間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)外傷性脊髓損傷修復(fù)的相關(guān)機(jī)制

鄒禮梁，王奎，陳健爾

間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)外傷性脊髓損傷修復(fù)的相關(guān)機(jī)制

鄒禮梁，王奎，陳健爾

據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年有25～50萬人發(fā)生脊髓損傷（SCI）事件，年齡多在16～30歲[1]。根據(jù)其發(fā)病機(jī)理，脊髓損傷可分為原發(fā)性脊髓損傷和繼發(fā)性脊髓損傷，原發(fā)性脊髓損傷是不可逆的，繼發(fā)性損傷可通過干預(yù)手段如手術(shù)治療、藥物干預(yù)及干細(xì)胞移植等手段進(jìn)行調(diào)控促進(jìn)損傷的修復(fù)。然而，手術(shù)治療容易引起二次損傷，激素治療作用相對(duì)局限且不良反應(yīng)較大。近年來，干細(xì)胞成為SCI治療的新選擇，尤其是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，其來源廣泛、取材便利、易于純化、細(xì)胞自我更新能力強(qiáng)、可多向分化且可自體移植，克服了倫理和免疫排斥等問題。MSCs促進(jìn)SCI修復(fù)的作用機(jī)制也逐漸得到闡明，其可能相關(guān)機(jī)制主要有干細(xì)胞的替代填充機(jī)制，抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬機(jī)制，調(diào)節(jié)炎癥、改善局部微環(huán)境機(jī)制、促進(jìn)血管新生機(jī)制以及促進(jìn)軸突抽芽生長(zhǎng)機(jī)制等方面。本研究擬闡述MSCs促進(jìn)SCI修復(fù)的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 細(xì)胞填充、替代作用促進(jìn)SCI修復(fù)

MSCs在SCI部位具有填充脊髓空洞和替代受損組織作用。Boido等[2]通過形態(tài)測(cè)定分析顯示MSCs移植組的脊髓壞死灶體積與對(duì)照組相比縮小了31.6%，并發(fā)現(xiàn)遷移至損傷區(qū)域的MSCs能穿透膠質(zhì)囊性區(qū)，逐步填充脊髓空洞區(qū)域，替代受損組織，抑制損傷部位囊性空洞的繼續(xù)形成。顧衛(wèi)東等[3]報(bào)道SCI模型MSCs移植組相對(duì)PBS注射組，其脊髓空洞體積顯著縮小，脊髓殘存白質(zhì)的面積明顯偏大且受損脊髓的病理改變也得到明顯改善。這可能與MSCs具有多向分化的潛能，能在脊髓微環(huán)境的作用下定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等特定的神經(jīng)組織有關(guān)[4]。因?yàn)檫@些定向分化為神經(jīng)元樣的細(xì)胞聚集和填充于脊髓囊性病變區(qū)后，可在一定程度上替代損傷或壞死的神經(jīng)組織，抑制損傷區(qū)囊性空洞的繼續(xù)形成，從而促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)[2]。

2 抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞自我吞噬

脊髓發(fā)生損傷后會(huì)引起受損部位細(xì)胞凋亡（Ⅰ型程序性死亡）和細(xì)胞自我吞噬死亡（Ⅱ型程序性死亡），這也阻礙神經(jīng)的修復(fù)和脊髓功能的恢復(fù)。而Jun-Lin等[5]報(bào)道植入體內(nèi)的MSCs可通過抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞自我吞噬保存殘留的神經(jīng)組織，為脊髓的修復(fù)提供一定的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.1 抑制細(xì)胞凋亡MSCs能合成和分泌抑制細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，比如B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、生存蛋白和蛋白激酶B（Akt）等[6]。其中Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，它可抑制細(xì)胞凋亡蛋白酶活化劑的釋放，從而減少細(xì)胞凋亡。MSCs除了能合成直接抑制細(xì)胞凋亡的蛋白質(zhì)，還能分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF），介導(dǎo)局部黏著斑激酶（FAK）磷酸化參與抗細(xì)胞凋亡過程。

2.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞自我吞噬細(xì)胞自我吞噬具有兩方面的含義：（1）細(xì)胞自噬觸發(fā)細(xì)胞死亡程序?qū)е录?xì)胞死亡，即細(xì)胞自我吞噬死亡（Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡），多是由傷害性因素引起，如細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞；（2）細(xì)胞通過自噬現(xiàn)象保持細(xì)胞的自我更新和分化能力，即細(xì)胞干性的保持（程序性細(xì)胞存活），主要由內(nèi)源性因素引起，如細(xì)胞的衰老和組織的再生[7]。細(xì)胞自我吞噬可表達(dá)兩個(gè)重要標(biāo)志物：微管相關(guān)蛋白輕鍵3B和自噬基因Beclin-1[8]。輕鍵3B與Beclin-1均參與自噬體的形成，可用于檢測(cè)細(xì)胞自噬行為[9]。Yin等[10]報(bào)道在脊髓缺血或缺血再灌注損傷大鼠的脊髓中輕鍵3B和Beclin-1出現(xiàn)高表達(dá)現(xiàn)象，而MSCs移植后輕鏈3B和Beclin-1的表達(dá)出現(xiàn)明顯的減弱，可見脊髓損傷后自噬體形成增多，而MSCs移植后自噬體的形成減少，降低了細(xì)胞自我吞噬的發(fā)生，從而有利于保存損傷區(qū)域的神經(jīng)組織，為脊髓修復(fù)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

3 調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善局部微環(huán)境

SCI后血脊髓屏障被破壞，炎癥細(xì)胞聚集，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞隨同常駐的小膠質(zhì)細(xì)胞趨化浸潤(rùn)，從而產(chǎn)生質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）以及其他水解蛋白酶和氧化酶、前炎性細(xì)胞活素，局部微環(huán)境進(jìn)一步被破壞[11]。

MSCs植入體內(nèi)后自身可分泌多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子[腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（GDNF）等]，抵抗NO介導(dǎo)的谷氨酸神經(jīng)細(xì)胞毒性，保護(hù)神經(jīng)元免受細(xì)胞毒性侵害；調(diào)節(jié)自由基代謝，增加超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶等在神經(jīng)元內(nèi)的含量，減少自由基積聚，保護(hù)神經(jīng)元免受自由基的攻擊[12]。BDNF還可協(xié)同NGF、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等生長(zhǎng)因子，刺激MSCs分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，更進(jìn)一步促進(jìn)BDNF等營(yíng)養(yǎng)因子的分泌[13]，改善受損部位微環(huán)境，促進(jìn)神經(jīng)組織修復(fù)。

Urdzíková等[11]發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)鞘內(nèi)移植MSCs后腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素4（IL-4）、IL-1、IL-2、IL-6和IL-12的水平相對(duì)減少，而巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1（M IP-1）和依賴激活正常T細(xì)胞表達(dá)分泌的調(diào)節(jié)蛋白（RANTES）的水平有所增加，有效地減少炎癥反應(yīng)，而且多次重復(fù)植入干細(xì)胞能維持干細(xì)胞在損傷處產(chǎn)生的抗炎癥反應(yīng)等積極作用。此外，Lynch等[14]報(bào)道，損傷部位的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后，其細(xì)胞形態(tài)常表現(xiàn)為突起回縮，胞體相對(duì)增大乃至呈巨噬細(xì)胞樣能采用阿米巴樣的運(yùn)動(dòng)形式移向損傷區(qū)域，充當(dāng)吞噬細(xì)胞的作用，清除凋亡細(xì)胞碎片，減輕炎癥反應(yīng)，但其移行機(jī)制目前仍不清楚。

4 促進(jìn)SCI區(qū)域血管新生和血管重建

血管生成在SCI修復(fù)作用機(jī)制中起著關(guān)鍵性作用[15]。SCI后神經(jīng)纖維的再生，突觸的重建，組織的修復(fù)和功能的恢復(fù)，都需要血液的供應(yīng)和營(yíng)養(yǎng)的支持[16]。MSCs主要是通過分泌VEGF、血管生成素-1（Ang-1）和bFGF等促進(jìn)脊髓損傷處的血管新生，穩(wěn)定血管網(wǎng)絡(luò)[17]。

4.1 VEGF VEGF作為一種多功能細(xì)胞因子，能促使血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、遷移及存活，促進(jìn)血管新生和血管重建[18]。Hyuk等[19]將VEGF和PBS分別注入兩組大鼠體內(nèi)，并通過測(cè)量血管假血友病因子（vWF）陽(yáng)性血管密度來確定血管生成的程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF顯著增加了SCI區(qū)域vWF陽(yáng)性血管的密度，而且是PBS組的5倍多，這表明VEGF可明顯促進(jìn)SCI區(qū)域血管的生成。VEGF主要是與內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體-1（VEGFR-1）和VEGFR-2結(jié)合激活胞內(nèi)酪氨酸激酶，并通過觸發(fā)下游多種信號(hào)通路促進(jìn)血管新生[20]；從而改善損傷區(qū)域微循環(huán)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。

4.2 bFGF bFGF具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖和分化，促進(jìn)血管新生等生物學(xué)作用。馬秀現(xiàn)等[21]報(bào)道bFGF能促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞快速增殖和分化，促使微血管生長(zhǎng)分化，增加局部毛細(xì)血管數(shù)量。Toshihiro等[22]報(bào)道，bFGF較VEGF更顯著地促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但相比而言也更容易引起血管炎癥反應(yīng)。

4.3 Ang-1 Ang-1是一種分泌性的蛋白分子，可促進(jìn)胞漿素及基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的分泌，激活絲氨酸蘇氨酸蛋白酶AKT，穩(wěn)定細(xì)胞活力，抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減少血管的萎縮和退化，穩(wěn)定血管網(wǎng)絡(luò)[23]。為組織提供血液和營(yíng)養(yǎng)支持，改善損傷組織微環(huán)境從而促進(jìn)SCI傷口恢復(fù)。Herrera等[24]報(bào)道SCI后（6 h內(nèi)）Ang-1表達(dá)顯著下降可能與脊髓損傷后大量Ang-1被用來代償損傷部位低蛋白水平，修復(fù)和穩(wěn)定損傷區(qū)域血管等密切相關(guān)。Herrera等[25]通過核磁共振成像(MRI)觀察發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用VEGF和Ang-1后，SCI病灶體積明顯縮小，而且SCI區(qū)域血管網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定得到維持。

此外，MSCs還自分泌或旁分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3（NT-3）、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-（TGF-)等細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及存活等生物學(xué)意義。

5 促進(jìn)SCI區(qū)域神經(jīng)軸突抽芽和生長(zhǎng)

顧衛(wèi)東等[3]通過脊髓埋管實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，種有MSCs的導(dǎo)管中可見有新生軸突長(zhǎng)入，未種MSCs的導(dǎo)管中沒有發(fā)現(xiàn)軸突生長(zhǎng)。Yin等[10]通過免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)方法發(fā)現(xiàn)，與未植入MSCs的大鼠相比，已植入MSCs的大鼠的軸突再生標(biāo)志物、神經(jīng)元標(biāo)志物、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（GAP-43）和微管相關(guān)蛋白2（MAP-2）表達(dá)都明顯增高。這都說明了MSCs具有促進(jìn)神經(jīng)軸突抽芽生長(zhǎng)的作用。Liu等[26]通過對(duì)MSCs進(jìn)行bFGF基因轉(zhuǎn)染后移植到急性脊髓損傷的大鼠中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過bFGF基因轉(zhuǎn)染后的MSCs可以大量分泌bFGF等生長(zhǎng)因子，有效地促進(jìn)脊髓損傷區(qū)域軸突的抽芽再生，有利于大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。此外，MSCs還能合成細(xì)胞外基質(zhì)成分，如層黏連蛋白、纖維連接蛋白，為組織提供營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)支持，引導(dǎo)軸突的生長(zhǎng)，支持軸突再生，修復(fù)脊髓損傷區(qū)域[27]。

此外，脊髓受到損傷后，脊髓組織中一些對(duì)生長(zhǎng)錐起負(fù)效應(yīng)的蛋白或因子的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，不利于軸突的抽芽和生長(zhǎng)[28]。而MSCs分泌的多種細(xì)胞因子可以在一定程度上拮抗神經(jīng)生長(zhǎng)抑制因子，逆轉(zhuǎn)NO介導(dǎo)的谷氨酸細(xì)胞毒性，減少自由基積聚，保護(hù)神經(jīng)組織免受細(xì)胞毒性和自由基的侵害。

6 展望

MSCs在促進(jìn)外傷性SCI修復(fù)方面具有非常廣闊的應(yīng)用前景，但我們對(duì)其各種修復(fù)機(jī)制的研究與認(rèn)識(shí)尚存在一些問題和不足：（1）MSCs自/旁分泌對(duì)脊髓損傷區(qū)域微環(huán)境改變的相關(guān)機(jī)制還沒有統(tǒng)一的定論；（2）MSCs移植至體內(nèi)后，機(jī)體內(nèi)的相關(guān)因子或蛋白是如何對(duì)干細(xì)胞的存活、增殖和分化進(jìn)行調(diào)控；（3）目前機(jī)制研究主要以單一疾病模型的動(dòng)物為研究對(duì)象，而MSCs在人體內(nèi)的相關(guān)機(jī)制將更為復(fù)雜，需要更進(jìn)一步的臨床評(píng)估與研究。此外，MSCs植入受損機(jī)體的最佳時(shí)間、最優(yōu)植入途徑，以及移植治療的臨床安全性仍有待在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)中做進(jìn)一步的研究。只有明確了MSCs在不同的時(shí)間點(diǎn)通過不同的移植途徑植入機(jī)體后對(duì)機(jī)體微環(huán)境造成的影響，明確微環(huán)境出現(xiàn)各種變化的機(jī)制原理，才能確保臨床應(yīng)用的安全性和效用的最大化，進(jìn)而科學(xué)地指導(dǎo)和推進(jìn)MSCs的臨床應(yīng)用。

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1671-0800(2016)10-1404-03

2015-06-17

（本文編輯：鐘美春）

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012C33066）；浙江省中醫(yī)藥科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012ZA123）

310053杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)

陳健爾，Email:cje28@foxmail.com