響應(yīng)曲面法優(yōu)化Gluconobacter melanlgenu X42培養(yǎng)基

陳羽，徐威，位星，胡思宇

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

響應(yīng)曲面法優(yōu)化Gluconobacter melanlgenu X42培養(yǎng)基

陳羽，徐威*，位星，胡思宇

(沈陽藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧沈陽110016)

采用Plackett-Burman設(shè)計、最陡爬坡試驗(yàn)和中心組合試驗(yàn)相結(jié)合的策略對Gluconobacter melanlgenu X42轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明:最佳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組成為麥芽抽提物0.46 g/L、蛋白胨2.07 g/L、CaCO30.70 g/L、ZnSO40.04 g/L。優(yōu)化后L-山梨糖生成量提高了9.9%?？梢詰?yīng)用響應(yīng)曲面法對G.melanlgenu X42轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

生黑葡萄糖酸桿菌;培養(yǎng)基;響應(yīng)曲面法;L-山梨糖;條件優(yōu)化

維生素C是一種水溶性維生素，能夠參與體內(nèi)多種羥基化反應(yīng)和氧化還原反應(yīng)，是一類重要的細(xì)胞代謝氧化還原化合物［1］。我國發(fā)明的維生素C“二步發(fā)酵法”是經(jīng)生黑葡萄糖酸桿菌(Gluconobacter melanlgenu)轉(zhuǎn)化D-山梨醇為L-山梨糖，再經(jīng)過細(xì)菌發(fā)酵生成維生素C前體2-酮基-L-古龍酸［2］。響應(yīng)曲面法(Response Surface Methodology)是一種通過合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計來收集數(shù)據(jù)，應(yīng)用曲面模型及各影響因素的二次多項(xiàng)式來評估反應(yīng)變量變化規(guī)律的設(shè)計方法。因其能恰當(dāng)?shù)乩脤?shí)驗(yàn)設(shè)計所收集的數(shù)據(jù)，有效地評估模型中的參數(shù)，受到國內(nèi)外各科學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注［3-4］。本研究采用響應(yīng)曲面法對所構(gòu)建的基因工程菌G.melanlgenu X42(pUC 19-vgb)的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期為企業(yè)在大規(guī)模生產(chǎn)中節(jié)約能耗、降低生產(chǎn)成本提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種G.melanlgenu X42(pUC 19-vgb)由本課題組保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L)種子培養(yǎng)基:山梨醇160，麥芽提取物5，CaCO32.50;轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:山梨醇230，蛋白胨2，麥芽提取物0.40，CaCO30.70，ZnSO40.04。

1.2 方法

1.2.1 L-山梨糖含量的測定L-山梨糖含量的測定參見文獻(xiàn)［5］。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計保持D-山梨醇含量不變，采用Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)對麥芽抽提物(X1)、蛋白胨(X2)、CaCO3(X3)和ZnSO4(X4)進(jìn)行考察。每個因子取2個水平，高水平編碼為+1，低水平編碼為－1，篩選對L-山梨糖產(chǎn)量影響顯著的因素，各因子水平取值見表1。

表1 試驗(yàn)因子和水平設(shè)計Table 1Design of experimental factors and levels

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計以PB設(shè)計挑選出對響應(yīng)值影響顯著的因素設(shè)計最陡爬坡試驗(yàn)，確定爬坡方向和變化步長。

1.2.4 中心復(fù)合設(shè)計和響應(yīng)面分析試驗(yàn)基于PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面分析尋求最佳培養(yǎng)基優(yōu)化條件。

1.2.5 響應(yīng)面模型驗(yàn)證按照模型預(yù)測的最佳組分配比制備培養(yǎng)基，連續(xù)進(jìn)行5批搖瓶轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，驗(yàn)證模型的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Placket-Burmen試驗(yàn)

以L-山梨糖生成量Y作為響應(yīng)值，進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計，試驗(yàn)結(jié)果見表2。對表2中的PB設(shè)計結(jié)果進(jìn)行線性回歸擬合(表3)，可得到一次回歸方程Y=221.83+2.67X1+2.92X2+1.00X3－1.08X4。方程決定系數(shù)R2為91.17%，表明該回歸方程擬合良好。由表3中的P值可知，麥芽抽提物和蛋白胨是影響L-山梨糖生成量最顯著的因素。

表2 Plackett-Burmen設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果Table 2Experimental result of Plackett-Burmen design

表3 Plackett-Burman設(shè)計回歸分析Table 3Regression analysis of Plackett-Burmen design

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

其他因素保持原始水平不變，對X1、X2兩個顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)。由表4可知，最優(yōu)條件在4組附近，故以其為后續(xù)響應(yīng)曲面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 4Experimental results of slope-climbing test

2.3 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面分析試驗(yàn)

其他因素保持原始水平不變，根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)，X1、X2進(jìn)行中心組合試驗(yàn)設(shè)計(表5)。中心組合試驗(yàn)結(jié)果見表6。對表6中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合(表7)，得到一個二元二次方程:Y=237.00+2.08X1－2.02X2+3.25X1X2－6.66X12－5.78X2

2。方程決定系數(shù)R2為98.34%，表明方程擬合較好。

表5 中心組合試驗(yàn)變量及水平Table 5Variables and levels of central composite test

表6 中心組合試驗(yàn)結(jié)果Table 6Experimental results of central composite test

表7 中心組合試驗(yàn)回歸分析Table 7Regression analysis of central composite test

將響應(yīng)值進(jìn)行擬合后得到響應(yīng)曲面圖見圖1。利用Design Expert 8.0軟件可以得到模型極值，X1=0.46 g/L，X2=2.07 g/L。保持其他因素不變，預(yù)測L-山梨糖最大生成量為237.3 g/L。

2.4 響應(yīng)面模型驗(yàn)證

按照模型預(yù)測的最佳組分配比制備培養(yǎng)基，連續(xù)進(jìn)行5批搖瓶轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，驗(yàn)證模型的有效性，試驗(yàn)結(jié)果見表8。由表8可以看出，優(yōu)化培養(yǎng)基L-山梨糖生成量平均值為237.5 g/L，比初始培養(yǎng)基L-山梨糖生成量(平均值為216.2 g/L)提高了9.9%，展示出優(yōu)化培養(yǎng)基的優(yōu)越性。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8The result of the validation experiment

圖1 麥芽抽提物與蛋白胨的交互響應(yīng)曲面Fig.1Response surface stereogram for malt extract and peptone

3 討論

G.melanlgenu在轉(zhuǎn)化D-山梨醇的過程中，山梨醇較黏稠，嚴(yán)重影響氧氣的傳遞速度。因此，在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)的過程中，氧傳遞速度是一個生產(chǎn)瓶頸，供氧己成為提高產(chǎn)品產(chǎn)量的主要限制因素之一。

透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)是一種具有氧結(jié)合與傳遞能力，能在極低的溶氧水平下被大量誘導(dǎo)合成的血紅蛋白。自被發(fā)現(xiàn)以來便引起各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注，其研究也為解決供氧問題提供了一個新的思路［6-8］。我們借助基因工程技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了透明顫菌血紅蛋白基因在G.melanlgenu中的克隆與表達(dá)。通過前期的單因素考察試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中蛋白胨、麥芽提取物、CaCO3和ZnSO4對G.melanlgenu X42轉(zhuǎn)化D-山梨醇影響顯著。本研究采用響應(yīng)曲面設(shè)計中的中心復(fù)合設(shè)計，建立了優(yōu)化G.melanlgenu X42轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基組分的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型，利用模型的響應(yīng)面對轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基各組分進(jìn)行探討，確定了培養(yǎng)基組分的最佳水平范圍，優(yōu)化出轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中各種成分的濃度為麥芽抽提物濃度0.46 g/L，蛋白胨濃度2.07 g/L，CaCO3濃度0.70 g/L，ZnSO4濃度0.04 g/L。采用搖瓶轉(zhuǎn)化試驗(yàn)驗(yàn)證模型的有效性，結(jié)果顯示，與初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基相比，優(yōu)化培養(yǎng)基L-山梨糖生成量提高了9.9%，展示出響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基的優(yōu)越性。

傳統(tǒng)的培養(yǎng)基優(yōu)化一般采用單因素試驗(yàn)方法，但單因素試驗(yàn)不能考察到因素間的相互作用。PB設(shè)計能快速準(zhǔn)確地從影響L-山梨糖生成量的眾多因素中篩選出最重要的影響因素，并能為爬坡試驗(yàn)指出方向和變化步長，接近最大產(chǎn)量區(qū)域。之后根據(jù)爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，并運(yùn)用響應(yīng)面分析方法，回歸擬合中心組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到能與實(shí)際情況擬合良好的模型方程，進(jìn)而確定最適的培養(yǎng)基組成［9-10］。

［1］Yang L，Lei C，Lin F，et al.Effect of Vitamin C on proliferation and differentiation of intestinal epithelial cells of Jian carp［J］.Progress in Veterinary Medicine，2012，33(8):41-46.

［2］宮曉麗，郭智勇，呂淑霞，等.巨大芽孢桿菌B.m2980產(chǎn)孢對氧化葡萄糖酸桿菌產(chǎn)酸的影響［J］.工業(yè)微生物，2013，43 (6):49-53.

［3］宋浩，紀(jì)兆林，陳夕軍，等.地衣芽孢桿菌W10菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報，2015，36(1):87-91.

［4］Zamberi MM，Ani FN，Hassan SN.Optimization of biodiesel production from transesterification of waste cooking oils using alkaline catalysts［J］.Applied Mechanics and Materials，2014，695:289-292.

［5］Xu S，Wang XB，Du GC，et al.Enhanced production of L-sorbose from D-sorbitol by improving the mRNA abundance of sorbitol dehydrogenase in Gluconobacter oxydans WSH-003［J］Microbial Cell Factories，2014，13(1):146-153.

［6］徐威.絲狀真菌高效穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體系的建立和透明顫菌血紅蛋白基因的克隆表達(dá)研究［D］.沈陽:沈陽藥科大學(xué)，2004.

［7］黃欽耿，吳偉斌，翁雪清，等.VHb在產(chǎn)L-苯丙氨酸工程菌中的表達(dá)及其抗貧氧效率［J］.氨基酸和生物資源，2012，34(2):9-12.

［8］Wu JM，F(xiàn)u WC.Intracellular co-expression of Vitreoscilla hemoglobin enhances cell performance and β-galactosidase production in Pichia pastoris［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113(3):332-337.

［9］劉坤，郭威，胡雪芹，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化蘇云金芽孢桿菌B28培養(yǎng)基［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(16):9690-9694.

［10］潘淑勇.響應(yīng)曲面法優(yōu)化柔紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.中國抗生素雜志，2012，37(11):830-836.

Gluconobacter melanogenus X42 Medium Optimized by Response Curved Surface Methodology

CHEN Yu，XU Wei，WEI Xing，HU Si-yu
(Schl.of Life Sci.＆Biopharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang 110016)

The transformation medium of Gluconobacter melanogenus X42 was optimized with the tactics of Plackett-Burman design，slope-climbing test and central combination test.The experimental results showed that the optimum transformation medium components were:malt extract 0.46 g/L，peptone 2.07 g/L，CaCO30.70 g/L and ZnSO40.04 g/L.L-sorbose production was increased by 9.9%after the optimization.G.melanogenus X42 transformation medium could be optimized by the response curved surface methodology.

Gluconobacter melanogenus;medium;response curved surface methodology;L-sorbose;conditions optimization

Q815

A

1005－7021(2016)04－0067－04

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.012

遼寧省教育廳一般項(xiàng)目(L2013380);遼寧省教育廳高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2014023)

陳羽男，講師，碩士。主要從事微生物轉(zhuǎn)化及基因工程菌改造研究。E-mail:gzweishengwu@126.com

*通訊作者。女，教授，博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事微生物制藥及微生物轉(zhuǎn)化合成生物活性物質(zhì)的研究。

E-mail:shxuwei8720@163.com

2015-11-16;

2016-01-20