胃癌分子病理研究中基因芯片的應(yīng)用進(jìn)展

吳建平

(保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南 保山 678000)

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胃癌分子病理研究中基因芯片的應(yīng)用進(jìn)展

吳建平

(保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南 保山 678000)

[關(guān)鍵詞]胃癌；病理診斷；基因芯片；治療分子機(jī)制

隨著人類基因組計劃的完整，研究重點開始進(jìn)入到后基因組時代。基因芯片又稱之為DNA微陣列，最早在20世紀(jì)由美國Fodor等提出，包括上萬種寡核苷酸或者DNA樣品，密集排列在聚乙烯、硅片等支撐物上，類似Southern和Northem雜交技術(shù)原因，芯片DNA與樣品cDNA結(jié)合被標(biāo)記，全面描述細(xì)胞所有基因，提供發(fā)育階段信號，準(zhǔn)確檢測基因表達(dá)，并能夠了解與某些生命現(xiàn)象相關(guān)基因表達(dá)，對基因調(diào)控研究有重要價值[1-2]。本文主要綜述基因芯片技術(shù)在胃癌領(lǐng)域研究現(xiàn)狀。

1基因芯片在胃癌發(fā)病機(jī)制研究中的應(yīng)用

基因芯片在胃癌發(fā)病機(jī)制研究中集中表現(xiàn)在尋找相關(guān)基因、胃癌轉(zhuǎn)移基因等方面?；蛐酒軌驒z測基因多肽位點和基因突變，基因組多樣性研究對闡明個體疾病易感性有重要價值，系統(tǒng)篩查基因編碼序列對于查找疾病易感基因有重要價值。

基因芯片技術(shù)尋找胃癌癌變相關(guān)基因研究比較早，國內(nèi)不少研究利用cDNA微陣列芯片篩選胃癌相關(guān)基因，如楊少波等[3]將人類基因PCR產(chǎn)物聯(lián)合微陣列芯片，抽取胃腺癌和正常胃黏膜組織純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成熒光分子標(biāo)記作為探針，掃描芯片熒光信號，結(jié)果顯示327條基因在胃腺癌表達(dá)異常，其中179條基因表達(dá)下降，其余上調(diào)，表明胃腺癌發(fā)展中由多基因調(diào)控參與。國外研究較早，Leung等[4]采用基因芯片技術(shù)檢測胃癌組織基因表達(dá)情況，認(rèn)為基因?qū)ξ赴┑陌l(fā)展和轉(zhuǎn)移存在一直效果，采用588個一直基因片段檢測不同胃組織基因表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中半胱天冬酶-8前體等基因上調(diào)，基質(zhì)金屬蛋白酶基因下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)胃癌患者17號染色體長臂存在基因擴(kuò)增情況。

蘇征等[5]采用基因芯片技術(shù)篩查胃癌發(fā)生發(fā)展中差異基因表達(dá)情況，采用激光切割顯微鏡補(bǔ)貨聯(lián)合基因芯片技術(shù)分析正常黏膜組織和胃炎組織基因表達(dá)譜情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性萎縮性胃癌與正常胃黏膜組織共包括109個差異基因，其中61個基因上調(diào)，48個基因下調(diào)，多數(shù)下調(diào)基因與腸上皮化生和不典型增生有關(guān)。Sepulveda等[6]利用cDNA微陣列檢測胃癌患者基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)200個基因存在異常改變，認(rèn)為幽門螺桿菌感染能夠引起cyclinD1基因以及cjun基因等的上調(diào)，能夠誘導(dǎo)絲氨酸蘇氨酸激酶的表達(dá)。謝海龍等[7]同樣采用cDNA微陣列芯片篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)相關(guān)基因。采用cDNA微陣列技術(shù)建立胃癌原發(fā)病灶和轉(zhuǎn)移病灶基因表達(dá)譜，采用含10 000個已知基因和7000EST基因芯片分析表達(dá)譜變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)601個表達(dá)基因差異存在2倍異常，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移基因中527個上調(diào)，如碳酸酐酶Ⅱ基因、EMSI基因等，74個下調(diào)，EST差異2倍以上包括71個，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶中62個基因表達(dá)上調(diào)，9個基因表達(dá)下調(diào)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病灶，細(xì)胞周期、黏附功能等相關(guān)基因高表達(dá)。

腫瘤發(fā)生以基因結(jié)構(gòu)和活性改變?yōu)榛A(chǔ)，細(xì)胞異常增殖是主要表現(xiàn)。腫瘤過度增殖可能與參與細(xì)胞周期調(diào)控基因表達(dá)異常有關(guān)，細(xì)胞正常周期中，DNA合成前期和DNA合成期是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用基因芯片技術(shù)檢測此階段胃癌細(xì)胞質(zhì)基因表達(dá)情況對于闡述胃癌組織增殖機(jī)制以及治療有很大幫助。蘭斌等[8]分析胃癌組織周期表達(dá)譜變化，從基因?qū)W角度闡述胃癌組織增殖原理，采用雙胸腺嘧啶核苷法等，阻斷胃癌細(xì)胞株G2/M期以及G1/S期交界點，然后釋放，同時采用流式細(xì)胞儀監(jiān)測，基因芯片檢測細(xì)胞周期中G2/M分界點以及G1/S分界點等基因表達(dá)譜，借助基因數(shù)據(jù)庫，分析細(xì)胞周期G1末期和G2期基因表達(dá)情況，通過基因芯片檢測， 不同時間點共得到2 001個基因，其中379個基因在G1末期和G2期出現(xiàn)上調(diào)，40個基因在S期和M期出現(xiàn)上調(diào)。G1末期上調(diào)基因包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運、RNA合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等基因，指出MKN45細(xì)胞周期變化中G1末期和G2期已經(jīng)完整DNA復(fù)制及染色體分離所需要的物質(zhì)，這個過程中多種基因參與，部分基因表達(dá)上調(diào)可能引起細(xì)胞過度增殖。馬萬山等[9]采用基因表達(dá)譜芯片研究胃癌組織細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，采用Trizol一步法抽取胃癌組織總RNA，分離純化mRNA，逆轉(zhuǎn)錄為熒光分子標(biāo)記物，與表達(dá)譜芯片雜交，分析胃癌表達(dá)異?；?，并分析生物信息學(xué)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常胃組織基表達(dá)相比，胃癌組織細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡基因異常17條，其中細(xì)胞周期基因11條，細(xì)胞凋亡基因6條，胃癌組織中，10條基因表達(dá)上調(diào)，7條基因表達(dá)下降，指出胃癌發(fā)生和發(fā)展中存在錯基因表達(dá)失控情況，對進(jìn)一步闡述胃癌發(fā)病機(jī)制有重要意義。

惡性腫瘤表現(xiàn)出侵襲性和轉(zhuǎn)移性，基因芯片能夠提供研究腫瘤轉(zhuǎn)移分子機(jī)制新方法。Ureshino等[10]利用基因芯片結(jié)合基因抑制技術(shù)提出胃癌組織中的NDRG1基因，發(fā)現(xiàn)胃癌組織和腹膜轉(zhuǎn)移基因酶被明顯抑制，指出在胃癌惡性轉(zhuǎn)移中NDRG1基因發(fā)揮重要作用，同時選取GC9811和GC9811-P細(xì)菌系作為相應(yīng)配型，標(biāo)注Cy3和Cy5微陣列，發(fā)現(xiàn)覆膜轉(zhuǎn)移中，248個差異表達(dá)發(fā)揮潛在作用。余曉云等[11]在分析胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中基因芯片技術(shù)預(yù)測診斷，選取胃癌患者組織標(biāo)本，使用GeneChipHuGenceFL寡核苷酸芯片畸形檢測，抽取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cRNA，采集數(shù)據(jù)初步篩選發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織共包括123個差異表達(dá)基因，腫瘤血管形成相關(guān)基因包括THBS2、FN1等，信號傳導(dǎo)基因包括HSPB1、MAP3K12等，細(xì)胞運動和黏附基因包括PFN2、CAS1等。表達(dá)下調(diào)基因基本為多種免疫因子，如CXCL2、ASS1等基因，篩選基因臨床交叉驗證結(jié)果表明17例與臨床一致，預(yù)測胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移敏感性和特異性都較高。Natsume等[12]分析MKN74細(xì)胞中CRKL存在高度表達(dá)，采用基因芯片驗證發(fā)現(xiàn)胃癌組織中CRKL蛋白過表達(dá)，推測為胃癌組織增殖有關(guān)。

2基因芯片在胃癌藥物研發(fā)中的應(yīng)用

基因芯片在胃癌研究的作用不僅包括基因篩查，更多表現(xiàn)在預(yù)測靶向藥物治療方面。關(guān)于胃癌生物靶標(biāo)治療是目前研究重點，Takei等[13]分析轉(zhuǎn)移相關(guān)的microRNA的miR-516A-3P治療胃癌可能性，以往研究中微小RNA表達(dá)在不同癌癥組織中均有異常，在研究中建立小鼠模型，模擬人胃癌腹膜細(xì)胞，從HSC-44PE細(xì)胞培養(yǎng)高轉(zhuǎn)移性衍生物細(xì)胞，采用基因芯片確定異常表達(dá)44As3和HSC-44PE細(xì)胞miRNA表達(dá)，定量分析miR-516A-3P監(jiān)督表達(dá)，從乙酰肝素硫酸除去6-O-硫酸酯蛋白多糖表面，引起膜受體與配體結(jié)合，Westem印跡分析顯示44As3MIR416A-3P細(xì)胞增多，最終發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移相關(guān)性基因可以作為胃癌覆膜上治療新靶點。Cheong等[14]培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株，提出RNA，采用基因芯片級型雜交分析，并采用qRT-PCR進(jìn)行驗證，研究發(fā)現(xiàn)galectin-3參與細(xì)胞侵襲以及對化療藥物的抵抗過程，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡以及生存基因進(jìn)行實現(xiàn)，認(rèn)為化療中可以通過抑制galectin-3表達(dá)離開提高治療效果。Claerhout等[15]采用基因芯片技術(shù)，建立人類胃癌基因特征信號，并指出胃癌治療中HDAC可以作為重要候選要素，證實基因芯片技術(shù)在胃癌研究領(lǐng)域的重要性。

國內(nèi)對于基因芯片在胃癌藥物研究不多，集中在效果證實方面。吳智群等[16]分析曲古抑菌素A誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯及發(fā)生機(jī)制，采用胃癌細(xì)胞系SGC-7901為研究對象，注射曲古抑菌素A，觀察生長情況，取對數(shù)生長期細(xì)胞染色，采用流式細(xì)胞儀分析周期細(xì)胞，采用Western檢測P53、P21蛋白表達(dá)情況，采用基因芯片技術(shù)檢測不同處理方式胃癌基因表達(dá)差異，研究結(jié)果指出TSD誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期組織，能夠增加胃癌細(xì)胞SGC-7901到p53等基因的表達(dá)，并降低CK2、CCND1基因表達(dá)。中藥成分復(fù)雜，作用靶點多，防病機(jī)制闡述不明確，基因芯片技術(shù)的使用為作用機(jī)制研究提供可能。許慶瑞等[17]分析復(fù)方青龍衣膠囊對胃癌細(xì)胞作用機(jī)制，設(shè)定不同藥物濃度梯度，預(yù)處理24 h，采用MTT法進(jìn)行測定，不同濃度藥物處理，采用全基因芯片研究胃癌基因表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)不同濃度復(fù)方青龍衣膠囊作用胃癌細(xì)胞效果不同，與濃度持續(xù)正相關(guān)，胃癌細(xì)胞SGC-7901的半數(shù)抑制濃度為1.27×10-3g/L，從對照細(xì)胞中篩選出78個差異表達(dá)基因，其中23個基因上調(diào)，55個基因下調(diào)，SGC7901細(xì)胞有71條生物信號通路異常，其中15條有下降趨勢，23條出現(xiàn)上升趨勢，信號通路基因同時存在上升和下降趨勢，影響信號通路設(shè)計到細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及細(xì)胞凋亡等方面，認(rèn)為復(fù)方青龍衣膠囊能夠影響細(xì)胞周期信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞分裂、增殖和分化引起細(xì)胞凋亡。敖慧等[18]分析參術(shù)膠囊治療胃癌基因表達(dá)譜變化，將BALB/c-nu/nu小鼠采用食醋法建立動物模型，采用基因芯片檢測胃癌轉(zhuǎn)移小鼠和胃癌細(xì)胞株，并設(shè)置空白對照組，研究發(fā)現(xiàn)胃癌轉(zhuǎn)移小鼠以及胃癌細(xì)胞株基因異常表達(dá)共95條，其中56條基因上調(diào)，如CD9、墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶8、谷酰胺肽S-轉(zhuǎn)移酶等，39條下調(diào)。上調(diào)基因中20條與代謝有關(guān)，1條受體類基因，2條蛋白合成基因，1條離子通道和運輸類蛋白基因，3條與免疫有關(guān)，7條與發(fā)育有關(guān)，3條與細(xì)胞周期有關(guān)，4條未知。下調(diào)基因表達(dá)中，12條與代謝有關(guān)，1條與免疫有關(guān)，4條與細(xì)胞周期有關(guān)，2條與DNA復(fù)制有關(guān)，1條與細(xì)胞凋亡有關(guān)，3條與離子通道和運輸類有關(guān)，8條未知，模型Ttr出現(xiàn)上調(diào)減少，表明參術(shù)膠囊能夠使Ttr下調(diào)，達(dá)到治療效果。

3基因芯片在胃癌預(yù)后分析標(biāo)志物中的應(yīng)用

腫瘤標(biāo)志物是近幾年的研究熱點，人體內(nèi)含有多種物質(zhì)提示腫瘤預(yù)后的信息，早期對這類因素進(jìn)行檢測，對腫瘤早期診斷和治療有現(xiàn)實意義。

國內(nèi)外利用基因芯片研究基因在胃癌表達(dá)情況有很多，miR-191是近些年研究熱點之一。郭鵬輝等[19]分析miR-191在胃癌組織中的表達(dá)，采用SYBR Green I實時熒光定量PCR技術(shù)檢測胃癌組織和胃癌旁正常組織miR-191表達(dá)情況，并利用生物學(xué)信息軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測，分析與MiR-191表達(dá)情況關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中mIR-191表達(dá)異常升高，miR-191預(yù)測靶基因包括SOX4以及NDST1等。國外學(xué)者利用微陣列結(jié)合其他技術(shù)指出胃癌發(fā)生中MTMR3發(fā)揮重要作用[20]，采用不同胃癌患者組織進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)miRNA能夠準(zhǔn)確區(qū)分292例樣品，發(fā)現(xiàn)不同類型胃癌患者基因表達(dá)存在異常，彌漫性胃癌患者8個特異性miRNA上調(diào)，腸型胃癌則有4個基因上調(diào)，并指出miR-214高表達(dá)患者預(yù)后差。Matsuo等[21]利用基因芯片技術(shù)對采取手術(shù)治療患者進(jìn)行基因表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)胃癌組織中miR-29c表達(dá)較低，認(rèn)為RCC2基因表達(dá)下降引起腫瘤細(xì)胞增殖。

4結(jié)語

基因芯片在胃癌研究領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，隨著芯片中包含的基因數(shù)的增長，篩選處的基因不斷增多，但是目前基因芯片應(yīng)用操作難度比較大，成本昂貴，而且沒有形成統(tǒng)一規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，容易造成資源的浪費。應(yīng)用研究中還無法采取定量檢驗，需要配合PCR等技術(shù)手段，而且聯(lián)合使用中擴(kuò)增模板存在局限性，影響信號檢測的靈敏度和特異性。雖然基因芯片在應(yīng)用中還存在很多缺點，但是不能否認(rèn)在胃癌基因表達(dá)譜測定中的作用，未來研究中還需要與其他技術(shù)結(jié)合在一起，擴(kuò)大基因芯片分析范圍，同時還需提高靈敏度，降低研究成本。

[參考文獻(xiàn)]

[1]黃堅，李昌煜. 基因芯片技術(shù)在衰老機(jī)制和抗衰老中藥研究中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，16(14):2009-2012

[2]鄭維鍔,張武,孫利敏,等. CerbB-2基因在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2006,15(9):1213

[3]楊少波,王孟薇,邵勇,等. 應(yīng)用cDNA微陣列芯片篩選胃癌相關(guān)基因[J]. 腫瘤防治雜志,2004,11(2):117-120

[4]Leung SY,Chen X,Chu KM,et al .Phospholipase A2 group IIA expression in gastric adenocarcinoma is associated with prolonged survival and less frequent metastasis[J]. Proc Nat l Acad Sci USA,2002,99(25):16203-16208

[5]蘇征,張灝,湯華. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)篩查腸型胃癌發(fā)生發(fā)展中差異基因表達(dá)的研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2009,15(15):2245-2249

[6]Sepulveda AR,Tao H,Carloni E,et al. Screening of gene expression profiles in gastric epithelial cells induced by Heli cobacter pylori using microarray analysis[J]. Aliment Pharmacol Ther,2002,16(2):145-157

[7]謝海龍,周曉軍. 應(yīng)用cDNA微陣列芯片篩選胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的初步研究[J]. 北京大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2004,40(4):505-512

[8]蘭斌,劉炳亞,陳雪華,等. 胃癌細(xì)胞周期基因表達(dá)譜的變化[J]. 中華腫瘤雜志,2006,28(8):568-571

[9]馬萬山,葛汝村,高輝,等. 應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片研究人胃癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因[J]. 中華腫瘤防治雜志,2007,8(8):569-572

[10] Ureshino H,Murakami Y,Watari K,et al. N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1)promotes metastasis of human scirrhous gastric Cancer cells through epithelial mesenchymal transition[J]. PLoS One,2012,7(7):41312

[11] 余曉云,唐欣,劉通順. 基因芯片技術(shù)在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測診斷中的應(yīng)用[J]. 中華消化雜志,2009,29(10):698-700

[12] Natsume H,Shinmura K,Tao H,et al. The CRKL gene encoding an adaptor protein is amplified,overexpressed,and a possible therapeutic target in gastric Cancer[J]. J Transl Med,2012,10(1):97-107

[13] Takei Yoshifumi,Takigahira Misato,Mihara Keichiro,et al. The metastasis-associated microRNA miR-516a-3p is a novel therapeutic target for inhibiting peritoneal dissemination of human scirrhous gastric Cancer[J]. Cancer Res,2011,71(4):1442-1453

[14] Cheong Teak Chin,Shin JiYoung,Chun KyoungHee. Silencing of galectin-3 changes the gene expression and augments the sensitivity of gastric Cancer cells to chemotherapeutic agents[J]. Cancer Sci,2010,101(1):94-102

[15] Claerhout S,Lim JY,Choi W,et al. Gene expression signature analysis identifies vorinostat as a candidate therapy for gastric Cancer[J]. PLoS One,2011,6(9):24662

[16] 吳智群,張瑞,張遠(yuǎn)強(qiáng). 曲古抑菌素A誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞細(xì)胞周期阻滯及其機(jī)制[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2008,18(12):1660-1662

[17] 許慶瑞,張樹明,張俊威,等. 復(fù)方青龍衣膠囊對胃癌細(xì)胞SGC-7901基因芯片表達(dá)的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志,2011,17(8):179-183

[18] 敖慧,彭成,林代華,等. 參術(shù)膠囊治療脾虛胃癌轉(zhuǎn)移鼠模型的基因表達(dá)譜研究[J]. 云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,33(1):7-11

[19] 郭鵬輝,杜燕蕾,聶玉強(qiáng). miR-191在胃癌組織中的表達(dá)及其靶基因的預(yù)測[J]. 世界華人消化雜志,2012,25(25):2347-2352

[20] Ueda T,Volinia S,Okumura H,et al. Relation between microRNA expression and progression and prognosis of gastric Cancer:a microRNA expression analysis[J]. Lancet Oncol,2010,11(2):136-146

[21] Matsuo M,Nakada C,Tsukamoto Y,et al. MiR-29 c is downregulated in gastric carcinomas and regulates cell proliferation by targeting RCC2[J]. Mol Cancer,2013,12(264):15-23

[收稿日期]2015-11-30

[中圖分類號]R735.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)12-1363-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.12.040