溶解。菌種純化及保藏培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：在無機(jī)鹽溶液中分別加入3.0 g/L牛肉膏、10.0 g/L蛋白胨和10.0 g/L紅糖［8］。原油液體培養(yǎng)基：無機(jī)鹽溶液中分別加入40 g/L原油和 13.0 g/L 玉米漿［9］。

1.1.3 供試菌株 由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保藏［10-12］。

1.2 方法

1.2.1 石油降解菌株的分離和純化 各取5 mL含油廢水加入到100 mL富集培養(yǎng)液中，取4 g油污泥加蒸餾水制成5 mL懸液，加入到100 mL富集培養(yǎng)液中，30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)5 d，再吸取5 mL培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)液中，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次。將第3次搖床震蕩培養(yǎng)所得的菌液按10倍的濃度梯度稀釋后，取0.1 mL均勻涂布到分離培養(yǎng)基上，35℃恒溫培養(yǎng)。等到平板上長出菌落后，挑取直徑較大而且使菌落背景清晰透明的單菌落，采用平板劃線法進(jìn)行分離和純化；純化后的菌株保藏于牛肉膏蛋白胨斜面中待用［13］。

1.2.2 供試菌株生長條件的測定 生長條件的評(píng)價(jià)主要指標(biāo)是溫度、pH值、鹽度等對(duì)微生物生長的影響［14］。室內(nèi)研究方法是選取各指標(biāo)的不同的參數(shù)值，在特定的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過測定菌液的濃度，來確定微生物最適的生長指標(biāo)，菌液的濃度直接影響微生物質(zhì)量。本研究采用紫外分光光度計(jì)測定OD值的方法來確定菌液濃度。

1.2.2.1 石油降解菌株最適生長溫度的測定 將無機(jī)鹽培養(yǎng)基的初始pH調(diào)至7.0，分別接種一只斜面到100 mL滅菌的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別在25、28、31、34、37和40℃的恒溫170 r/min的搖床上進(jìn)行1 d的振蕩培養(yǎng)，于600 nm處測定OD值。

1.2.2.2 石油降解菌株最適pH的測定 用HCl溶液或NaOH溶液將無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH值調(diào)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，滅菌后將菌株分別接種于已調(diào)節(jié)好pH的無機(jī)鹽培養(yǎng)液中，35℃，170 r/min搖床上恒溫培養(yǎng)1 d，于600 nm處測定OD值。

1.2.2.3 石油降解菌株最適鹽濃度的測定 配置NaCl濃度 5 g/L、10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L 和 50 g/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，分別將菌株接種于已配置好鹽濃度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，35℃，170 r/min搖床上恒溫培養(yǎng)1 d，于600 nm處測定OD值。

1.2.3 供試菌株發(fā)酵液排油活性的測定 菌株的斜面保存的培養(yǎng)物活化后，用滅菌竹簽挑取分別接種到裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL的錐形瓶中，30℃靜置培養(yǎng)5 d，每隔24 h晃動(dòng)一次。取口徑為12 mL的培養(yǎng)皿，加無菌水近滿，在水面上加5 mL 0#已被剛果紅染色的柴油，待柴油在水面上自由擴(kuò)散，直到形成一層油膜，在油膜的中心加2 mL發(fā)酵液，紅色的油膜被擠向四周形成一圓形排油圈，用直尺測量排油圈的直徑（D），選用滴加未接菌的發(fā)酵液處理的油膜作為對(duì)照（CK）［15］。

1.2.4 生物表面活性物質(zhì)的提取 采用酸沉淀法粗提生物表面活性劑。取1.2.3所獲取的發(fā)酵液各10 mL，4 000 r/min離心5 min，收集上清液，用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至2-3，放入冰箱，在4℃的低溫環(huán)境下過夜，觀察是否有白色沉淀產(chǎn)生，若出現(xiàn)白色沉淀則表明發(fā)酵液中含有微生物代謝產(chǎn)生的脂肽或脂蛋白類表面活性成分；若無白色沉淀產(chǎn)生，則表明發(fā)酵液中含微生物代謝形成的糖脂類表面活性成分［16］。對(duì)冷藏后的發(fā)酵液進(jìn)行離心（4 000 r/min，離心5 min），發(fā)酵液中有白色沉淀，表明已獲得了生物表面活性劑的粗提物。

1.2.5 發(fā)酵液pH的測定 用已滅過菌的竹簽挑取斜面保存的細(xì)菌培養(yǎng)物，接種到裝有100 mL發(fā)酵液培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在30℃恒溫環(huán)境下，靜置培養(yǎng)5 d，每隔24 h晃動(dòng)1次。在20℃的室溫條件下，用pH計(jì)測定發(fā)酵液的pH。

1.2.6 發(fā)酵液表面張力的測定 用1.2.5節(jié)同樣的方法培養(yǎng)細(xì)菌，然后測定發(fā)酵液的表面張力。發(fā)酵液表面張力是采用環(huán)法JK99B全自動(dòng)張力儀測定的［17］。

1.2.7 供試菌株對(duì)原油的降解試驗(yàn)

1.2.7.1 原油乳化分散效果及原油在瓶壁上的附著情況 將已純化的菌株活化后，制成菌數(shù)約為1×108CFU/mL菌懸液［18］，按5%的接種量接種到裝有100 mL滅菌的原油液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，復(fù)合菌群接種各供試菌株按2.5%的接種量接種于100 mL滅菌的原油液體培養(yǎng)基的錐形瓶中。30℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)14 d，將不接種的原油液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照（CK），觀察供試菌株乳化分散原油的效果及原油在瓶壁上的附著情況。

1.2.7.2 石油降解率的測定 稱取0.8 g脫脂棉置于三角漏斗中，將供試菌株作用后的含有原油的發(fā)酵液用三角漏斗過濾。將三角漏斗內(nèi)飽含石油的脫脂棉的水分瀝干后放入原反應(yīng)瓶中，加40 mL石油醚浸泡，等到反應(yīng)瓶內(nèi)脫脂棉上的原油溶解后，將原油石油醚溶液用加有0.8 g脫脂棉的漏斗再次過濾，然后用40 mL石油醚洗滌原反應(yīng)瓶及含油脫脂棉并過濾，收集融有原油的石油醚。定容至100 mL，取1 mL樣品液稀釋至100 mL，用紫外分光光度計(jì)測稀釋樣品的OD值。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算原油的降解率。

式中：W為初始原油質(zhì)量（g），W 為樣品殘油的質(zhì)量（g）。

原油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［19］：

（1）配置標(biāo)準(zhǔn)油，準(zhǔn)確稱取原油0.1 000 g，加入少量石油醚溶解后定容至100 mL量瓶中，搖勻，配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）分別移取0 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL和4 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL量瓶中，用石油醚定容，此標(biāo)準(zhǔn)系列的濃度分別是0 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L和 40 mg/L。

（3）先取中間濃度的標(biāo)準(zhǔn)液在紫外分光光度計(jì)的200-400 nm處進(jìn)行光譜掃描，找出最大吸收峰。

（4）在最大吸收峰的波長256 nm下分別測定標(biāo)準(zhǔn)濃度的吸光度，以濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)繪制濃度（mg/L）-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7.3 降黏率的測定 采用與1.2.7.1同樣的方法培養(yǎng)細(xì)菌，再用黏度計(jì)測定經(jīng)供試菌株作用后，石油黏度的變化。

2 結(jié)果

2.1 石油降解菌株的分離、篩選

從原油及含油廢水中共分離純化出10株細(xì)菌，其中4株分離自油污泥，6株分離自含油廢水。為了篩選出降解、乳化效果好的增油菌株，依據(jù)排油圈直徑的大?。ū?），從中選出菌株A、菌株B、菌株A-08、菌株5-13、菌株1-1和菌株1-2這6株作為供試菌株，并對(duì)挑選出的6株供試菌株進(jìn)行下一步的性能評(píng)價(jià)。

2.2 供試菌株的生長條件

2.2.1 供試菌株最適生長溫度的測定結(jié)果 由圖1結(jié)果表明，28-31℃之間菌液濃度最大，當(dāng)溫度為28℃時(shí)，菌株A、菌株1-1的菌液濃度最大；當(dāng)溫度為31℃時(shí)，菌株A-08、菌株1-2、菌株B、菌株5-13的菌液濃度最大。當(dāng)溫度超過這一溫度范圍時(shí)，由于高溫會(huì)影響微生物的生長狀況，導(dǎo)致微生物的活性下降甚至失活，6株菌的菌液濃度明顯降低。因此，本實(shí)驗(yàn)將6株菌的最適生長溫度定為30℃。

圖1 溫度對(duì)供試菌株生長狀況的影響

2.2.2 供試菌株最適生長pH的測定結(jié)果 pH是影響微生物生長的重要環(huán)境條件，大多數(shù)微生物的生長的pH都在6.0-8.0這個(gè)范圍之內(nèi)。圖2的結(jié)果顯示，隨著pH的增加，供試菌株的菌液濃度也明顯增加，不過當(dāng)pH為7.0-8.0之間時(shí)，菌液濃度最大。當(dāng)pH值為8時(shí)，菌株B的菌液濃度最大，當(dāng)pH值為7時(shí)，其余5株菌的菌液濃度最大，當(dāng)pH值超過9.0以后，由于pH值過大，導(dǎo)致微生物部分功能減弱甚至失活，菌液濃度急速降低。初步確定供試細(xì)菌的最適生長pH值條件為7.0-8.0。

圖2 pH對(duì)供試菌株生長狀況的影響

2.2.3 供試菌株最適生長鹽濃度的測定結(jié)果 圖3結(jié)果表明，隨著鹽濃度的增加，供試菌株的菌液濃度先增加后減少，鹽濃度（NaCl）的質(zhì)量濃度為10 g/L左右，各菌株的菌液濃度是最大的。當(dāng)鹽濃度超過10 g/L，各菌株的菌液濃度呈降低趨勢，菌株A-08和菌株5-13最為明顯，原因是鹽濃度改變了培養(yǎng)基的滲透壓，影響了菌體的新陳代謝和菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響了供試菌株的各種性能。因此，選擇最適生長鹽濃度為10 g/L。

2.3 供試菌株發(fā)酵液的排油活性及表面活性物質(zhì)

圖3 鹽濃度對(duì)供試菌株生長狀況的影響

表1結(jié)果表明，6株菌及其復(fù)合菌群均具有一定的排油活性，但供試菌株間存在一定的差異，其中菌株B的排油圈直徑是單株菌最大，達(dá)到5.3 cm，相較于對(duì)照增加了29.26%，說明該供試菌株所產(chǎn)生的表面活性劑的排油活性最強(qiáng)，剩余的5株菌的排油圈直徑在4.3-5.1 cm。菌株1-1和菌株B的復(fù)合菌群的排油圈直徑為6 cm，相較于對(duì)照增加了46.34%，其余的復(fù)合菌群的排油圈直徑都比單一供試菌株的排油圈直徑小。在供試菌株中，有5株菌的發(fā)酵液出現(xiàn)白色沉淀，表明這5株供試菌株所產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)的成分是脂肽類，剩余的1株供試菌株發(fā)酵液中未發(fā)現(xiàn)白色沉淀，表明該細(xì)菌所產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)成分為糖脂。

表1 供試菌株排油圈直徑及所產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)的成分

2.4 供試菌株發(fā)酵液的pH及其表面張力的測定

微生物的新陳代謝過程中會(huì)有酸、氣體等產(chǎn)物生成，這些物質(zhì)會(huì)降低原油的黏度。因此，發(fā)酵液的pH也是對(duì)供試菌株降解性能的一種評(píng)價(jià)。表2結(jié)果顯示，菌株1-2、5-13和A-08這3株菌的發(fā)酵液，較CK有較明顯的變化，pH明顯減小，菌株1-2的pH最小，為5.58，說明這3株菌在新陳代謝過程中產(chǎn)生了酸性物質(zhì)。而菌株5-13、A、1-2的發(fā)酵液pH相較于CK的pH變化不大。菌株B、5-13、1-1發(fā)酵液的表面張力相較于CK明顯大幅度下降，菌株A-08的表面張力變化最大，較CK下降了16.9 Mn/m，說明菌株B、菌株5-13、菌株1-1在代謝過程中產(chǎn)生大量的表面活性物質(zhì)。

表2 供試菌株發(fā)酵液pH值及其表面張力

2.5 供試菌株對(duì)原油的乳化效果

圖4結(jié)果表明，經(jīng)恒溫?fù)u床發(fā)酵處理后，相較于對(duì)照菌株1-2、A-08、A和A-08的復(fù)合菌群處理后，原油在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中均勻分散，且較為穩(wěn)定，原油對(duì)培養(yǎng)瓶瓶壁的附著性也大幅度減小，只有輕微的黏壁。供試菌株對(duì)原油的乳化效果及原油對(duì)瓶壁的附著性的影響結(jié)果（表3）表明，菌株1-2、A-08、5-13、A和A-08的復(fù)合菌群與原油作用后，原油被乳化成細(xì)小的圓型顆粒，均勻分布于培養(yǎng)基中，油水無界面，幾乎不黏壁；菌株B與原油作用后，原油被乳化成不規(guī)則顆粒狀，搖晃后可長時(shí)間均勻分布，發(fā)酵液棕黑色，但大量黏壁；其余供試菌株及復(fù)合菌群大量黏壁，呈片狀或塊狀分布于水層上方，油水分層明顯。供試菌株的復(fù)合菌群降解效果相較于單株菌有好有差，這是因?yàn)榫曛g存在協(xié)同作用和拮抗作用。

圖4 供試菌株及其復(fù)合菌群對(duì)原油附著性的影響

表3 供試菌株對(duì)原油附著性及乳化性的影響

2.6 原油降解率的計(jì)算

2.6.1 原油標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 在最大吸收波長256 nm下分別測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A，結(jié)果如圖5。

圖5 原油標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線圖

2.6.2 原油降解率的計(jì)算 供試菌株作用后，原油樣品稀釋液在最大吸收波長256 nm下的吸光度，用石油醚為對(duì)照樣品（CK）。結(jié)果（表4）表明各供試菌株對(duì)原油的降解率在29.25%-60.00%，其中的A、A-08混合菌的降解率最高，達(dá)到了60.00%，但是，混合菌株A、B的降解效果與單菌株1-2 和A-08比較，有所下降?？梢?，混菌的降解效果不一定比單菌株高。

表4 供試菌株對(duì)石油的降解效果

2.7 供試菌株作用后原油黏度的變化

表5結(jié)果顯示，經(jīng)恒溫?fù)u床發(fā)酵處理后，相較于對(duì)照（CK），經(jīng)菌株1-2、菌株A-08、菌株5-13和菌株B處理后，原油黏度明顯降低。而經(jīng)菌株1-1、菌株A處理后，原油黏度變化不明顯。由此可知，菌株1-2、菌株A-08、菌株5-13和菌株B對(duì)原油黏度作用明顯，最高可達(dá)到49.02%。

3 討論

石油降解菌株對(duì)原油的驅(qū)油、降油、降黏過程與供試菌株的生長條件、代謝過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物密切相關(guān)。本研究篩選出高效產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌株A-08，培養(yǎng)7 d后測定原油降解率為40.37%，通過革蘭氏染色后為陰性，薄層層析法（TLC）確定產(chǎn)物為脂肽類物質(zhì)。

黃曼曼等［20］以 20# 機(jī)油和真空泵油為唯一碳源，篩選出機(jī)油高效降解菌，采用紫外分光光度法和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）研究菌株降解特性。從初篩的 22 株機(jī)油降解菌中篩選出 4 株機(jī)油高效降解菌株，分別為 JZ6、JZ18、JZ41和JZ50，在含機(jī)油培養(yǎng)基中 30℃ 培養(yǎng) 7 d 后，機(jī)油降解率分別為 42.62%、33.67%、33.36% 和 40.52%。而本研究在30℃條件下，單株菌的降解率、降黏率最高可達(dá)50.75%和49.02%。

表5 供試菌株作用后原油黏度

張娜等［21］分離到的菌株X-1為革蘭氏陽性菌，降解率為 30.04%，最佳生長條件為pH 7.0，32℃，鹽度為2%，將本實(shí)驗(yàn)所篩選菌株的特性與張娜等所篩選的X-1菌株特性進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)A-08對(duì)原油的降解率比X-1菌株對(duì)原油的降解率高出了20.71%，最適溫度比X-1菌株高了8℃，耐鹽度比X-1高了8%。該種菌具有耐高溫和耐鹽等優(yōu)點(diǎn)，使得其在將來的應(yīng)用中具有廣闊的前景。

本研究中對(duì)篩選出的供試菌株進(jìn)行石油降解實(shí)驗(yàn)時(shí)，除了對(duì)單一菌株的降油效果進(jìn)行了測定，還對(duì)它們的復(fù)合菌群的降油效果也進(jìn)行了測定，其中的A、A-08混合菌的降解率最高，達(dá)到了60.00%，充分驗(yàn)證了具有降油能力的單一菌種的降解效果主要受培養(yǎng)條件的影響；而復(fù)合菌群在降解原油的過程中，有的降解效率遠(yuǎn)高于單一菌株，也有低于單一菌株的，這是微生物之間存在協(xié)同、競爭拮抗作用，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致［7，22］。本研究結(jié)果表明，盡管單一供試菌株的降解率最高可達(dá)到50.75%，但并未達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，這可能是因?yàn)槌司甑纳L條件之外，菌株的營養(yǎng)條件也影響菌株對(duì)原油的降解效果，這還有待于今后進(jìn)一步研究。

本研究采用了紫外法來測定原油的降解率，除了紫外法，研究者大都采用重量法和氣相色譜法［23-24］。但不同的方法在測定降解率時(shí)都存在利弊，因此可根據(jù)不同目的而進(jìn)行選擇。在進(jìn)行殘余烴的回收過程中采用了脫脂棉過濾、洗滌的方法，經(jīng)過比較，此方法較便捷，有利于提高篩選效率［25］。本研究還需對(duì)所篩選出的降油菌作進(jìn)一步的鑒定和礦場實(shí)驗(yàn)或者是進(jìn)行油藏環(huán)境的模擬實(shí)驗(yàn)。

4 結(jié)論

從含油廢水和油污泥中篩選出10株細(xì)菌。當(dāng)溫度為30℃、pH為7-8、鹽濃度為10g/L時(shí)，菌株的菌液濃度最大。在最適的生長條件下，供試菌株對(duì)原油的降解作用效果最好。在30℃條件下，單株菌的降解率、降黏率最高可達(dá)50.75%和49.02%。通過對(duì)復(fù)合菌群的降油效果的測定表明，其中的A、A-08混合菌的降解率最高，達(dá)到了60.00%。