金櫻子總黃酮的含量測定及酶提工藝優(yōu)化

山光強，陳志剛，許廣人，雷紅宇，譚玉琴，蘇建明

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙410128）

金櫻子總黃酮的含量測定及酶提工藝優(yōu)化

山光強§，陳志剛§，許廣人，雷紅宇，譚玉琴，蘇建明＊

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，長沙410128）

摘 要：為了測定金櫻子中的總黃酮含量，并對其纖維素酶輔助提取工藝進行優(yōu)化，本研究以蘆丁為對照品，采用雙波長分光光度法，確定測定波長500nm，參比波長580nm，對金櫻子中的總黃酮含量進行測定；以總黃酮得率為評價指標，考察提取溫度、乙醇濃度、纖維素酶用量、液料比等4個因素對總黃酮得率的影響，正交優(yōu)化纖維素酶輔助提取金櫻子總黃酮的工藝。結果表明，在19.90～398.00μg范圍內(nèi)，蘆丁的質量與吸光度差值ΔA呈良好的線性關系（r＝0.9981），標準曲線方程為y＝0.0008x－0.0047，該方法下測得其得率為87.94mg／g，平均加樣回收率98.23%，相對標準偏差為8.77%；正交試驗優(yōu)化的纖維素酶法輔助提取金櫻子總黃酮的最佳工藝條件為：提取溫度80℃、乙醇濃度40%、纖維素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取時間90min、pH為6.0、提取次數(shù)2次，且各因素對金櫻子總黃酮提取得率的影響順序為：提取溫度＞纖維素酶用量＞液料比＞乙醇濃度；在該提取條件下，金櫻子總黃酮得率為（93.35±3.15）mg／g。因此，纖維素酶法輔助提取金櫻子總黃酮可行，得率較高，條件溫和。

關鍵詞：金櫻子；總黃酮；纖維素酶；正交試驗；雙波長分光光度法

金櫻子（RosalaevigataMichx.）為薔薇科薔薇屬植物，又名刺榆子、糖罐子、糖缽、金壺瓶，其果實味甜，是一種食藥兼用的植物［1－2］?！侗静菥V目》記載金櫻子“性酸、澀、平、無毒；主治脾瀉下痢，止水便利，澀精氣，久服令人耐寒輕身，補血益精，有奇效”［3］。目前的藥理學研究發(fā)現(xiàn)，金櫻子果實具有保肝護腎［4－6］、抗氧化［7］、清除自由基［8］及降糖降脂［9］等藥理活性，且金櫻子總黃酮（total flavonoids fromRosalaevigataMichx.，TFRx）對四氯化碳［10］、高脂食物［11］及對乙酰氨基酚［12］誘導的肝臟損傷有很好的保護作用，亞慢性毒性研究表明TFRx毒副作用?。?3］。

目前，用于黃酮檢測和定量分析的方法很多。其中，雙波長分光光度法較HPLC法和熒光光度法等方法儀器易得，操作簡便，價格低廉，而且該法能最大限度地克服底物中其他組分對黃酮波長測定的干擾，使得測定結果更為準確可靠，穩(wěn)定性更佳［14－15］。正交試驗設計是一種有效處理多因素優(yōu)化問題的科學方法，能迅速有效地實現(xiàn)對部分因素的優(yōu)化［16］。本研究在前期單因素試驗［17］的基礎上，采用乙醇－纖維素酶法輔助提取TFRx，以提取溫度、乙醇濃度、纖維素酶用量、液料比等4個影響因素為主要考察指標設計正交試驗，以期獲得提取TFRx的最佳工藝，為金櫻子的進一步開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1材料與試劑 金櫻子購自湖南省長沙市楚濟堂大藥房；蘆丁標準品、纖維素酶（≥1 800U／mg）均購自上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、鹽酸、九水硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉均為分析純；試驗所用水為超純水。

1.1.2儀器 FW177中草藥粉碎機購自天津市泰斯特儀器有限公司；UV－6100S紫外－可見分光光度計購自上海元析儀器有限公司；0.45μm有機針筒過濾器購自上海興亞凈化材料廠；GRX6干熱消毒箱購自上海精宏實驗設備有限公司；AY220電子分析天平（SHIMADZU）、40目標準檢驗篩均購自杭州蕭山永發(fā)電器有限公司；DK－98－IIA電熱恒溫水浴鍋購自天津市泰斯特儀器有限公司；CF16RXII冷凍高速離心機（Hitachi Koki）。

1.2試驗方法

1.2.1TFRx含量測定

1.2.1.1蘆丁標準品溶液的配制 精密稱取19.9mg蘆丁標準品，加入70%乙醇溶液，水浴溶解，定容至100mL容量瓶，得濃度為199.0μg／mL蘆丁標準品溶液，4℃冰箱保存，備用。

1.2.1.2供試品溶液的配制 金櫻子烘干，粉碎，過40目篩，得恒重金櫻子粉末，室溫封存，備用。準確稱取1.0g粉末于50mL離心管，按照液料比40∶1，加入30%乙醇溶液和1.0%纖維素酶，調節(jié)pH至6.0，攪拌均勻，封口，在60℃恒溫下水浴提取90min；提取完成，迅速將離心管放入90℃恒溫水浴鍋，滅活酶30s，離心，取出上清液；濾渣重復上述操作；合并2次提取液，定容至100mL。取溶液適量二次離心，上清液經(jīng)過濾器過濾，得供試品溶液，4℃冰箱保存，備用。

1.2.1.3顯色及測定方法 參照郭建紅等［14］、郭亞健等［18］、李慕春等［19］方法，分別精密吸取一定量的蘆丁標準品溶液或供試品溶液于10mL容量瓶，補加70%乙醇溶液至5mL，搖勻，然后加入0.3mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，靜置5min，再加入0.3mL 10%硝酸鋁，搖勻，靜置6min后，加入4mL 4%氫氧化鈉，補加0.4mL 70%乙醇溶液，搖勻靜置15min，以試劑空白為參比溶液，分別在測定波長和參比波長下進行測定。

1.2.1.4測定波長和參比波長的選擇 分別精密量取0.2mL供試品溶液與0.8mL蘆丁標準品溶液，按1.2.1.3方法顯色，以試劑空白為對照，在400～700nm范圍內(nèi)進行光譜掃描，掃描結果結合相關報道［12，14，19－20］，確定出該試驗的測定波長和參比波長。

1.2.1.5標準曲線繪制 分別精密量取0、0.1、0.3、0.6、1.0、1.5、2.0mL蘆丁標準品溶液，按1.2.1.3方法顯色。以標準品質量為橫坐標，吸光度差值ΔA＝A測－A參比為縱坐標，繪制標準曲線，擬合回歸曲線方程。

1.2.1.6樣品含量測定 精密量取一定體積的供試品溶液，按1.2.1.3方法項下操作，測定吸光度A測和A參比，并計算出其差值ΔA。將吸光度差值ΔA代入回歸曲線方程，計算出吸取樣品中TFRx含量m1，求TFRx得率。

1.2.2方法學考察

1.2.2.1精密度試驗 精密量取一定量標準品溶液各5份，每份1mL，按1.2.1.3方法測定吸光度A測和A參比，并計算出其差值ΔA，ΔA平均值與RSD。

1.2.2.2加樣回收率試驗 取供試品溶液9份，每份0.2mL，分3組，各組分別加入0.2、0.5、0.8mL已知濃度的蘆丁標準品溶液，混勻，按1.2.1.3方法測定吸光度A測和A參比，并計算出其差值ΔA、加樣回收率、平均加樣回收率與RSD。

1.2.3正交試驗設計 根據(jù)前期試驗結果，以提取溫度（A）、乙醇濃度（B）、纖維素酶用量（C）和液料比（D）等4個因素為主要考察指標設計正交試驗，采用L9（34）進行正交試驗（表1）。按照1.2.1.3的方法，考察各因素各水平對TFRx得率的影響。

表1　正交試驗因素與水平關系Table 1 Orthogonal test factors and levels relationship

2 結果與分析

2.1測定波長和參比波長的選擇

測定波長和參比波長的選擇見圖1。由圖1可知，供試品的最大吸收波長為496nm，標準品的最大吸收波長為510nm。因此，選取500nm為TFRx的測定波長，580nm為參比波長。

圖1　測定波長和參比波長的選擇Fig.1 Choosing of measuring wavelength and reference wavelength

2.2 標準曲線繪制

標準曲線見圖2，方程為y＝0.0008x－0.0047，其中y代表吸光度差值，x代表樣品質量。由圖2可知，蘆丁標準品的質量在19.90～398.00μg范圍內(nèi)線性關系良好（r＝0.9981）。

圖2　標準曲線Fig.2 Standard curve

2.3方法學考察

2.3.1精密度試驗 精密度試驗結果見表2。由表2可知，標準品溶液的RSD為1.24%，符合精密度試驗要求，表明該方法具有良好的精密度，結果可靠。

表2　精密度試驗結果Table 2 The results of precision experiments

2.3.2加樣回收率試驗 加樣回收率試驗結果見表3。由表3可知，平均加樣回收率為98.23%，RSD為8.77%，符合加樣回收率試驗要求，表明該方法適合用于TFRx的含量測定，其結果的準確度較好。

表3　加樣回收率試驗結果Table 3 The results of recovery test

2.4正交試驗

2.4.1正交試驗結果 極差分析結果表明，影響TFRx提取得率的因素，按照由強到弱的順序依次為A、C、D、B，即A＞C＞D＞B（表4）。因此，提取TFRx的最佳條件即為A3B2C1D3，即提取溫度80℃、乙醇濃度40%、纖維素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取時間90min、pH 6.0、提取次數(shù)2次。

表4　正交試驗結果Table 4 The results of orthogonal test

2.4.2驗證試驗結果 在正交試驗分析所得最佳提取條件下，按1.2.1.2的方法進行提取，考察TFRx提取得率。平行3次，結果見表5。結果表明，在最佳提取條件下提取TFRx得率較高，穩(wěn)定性良好。

表5　最佳工藝條件驗證試驗結果Table 5 Test results of optimum process conditions

3 討 論

目前，植物黃酮的提取方法有醇提法、熱水提法、堿液提法、超聲波助提法、酶浸漬法、超臨界流體萃取法、微波法及超微粉碎提法［21］。本試驗采用了醇提法與酶浸漬法相結合的方法提取TFRx，所用溶劑為乙醇，酶為纖維素酶。本研究結果與林宣賢［22］采用復合酶（纖維素酶＋果膠酶＋木瓜蛋白酶＋（葡聚糖酶＋半纖維素酶）處理金櫻子干果所得得率2.56%相比具有較高的得率，推測其可能與所用酶、金櫻子產(chǎn)地、采收期、提取方法、測定方法等不同有關。

此外，用于黃酮含量測定的方法包括了紫外分光光度法、液相色譜法、熒光光度法、薄層掃描色譜法及超臨界流體色譜法等［21］。而多波長分光光度法就是紫外分光光度法中的一種，具有特定的抗吸收干擾、降低測定誤差的效果，明顯優(yōu)于普通比色法，且該法操作簡單。郭建紅等［14］采用雙波長分光光度法測定洋蔥中黃酮含量，分別以510、580nm為測定波長和參比波長，得洋蔥中黃酮含量為1.58mg／g；李慕春等［19］在相同測定波長和參比波長下測得奶花蕓豆中總黃酮的含量為2.79mg／g。張?zhí)m杰等［20］分別以510、584nm為測定波長和參比波長，采用雙波長分光光度法測得黑玉米花粉中總黃酮的平均含量為3.53%?？梢?，雙波長分光光度法適用于黃酮含量的測定，且效率較高。因此，本試驗采用NaNO2－Al（NO3）3－NaOH比色法進行顯色，選取雙波長分光光度法測定TFRx含量，分別以500、580nm為測定波長和參比波長，得總黃酮含量為87.94mg／g，平均加樣回收率98.23%，RSD為8.77%。

單因素試驗設計是一種經(jīng)典的試驗設計方法，但也存在著局限性，如不能反映因素與因素間的相互作用?，F(xiàn)今，使用較多的工藝優(yōu)化試驗設計方法有正交試驗設計和響應面設計，兩者均可基于單因素試驗的結果進行設計。其中響應面法能夠擬合多因素與響應值間的函數(shù)關系，從而在一個區(qū)域內(nèi)找出因素的最優(yōu)組合和最佳響應值，但響應面法對試驗點的選擇要求很高，而正交試驗設計也能夠有效地篩選出優(yōu)化后的因素水平組合，且正交試驗設計具有方法簡單、試驗次數(shù)少的優(yōu)點［23－24］。因此，本試驗采用了4因素3水平的正交試驗設計對TFRx的纖維素酶法輔助提取工藝進行了優(yōu)化。

此外，徐鵬等［25］比較購于不同地區(qū)的金櫻子后，發(fā)現(xiàn)地理環(huán)境因素和人為因素是引起不同產(chǎn)地TFRx含量差異的重要原因，且總黃酮含量范圍為3.1%～5.3%；安冬琴等［26］分析采于不同時期的同一株金櫻子中的總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)總黃酮含量隨著金櫻子的成熟呈輕微下降趨勢，并且得出金櫻子中總黃酮的含量范圍為3.02%～8.55%；吳家紅等［27］考察了金櫻子不同炮制品及生品中的總黃酮含量，發(fā)現(xiàn)TFRx的含量與炮制方法有關。本試驗以總黃酮得率為評價指標，考察了提取溫度、乙醇濃度、纖維素酶用量、液料比對TFRx得率的影響，確定了纖維素酶輔助提取TFRx的最佳工藝為提取溫度80℃、乙醇濃度40%、纖維素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取時間90min、pH為6.0、提取次數(shù)2次；以該工藝提取TFRx，可獲得（93.35±3.15）mg／g的得率。該得率高于前期單因素試驗中的得率（79.30±1.59）mg／g［17］，推測其可能與測定方法、金櫻子產(chǎn)地、采收期、儲存時間及粉碎處理等有關，而且本試驗在單因素試驗的基礎上對部分條件進行了優(yōu)選，如提取溫度、液料比、提取時間、纖維素酶用量等。

4 結 論

本研究采用雙波長分光光度法測定TFRx的含量，確定測定波長500nm，參比波長580nm，標準曲線方程為y＝0.0008x－0.0047，在19.90～398.00μg范圍內(nèi)有良好的線性關系。此外，各因素對纖維素酶法輔助提取TFRx的影響順序為提取溫度＞纖維素酶用量＞液料比＞乙醇濃度，正交試驗優(yōu)化的最佳工藝條件為：提取溫度80℃、乙醇濃度40%、纖維素酶用量0.5%、液料比40∶1、提取時間90min、pH為6.0、提取次數(shù)2次，且在該提取條件下，TFRx得率較高。因此，本試驗設計正交試驗優(yōu)化纖維素酶法輔助提取TFRx的方法可行，且得率較高，可為TFRx的深入研究開發(fā)提供參考。

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（責任編輯 秦 彤）

陳志剛（1992－），男，湖南攸縣人，碩士生，研究方向：基礎獸醫(yī)學，E－mail：czgresearcher＠foxmail.com山光強和陳志剛對本文具有同等貢獻，并列為第一作者

中圖分類號：S859.3

文獻標識碼：A

文章編號：1671－7236（2016）12－3156－07

doi：10.16431／j.cnki.1671－7236.2016.12.011

收稿日期：2016－04－18

基金項目：地方高校國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（12690）；湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院大學生創(chuàng)新性實驗計劃項目（dycx1511）

作者簡介：山光強（1994－），男，云南宜良人，學士，研究方向：動物藥學，E－mail：sgqundergraduate＠163.com

通信作者：＊蘇建明（1974－），男，湖南茶陵人，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物，E－mail：sjmauhn＠163.com

Content Determination of Total Flavonoids fromRosalaevigataMichx.Fruits and Optimization of Cellulase－assisted Extraction

SHAN Guang－qiang§，CHEN Zhi－gang§，XU Guang－ren，LEI Hong－yu，TAN Yu－qin，SU Jian－ming＊
（CollegeofVeterinaryMedicine，HunanAgriculturalUniversity，Changsha410128，China）

Abstract：To determine the content of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits，and optimize the process of cellulase－assisted extraction，the content of total flavonoids fromRosa laevigataMichx.fruits were determined with a double－wavelength spectrophotometry with detection wavelength were 500nm and 580nm as the reference，using rutin as a standard material，and the process of cellulase－assisted extraction designed by orthogonal test was optimized with the yield of flavonoids as the evaluation index，and the effects of extraction temperature，concentration of ethanol，cellulase dosage，ratio of liquid to material and other 4factors on the content of total flavonoids were investigated.It showed a good linearity（r＝0.9981）between absorbance difference（ΔA）and the rutin mass ranging of 19.90to 398.00μg，the standard curve equation was y＝0.0008x－0.0047，and the yield of total flavonoids was 87.94mg／g，the average recovery and RSD were 98.23%and 8.77%，respectively.And the optimumcellulase－assisted extraction conditions of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits by orthogonal array design were extraction temperature of 80℃，concentration of ethanol of 40%，cellulase dosage of 0.5%，ratio of liquid to material of 40∶1，extraction time of 90min，pH of 6.0，and extraction numbers of 2.Various factors affecting extracting yield were in a order of extraction temperature＞cellulasedosage＞ratio of liquid to material＞concentration of ethanol.In this condition of extraction，yield of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits was（93.35±3.15）mg／g.Therefore，it was suggested that extraction of total flavonoids fromRosalaevigataMichx.fruits by cellulase－assisted extraction was feasible，and the yield of total flavonoids was higher and its conditions was mild.

Key words：RosalaevigataMichx.fruits；total flavonoids；cellulase；orthogonal array design；doublewavelength spectrophotometry