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    高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定乳品中左旋肉堿含量

    2016-02-23 07:39:39徐敦明余宇成儲曉剛
    分析測試學(xué)報 2016年1期
    關(guān)鍵詞:高效液相色譜

    徐敦明,陳 燕,張 縉,余宇成,馮 峰,張 峰,儲曉剛

    (1.廈門出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術(shù)中心,福建 廈門 361026;2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院

    食品安全研究所,北京 100123)

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    高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定乳品中左旋肉堿含量

    徐敦明1*,陳燕1,張縉1,余宇成1,馮峰2,張峰2,儲曉剛2

    (1.廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心,福建廈門361026;2.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院

    食品安全研究所,北京100123)

    摘要:建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定乳品中左旋肉堿含量的方法。樣品經(jīng)0.1 mol/L HCl溶解,采用乙腈溶液沉淀蛋白,以HILIC色譜柱分離待測物,采用鞘流電噴霧離子化,正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測,內(nèi)標(biāo)法定量。在3個加標(biāo)水平下,左旋肉堿的平均加標(biāo)回收率為85.2%~102.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=6)為7.6%~14.3%,方法檢出限(LOD)為50 μg/kg,定量下限(LOQ)為200 μg/kg。運用該方法對20個乳品樣品中的左旋肉堿含量進(jìn)行測定,檢出含量為68 ~165 mg/kg,與樣品標(biāo)簽的符合率達(dá)95%。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確,適用于乳品中左旋肉堿含量的測定。

    關(guān)鍵詞:高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;左旋肉堿;乳品;內(nèi)標(biāo)

    Determination ofL-Carnitine in Dairy Products by High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass SpectrometryXU Dun-ming1*,CHEN Yan1,ZHANG Jin1,YU Yu-cheng1,FENG Feng2,ZHANG Feng2,CHU Xiao-gang2

    (1.Technical Center of Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Xiamen361026,China;2.Institute of

    Food Safety,Chinese Academy of Inspection and Quarantine,Beijing100123,China)

    Abstract:A method of HPLC-MS/MS with internal standard for the determination of L-carnitine in dairy products was developed.After the sample was dissolved in 0.1 mol/L HCl solution and its protein was precipitated with acetonitrile,the object was separated with a HILIC chromatographic column,tested by HPLC-MS/MS with sheath flow electro-spray ionization under positive ion scanning and multiple reaction monitoring(MRM) mode,and quantified by the internal standard method.The average recoveries at three spiked levels were in the range of 85.2%-102.0% with RSDs(n=6) of 7.6%-14.3%.The limit of detection (LOD) was 50 μg/kg and the limit of quantitation(LOQ) was 200 μg/kg.The proposed method was applied in the analysis of several real samples of different origins from overseas,and 20 samples were screened for L-carnitine with content range of 68-165 mg/kg,of which only 1 sample did not match with the label.This method was rapid,simple and accurate,and was suitable for the determining of L-carnitine content in dairy products. [3]Zhong X L,Chen J,Yu Y H.Inorg.Anal.s China(鐘新林,陳軍,余彥海.中國無機(jī)分析化學(xué)),2012,2:71-74.

    Key words:HPLC-MS/MS;L-carnitine;dairy products;internal standard

    左旋肉堿(L-Carnitine),又稱卡尼丁或L-肉堿,存在于大多數(shù)哺乳動物組織中,能夠促進(jìn)脂肪酸向線粒體中傳輸,達(dá)到氧化分解脂肪的功效[1]。左旋肉堿不僅在能量產(chǎn)生和脂肪代謝過程中起重要作用,而且在維持嬰兒生命及促進(jìn)嬰幼兒發(fā)育的某些生理過程,如生酮作用、氮代謝等方面均具有一定的功能。由于嬰兒自身合成左旋肉堿的能力較弱,因此必須通過補(bǔ)充外源性左旋肉堿才能滿足身體需要[2]。目前,世界上已有22個國家允許在嬰兒奶粉中添加左旋肉堿[3]。我國也規(guī)定可在嬰幼兒奶粉中添加適量的左旋肉堿。國家強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)GB 14880-2012中規(guī)定左旋肉堿在兒童用調(diào)制乳粉中的添加量為50~150 mg/kg,其它用途調(diào)制乳粉為300~400 mg/kg[4]。GB 10765-2010[5]及 GB 10767-2010[6]中規(guī)定左旋肉堿為可選擇性成分,如需添加,添加量最小值為0.3 mg/100 kJ。

    目前,國內(nèi)外已報道的左旋肉堿測定方法主要包括分光光度法[7-9]、免疫法[10-11]、毛細(xì)管電泳法[12]、離子色譜法[3,13]、液相色譜法[14-17]以及質(zhì)譜法[2,18]等。但分光光度法需酶解且檢出限高,離子色譜或液相色譜法的特異性差。GB 29989-2013[9]采用分光光度法,干擾大,無法進(jìn)行確證實驗。文獻(xiàn)報道的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2],基質(zhì)效應(yīng)顯著,影響分析的準(zhǔn)確性。為保障消費者權(quán)益,加強(qiáng)對奶粉市場的監(jiān)管,建立快速、簡便、可靠、準(zhǔn)確的左旋肉堿測定方法十分必要。針對現(xiàn)有方法的缺點,本文建立了特異性強(qiáng)、靈敏度高的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定奶粉中的左旋肉堿含量。

    1實驗部分

    1.1儀器與試劑

    Agilent 6460三重四極桿質(zhì)譜儀,配Agilent 1290高效液相色譜儀(美國Agilent公司),Agilent Jet Stream電噴霧離子源(AJS ESI);高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);渦旋混勻器;Milli-Q超純水系統(tǒng)。

    乙腈、甲醇(色譜純,德國Merck公司),甲酸(色譜純,Fisher公司),氨水(分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),濃鹽酸(優(yōu)級純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì):左旋肉堿和左旋肉堿(d3)內(nèi)標(biāo)物(純度均大于98%,德國Dr.Ehrensterfer公司)。

    稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈-水(90∶10)溶液配成1 000 mg/L的儲備液,儲存于0~4 ℃冰箱。根據(jù)實驗需要,用乙腈-水(90∶10)溶液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    SPE小柱(3 mL,60 mg,Waters公司):WCX(混合型弱陽離子交換柱)、HLB(親水親脂小柱)、MCX(混合型陽離子交換柱)。

    1.2樣品前處理

    1.2.1提取稱取1.00 g(精確至0.01 g)乳品樣品于250 mL三角瓶中,加入100 μg左旋肉堿(d3)內(nèi)標(biāo)液、30 mL 0.1 mol/L的HCl溶液,渦旋振蕩1 min,超聲提取15 min后,移入100 mL容量瓶中,用10 mL 0.1 mol/L HCl分2次涮洗三角瓶,洗滌液移入容量瓶中,以0.1 mol/L HCl定容至100 mL,取1 mL提取液于20 mL試管中,加入9 mL乙腈溶液,渦旋混勻1 min后取部分于5 mL離心管,16 000 r/min離心5 min,所得上清液待凈化。

    1.2.2SPE凈化強(qiáng)陽離子交換柱分別用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 10 mmol/L 的鹽酸水溶液進(jìn)行活化,移取1 mL上述上清液以1滴/秒的速度過柱,完成后用3 mL 10 mmol/L 的鹽酸水溶液淋洗,最后用2 mL 4%氨水甲醇溶液洗脫。洗脫液于40 ℃經(jīng)氮吹至近干后,用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL,過濾膜后,供測定。

    表1 左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

    *quantitative ion;CE:collision energy;F:fragmentor voltage

    1.2.3LC-MS/MS條件色譜柱:Agilent HILIC(100 mm× 2.1 mm,3.5 μm)。流動相:A為0.1%甲酸水,B為乙腈;洗脫梯度程序:0 ~2.0 min,90%B,2.01 ~6.0 min,90%~45%B,6.01 ~10.0 min,45%~90%B;流速:0.3 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:2 μL。采用AJS ESI源,正離子多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。霧化氣壓力:310.3 kPa;噴嘴電壓:500 V;干燥氣:溫度300 ℃,流速10 L/min;鞘氣:溫度325 ℃,流速8 L/min;毛細(xì)管電壓:3 500 V。左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物的定量和定性離子、碰撞能量和碎裂電壓等參數(shù)見表1。

    2結(jié)果與討論

    2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    使用目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液,優(yōu)化左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜條件。在Scan模式下,化合物進(jìn)入一級質(zhì)譜后,可產(chǎn)生穩(wěn)定的[M+H]+離子,并確定為化合物母離子;在SIM模式下,對化合物的碎裂電壓進(jìn)行優(yōu)化;母離子進(jìn)入二級質(zhì)譜,將發(fā)生斷裂或重排等反應(yīng)產(chǎn)生不同的離子碎片;在Product ion 模式下,對化合物母離子施加一定的碰撞能量后,得到其相應(yīng)的離子碎片;最后在MRM模式下,優(yōu)化目標(biāo)物離子碎片的最佳碰撞能量。左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物的最佳質(zhì)譜參數(shù)見表1,圖1為左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖和MRM色譜圖。

    2.2色譜條件的優(yōu)化

    通過結(jié)構(gòu)與性質(zhì)分析,可知左旋肉堿屬于極性較強(qiáng)的化合物,因此,在反相色譜柱上很難被保留,若使用C18等反相色譜柱,通常需加入離子對試劑,但該操作繁瑣、試劑用量大且易污染儀器。而正相色譜柱對強(qiáng)極性物質(zhì)有較好的保留。本研究比較了C18色譜柱和HILIC色譜柱對左旋肉堿的保留效果,結(jié)果顯示,C18色譜柱對目標(biāo)化合物的保留效果差,約1.4 min出峰,而HILIC柱的保留能力較強(qiáng),約3.7 min出峰。因此,本實驗選用Agilent-HILIC(100 mm × 2.1 mm,3.5 μm)作為分離色譜柱。

    目標(biāo)化合物采用MRM正離子掃描模式,有機(jī)相常選用乙腈溶液,水相通常使用甲酸水、乙酸銨溶液或兩者混合溶液。通過對比發(fā)現(xiàn),選用0.1%甲酸水溶液作為水相時,目標(biāo)化合物的靈敏度與分離效果最好,參考保留時間為3.65 min,標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1A。因此,實驗選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相。

    2.3樣品前處理優(yōu)化

    左旋肉堿屬于極性較強(qiáng)的化合物,因此水可作為其提取溶劑。然而,乳品中含有蛋白質(zhì)等大量的化合物,若直接用水提取,雜質(zhì)將一并被提取出,影響左旋肉堿在質(zhì)譜中的離子化效率,從而影響分析測定的準(zhǔn)確性。本文選用0.1 mol/L HCl溶液作為提取溶劑,既可以除去部分雜質(zhì),也可以促使左旋肉堿以游離狀態(tài)溶于溶液中,超聲15 min,可使左旋肉堿被充分提取。

    實驗發(fā)現(xiàn)乳品中含有大量的干擾物質(zhì),基質(zhì)效應(yīng)明顯,對分析目標(biāo)物的抑制作用顯著。比較了不同固相萃取柱對樣品回收率的影響,結(jié)果表明,左旋肉堿在WCX與HLB柱中會隨淋洗液流失,目標(biāo)化合物在淋洗液中有檢出。采用MCX柱時,左旋肉堿的回收率大于80%,因此選用MCX柱進(jìn)行后續(xù)實驗。將本方法的加標(biāo)回收率與竺琴等[2]報道的方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明,兩種前處理方法的測定值差距較大,可達(dá)10倍差距。分析其原因,主要是由于基質(zhì)效應(yīng)引起。實際樣品測定及加標(biāo)回收實驗結(jié)果表明,本文前處理方法的測定值更符合標(biāo)簽值或?qū)嶒炋砑恿俊?/p>

    進(jìn)一步比較了甲醇-水(1∶1,含75 mmol/L吡啶)和4%氨水甲醇的洗脫效果,結(jié)果表明,采用4%氨水甲醇進(jìn)行洗脫時的回收率較甲醇水洗脫時高。同時比較了乙腈、乙腈-水、0.1%甲酸水、甲醇和4%氨水甲醇作為定容溶劑的影響,結(jié)果顯示,選用0.1%甲酸水作為定容溶劑時,質(zhì)譜響應(yīng)更好,峰形更佳。因此,本方法選用4%氨水甲醇作為洗脫溶劑,0.1%甲酸水作為定容溶劑。

    2.4線性范圍、檢出限與定量下限

    在優(yōu)化條件下,用乙腈-水(90∶10)溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度分別為0.200,0.500,1.00,5.00,20.0,50.0,100,200 mg/L的系列左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物(0.1 mg/L)標(biāo)準(zhǔn)混合溶液,采用本方法進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(x,mg/L),定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,左旋肉堿及其內(nèi)標(biāo)物在0.200~200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,左旋肉堿的線性方程為y=2 413x- 1 778,相關(guān)系數(shù)為0.999 7。通過在不含左旋肉堿的乳品樣中添加標(biāo)準(zhǔn)品,按本方法進(jìn)行測定,以信噪比S/N=3計算檢出限(LOD),信噪比S/N=10計算定量下限(LOQ),得到左旋肉堿的LOD為50 μg/kg,LOQ為200 μg/kg。

    2.5準(zhǔn)確度與精密度

    取3種不同的乳品樣品,按照本方法測定左旋肉堿本底含量后,向樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品,使樣品扣除本底外左旋肉堿的含量分別為40,60,80 mg/kg,平行測定6次,計算加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表2。左旋肉堿的平均加標(biāo)回收率為85.2%~102.0%,RSD為7.6%~14.3%。表明本方法準(zhǔn)確度高,重復(fù)性好,能夠滿足乳品樣品中左旋肉堿含量的測定要求。

    表2 左旋肉堿的平均回收率與精密度(n=6)

    2.6實際樣品的檢測

    采用本文建立的方法,對20個實際乳品樣品中的左旋肉堿含量進(jìn)行測定,檢出含量為68 ~165 mg/kg,與樣品標(biāo)簽的符合率達(dá)95%(見表3)。1個實際樣品中左旋肉堿的總離子流圖見圖2。

    3結(jié)論

    本文采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法測定了乳品中的左旋肉堿含量。使用0.1 mol/L HCl溶液對樣品進(jìn)行提取,采用乙腈溶液沉淀蛋白,通過MCX小柱對樣品進(jìn)行凈化后,以HILIC色譜柱分離,選擇0.1%甲酸水-乙腈為流動相洗脫,采用鞘流電噴霧離子化,MRM模式檢測,內(nèi)標(biāo)法定量。在最佳條件下,左旋肉堿的平均加標(biāo)回收率為85.2%~102.0%,RSD為7.6%~14.3%,方法的LOD為50 μg/kg,LOQ為200 μg/kg。使用該方法對20個實際乳品樣品中的左旋肉堿含量進(jìn)行測定,檢出量為68 ~165 mg/kg,與樣品標(biāo)簽的符合率達(dá)95%。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確,適用于乳品中左旋肉堿含量的測定。

    表3 20種實際樣品中左旋肉堿的標(biāo)簽值與測定值

    *no matching with the label

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    中圖分類號:O657.63

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1004-4957(2016)01-0096-05

    doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.016

    通訊作者:*徐敦明,博士,研究員,研究方向:食品安全研究與檢測,Tel:0592-3269935,E-mail:Xudm@xmciq.gov.cn

    基金項目:質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項項目(2012104002);行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)項目(2014B087)

    收稿日期:2015-06-04;修回日期:2015-08-05

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