間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗研究新進展

梁怡凡，朱曉彤，曹雅明

(中國醫(yī)科大學，遼寧沈陽110001)

間日瘧原蟲傳播阻斷疫苗研究新進展

梁怡凡，朱曉彤，曹雅明*

(中國醫(yī)科大學，遼寧沈陽110001)

間日瘧原蟲是導致人類感染瘧疾的4種瘧原蟲之一。由于間日瘧具有較強的遺傳多樣性和更易復發(fā)等特點，間日瘧原蟲的防治得到人們的日益關注，其中疫苗的研發(fā)是重要的防控手段，傳播阻斷疫苗作為可以阻斷傳播的疫苗，相關方面的研究卻剛剛起步。綜述了間日瘧傳播阻斷疫苗研究方面的新進展，旨在為間日瘧疫苗的研制提供參考。

間日瘧原蟲;傳播阻斷疫苗;候選抗原

間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)是導致人類感染瘧疾的4種瘧原蟲之一，非洲以外地區(qū)約50%的瘧疾病例由其引起，每年發(fā)病率約75萬～90萬例。2013年，WHO將“2015年解決間日瘧”作為全球最新抗瘧疾項目的一部分［1］。但近年研究發(fā)現(xiàn)，間日瘧比惡性瘧具有更高的基因多態(tài)性［2］，更易復發(fā)［3］，此外，由于間日瘧配子體在患者臨床癥狀出現(xiàn)前即可傳播等原因，間日瘧的防控形勢更為嚴峻。因此，研發(fā)有效的間日瘧疫苗意義重大。

1 傳播阻斷疫苗

由于媒介按蚊對殺蟲劑抗性的產(chǎn)生以及瘧原蟲的耐藥性，防控瘧疾急需新的策略手段，其中，瘧疾疫苗可刺激人體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生保護性抗體，具有廣闊的應用價值。根據(jù)間日瘧原蟲的生活史，目前研究的間日瘧疫苗可分為三大類:①紅前期疫苗:即抗感染疫苗，阻斷子孢子進入肝細胞;②紅內(nèi)期疫苗:即抗發(fā)病疫苗，降低瘧疾的臨床發(fā)病;③配子體疫苗:即傳播阻斷疫苗(Transmission-blocking vaccines，TBVs)，不同于前兩種疫苗，TBVs針對于瘧原蟲在蚊體內(nèi)的有性階段，雖然不干擾人體的瘧疾感染過程，不能直接提供對瘧原蟲感染的保護性，但在人體中誘導產(chǎn)生的抗體，可在蚊子吸食人體血液時進入蚊體，由于此時抗體依舊具有活性，因此可妨礙蚊體內(nèi)瘧原蟲的有性生殖，以阻斷瘧疾的傳播。

與紅前期、紅內(nèi)期疫苗相比，TBVs的優(yōu)勢在于:①蚊體內(nèi)瘧原蟲數(shù)目明顯少于人體內(nèi)的數(shù)目:蚊胃壁上的卵囊數(shù)目有數(shù)個至數(shù)十個或上百個不等，而1只受染雌蚊涎腺中的子孢子數(shù)可達20萬個，一般蚊子叮刺20次后即可將子孢子全部釋放出來，人體平均一次可感染近萬個子孢子，因此，紅前期抗感染疫苗很難達到100%的保護作用;②瘧原蟲只有在有性生殖和孢子生殖期間才能在細胞外存活數(shù)小時，期間極易受免疫干擾;③抗原變異較少:由于TBVs抗原主要表達于蚊體內(nèi)，可免于人體的免疫壓力，而紅前期和紅內(nèi)期疫苗廣泛的基因多態(tài)性直接影響了疫苗的免疫原性和免疫反應性［4］;④可防止耐藥性原蟲的擴散:即使是對抗瘧疾最有效的藥物青蒿素也已發(fā)現(xiàn)耐藥性，控制耐藥性原蟲的擴散對瘧疾治療意義重大;⑤個體接種疫苗后，受益的將是整個流行區(qū)內(nèi)的人群:被免疫者的抗體進入蚊體阻斷瘧原蟲的發(fā)育后，可防止蚊子將瘧原蟲傳播給下一個被叮咬者［5］。

2 間日瘧TBVs候選抗原

根據(jù)表達位置的不同，TBVs候選抗原主要分為三類:①受精前靶抗原(Pre-fertilization target antigens):表達在配子母細胞和雌雄配子表面的蛋白;②受精后靶抗原(Post-fertilization target antigens):表達在瘧原蟲合子和成熟的動合子表面的蛋白;③蚊蟲中腸靶抗原(Mosquito midgut target antigens):表達在蚊蟲中腸表面的抗原。下文就這三種抗原疫苗的研究進展分別作一綜述。

2.1 受精前靶抗原疫苗

2.1.1 Pvs48/45P48/45是主要表達于雄配子母細胞和雄配子膜表面的糖蛋白，與P230錨定于細胞表面有關，P48/45缺陷的雄配子無法與雌配子黏附，但尚不清楚的是，究竟是P48/45本身就在雄配子的受精過程中發(fā)揮關鍵作用，還是由于影響了P230而間接影響了受精［6］。由于其屬于6-半胱氨酸蛋白家族，保守的富含半胱氨酸的序列易形成復雜的球形三級結構，提示正確的空間折疊可能是具有傳播阻斷活性的關鍵，因此研究者多選用真核表達系統(tǒng)。Tachibana等［7］將擴增的Pvs48/45片段插入真核表達載體VR1020中，聯(lián)合Vaxfectin佐劑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)抗Pvs48/45抗體在非還原性條件下比還原性條件下具有更好的免疫活性，驗證了該抗體的主要靶向表位具有空間依賴性;Pvs48/45的全長結構比CRDIII結構可誘導更高的抗體滴度;補體的存在可顯著減少卵囊數(shù)量，提示補體在傳播阻斷過程中的重要性。

大腸埃希菌原核表達系統(tǒng)具有時程短、費用低等優(yōu)點，是生產(chǎn)異源蛋白的優(yōu)先考慮途徑，但由于間日瘧原蟲富含AT的染色體末端和富含GC的端粒遠側區(qū)，使其在大腸埃希菌中轉錄效率低、易沉淀成不溶型包涵體聚合物，因此原核系統(tǒng)中可溶性瘧原蟲蛋白的功能性表達遇到了眾多技術難題。Arévalo-Herrera等［8］采用全部密碼子融合策略，通過在pET32a表達載體中添加硫氧還蛋白結構域增加目的蛋白的溶解性，成功表達出65.8 kDa的Pvs48/45重組蛋白，并證明對人血清有63.3%的抗原性，且提示該比例與年齡呈正比;免疫BALB/c鼠后，第1次免疫即可產(chǎn)生免疫原性，且在第3次免疫時抗體滴度達到頂峰3×106;免疫Aotus猴的抗體滴度也在1.6×104和3.2×104之間，且免疫持續(xù)時間長達5個月，無嚴重的不良反應出現(xiàn);兩種免疫動物血清均具有100%的傳播阻斷效應。該實驗還發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，rPvs48/45抗太平洋地區(qū)人血清的抗原性(86.6%)與抗加勒比海地區(qū)人血清的抗原性(40%)具有顯著的統(tǒng)計學差異。該現(xiàn)象與韓國、哥倫比亞等地的測序結果(Korea 1單倍型流行于亞洲、太平洋地區(qū)而非美洲地區(qū))［9-10］以及Pfs48/45的基因特點［11］(SNP等位基因和單倍型呈不對稱的地理分布)相一致，提示針對不同蟲株的疫苗對不同地區(qū)的人群有效性不同。

此外，通過對泰國、韓國、中國等地的間日瘧分離株進行測序分析，顯示Pvs48/45具有有限的多態(tài)性［7，9，12］。以上研究提示Pvs48/45作為TBVs候選抗原具有明顯的可行性。

2.1.2 Pvs47P47是P48/45的旁系同源蛋白質(zhì)，表達于雌配子母細胞的胞漿中，配子生成過程中轉位到雌配子的膜表面，與雌雄配子的識別有關，P47缺陷的雌配子受精率低于0.1%。同樣是來自Tachibana等的研究，利用表達有Pvs47的質(zhì)粒DNA聯(lián)合Vaxfectin佐劑免疫小鼠，獲得了和Pvs48/45類似的結論，證明Pvs47缺陷可顯著減少卵囊數(shù)量?；蚍治鲲@示，Pvs47具有有限的基因多樣性［9］，雖然在一份來自泰國的分離株中，發(fā)現(xiàn)CRD III的第14個半胱氨酸被苯基丙氨酸替換，但并未影響其傳播阻斷效應，提示此替換對抗體的產(chǎn)生無影響。但對惡性瘧原蟲的研究中無法證明Pfs47在雌配子受精中起關鍵作用，也未影響卵囊的發(fā)育［13］。因此，P47作為TBVs候選抗原有待進一步驗證。

2.1.3 Pvs230P230是另一種雄配子表面抗原，也屬于6-半胱氨酸蛋白家族，在惡性瘧原蟲中，它促進了雄配子和紅細胞黏附形成出絲中心［14］，在伯氏瘧原蟲中，它促進了雄配子與雌配子的識別黏附，但在同一種瘧原蟲中P230是否同時具有此兩種作用，還有待進一步研究。與P48/45不同的是，P230不含GPI錨定區(qū)，而是依靠與P48/45形成復合物而固定在配子母細胞和配子細胞膜表面的［6］。Tachibana等［15］利用VR-Pvs230(編碼Pvs230CRDs I～IV)質(zhì)粒DNA聯(lián)合Vaxfectin佐劑免疫DBA/2鼠，產(chǎn)生的抗Pvs230血清在有無補體存在時均可顯著減少卵囊數(shù)量，卵囊感染率雖有降低，但并不顯著，提示應進一步提高抗體滴度以達到完全傳播阻斷;對來自9個國家115份間日瘧分離株的Pvs230CRDs I～IV測序分析顯示，僅有7個位點的氨基酸發(fā)生了改變，表明Pvs230具有有限的基因多態(tài)性［15-16］。以上實驗提示Pvs230是間日瘧TBVs的候選抗原。

2.1.4 潛在的間日瘧TBVs受精前靶抗原近年研究發(fā)現(xiàn)了幾種新的瘧原蟲TBVs候選抗原。HAP2是一種位于雄配子母細胞和雄配子表面的蛋白質(zhì)，在雌、雄配子融合過程中起關鍵作用，HAP2缺陷的雄配子無法形成通道，受精被阻礙［17］。在伯氏瘧原蟲HAP2免疫家兔［18］和惡性瘧原蟲HAP2免疫小鼠［19］的實驗中，提示HAP2具有有效的傳播阻斷活性。但值得注意的是，低濃度的抗體存在增強傳播的現(xiàn)象，如1100稀釋的抗伯氏瘧原蟲HAP2血清可促進卵囊的發(fā)育，此現(xiàn)象在間日瘧原蟲中也有報道［18，20］，但具體機制尚不清楚。

在對間日瘧的基因測序研究中發(fā)現(xiàn)，間日瘧和惡性瘧中控制關鍵代謝途徑、管家功能和預測的所有的膜轉運子的蛋白具有高度保守性，而間日瘧原蟲77%的基因與惡性瘧原蟲、諾氏瘧原蟲和約氏瘧原蟲具有同源性［21］，因此可以推測HAP2在間日瘧原蟲中也具有傳播阻斷活性。但由于瘧原蟲的種特異性，該推測是否成立尚需實驗驗證。

GAMER是最近發(fā)現(xiàn)的一種對配子釋放起關鍵作用的蛋白，是一段缺少可識別域的保守蛋白質(zhì)，長10 kDa，由96個氨基酸組成，顆粒狀分布于配子體胞漿中，缺少GAMER會阻礙雄配子從雄配子母細胞的出絲中心上脫落［22］。但目前尚未有關于其作為TBVs候選抗原可行性的報告。

2.2 受精后靶抗原疫苗

2.2.1 Pvs25和Pvs28Pvs25和Pvs28是間日瘧合子和動合子表面蛋白，對合子存活于蚊胃內(nèi)、穿入蚊胃上皮以及動合子向卵囊的轉化具有重要作用。二者均具有顯著的傳播阻斷效應［23］和有限的基因多態(tài)性［24-25］。研究表明，Pvs25比Pvs28抗原具有更有限的多態(tài)性以及更高的表達量和免疫原性，因此Pvs25目前被認為是研發(fā)間日瘧TBVs的首選候選抗原，也是唯一一個已進入I期臨床試驗階段的間日瘧TBVs。Malkin等［26］對rPvs25H疫苗進行了I期臨床試驗。該蛋白長20.5 kDa，由Pvs25的第23至第195號氨基酸組成，在酵母中表達，用鋁膠吸附和純化后接種給志愿者?？贵w滴度在第3次接種后達到頂峰，接種者無嚴重的不良反應。膜飼實驗證明接種者血清具有傳播阻斷效應，最多可減少20%～30%感染蚊子的數(shù)量，與抗體滴度成正比，且補體可增強這一效應，顯示出該抗原作為傳播阻斷疫苗組分的潛力。但若進行實際應用，仍需進一步增強傳播阻斷效應。

由于鋁膠作為佐劑的Pvs25疫苗的免疫原性較低［27］，因此針對Pvs25的疫苗研制進行了多種嘗試。其中失敗的例子有，Wu等［28］在對Pvs25結合Montanide ISA 512008佐劑進行的I期臨床試驗中，有兩名受試者出現(xiàn)結節(jié)性紅斑等系統(tǒng)性不良反應，可能與佐劑的添加有關;也有成功的嘗試，為了降低細胞毒性，Mizutani等［29］將間日瘧環(huán)子孢子蛋白(P.vivax circumsporozoite protein，PvCSP)和Pvs25融合成一種蛋白，利用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)(baculovirus dual expression system，BDES)在體外哺乳動物細胞中高效表達，研制成一種同時具備紅前期和傳播阻斷疫苗特性的多階段疫苗，該疫苗對免疫鼠體內(nèi)表達有相應間日瘧抗原的轉基因伯氏瘧原蟲具有高的免疫原性，43%的誘導保護作用和82%的傳播阻斷效應。

2.2.2 PvWARPPvWARP是一種微線體動合子分泌蛋白，表達于動合子晚期和卵囊早期，在動合子期經(jīng)頂復體的電子致密區(qū)分泌，全長35 kDa (不包括信號肽)。Gholizadeh等［30］利用pGEM-T Easy原核表達系統(tǒng)成功表達出rPvWARP，且可刺激小鼠產(chǎn)生多克隆抗體，在斯氏按蚊(Anopheles stephensi)體內(nèi)證實了其具有傳播阻斷活性。此外，來自伊朗的91份間日瘧分離株的PvWARP與P.vivax標準株Sal-1的相似度高達98%～100%［31］;韓國分離株也具有有限的基因多態(tài)性［32］。以上研究提示PvWARP可能是間日瘧TBVs的候選抗原。

2.2.3 潛在的間日瘧TBVs受精后靶抗原PSOP12最初是在瘧原蟲動合子表面發(fā)現(xiàn)的［33］，后來被證實也表達于雌雄配子的表面，同屬于6-半胱氨酸家族成員。由于其生物學功能尚不清楚，暫且將其劃歸于受精后靶抗原行列。針對psop12位點的多個基因的敲出均未導致可見的表型改變，暗示其在瘧原蟲的生命周期中并未發(fā)揮關鍵作用。但Sala等［34］利用桿狀病毒雙表達系統(tǒng)表達的伯氏瘧原蟲PSOP12免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)PSOP12具有傳播阻斷活性。因此啟發(fā)我們，在確定TBVs候選抗原時，不應僅以基因的敲除是否引起表型改變?yōu)檫x擇依據(jù)，是否位于蟲體有性階段的細胞表面也許也是一個關鍵的參考因素，比如P25的敲除也未造成表型改變。

除上述受精后靶抗原外，在瘧原蟲發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的動合子蛋白還有很多。如最近研究發(fā)現(xiàn)的動合子蛋白HADO，是一段長45 kDa的378個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，與人類鎂依賴性磷酸酶Mdp-1有相似的結構，主要表達于動合子階段，與P.vivax標準株Sal-1具有75%的保守性，可影響動合子的發(fā)育，顯著減少卵囊數(shù)量［22］。同樣屬于微線體動合子分泌蛋白的幾丁質(zhì)酶、CTRP，與WARP具有共同的微粒體分泌途徑，PgCHT1和PgCTRP的抗血清可顯著減少雞瘧對埃及伊蚊的感染率［35］。

2.3 蚊蟲中腸靶抗原疫苗

2.3.1 AnAPN1AnAPN1是位于按蚊中腸上皮表面的一個高度保守的分子，在動合子入侵腸壁細胞中起保護作用。研究表明，位于成熟AnAPN1的N端下游第60至第195的氨基酸片段(AnAPN160-195)在沒有佐劑的條件下仍然具有高的免疫原性，且是安全的［36］。Armistead等人用rAnAPN160-195結合鋁膠佐劑免疫家兔和老鼠，利用多個地區(qū)的惡性瘧和間日瘧患者血清進行膜飼實驗，證明了該抗體對多個按蚊亞種均具有傳播阻斷效應。實驗中，對惡性瘧原蟲的阻斷作用強于間日瘧原蟲，可能是由于動合子侵入中腸方式的不同引起的。

2.3.2 糖連接蚊蟲中腸上皮存在多種糖連接，其中一些對瘧原蟲與蚊蟲宿主之間的結合識別起到關鍵作用，可阻斷動合子與胃壁的吸附。Basseri等［37］在對斯氏按蚊的研究中發(fā)現(xiàn)，用含有間日瘧原蟲配子母細胞和碳水化合物甘露糖、N-乙酰半乳糖胺、乳糖的血清飼養(yǎng)斯氏按蚊，可100%阻斷子孢子的產(chǎn)生。

3 展望

2013年11月14日，美國熱帶醫(yī)學和衛(wèi)生學會年會上推出了新的瘧疾疫苗技術路線圖［38］。隨著全世界對間日瘧重視度的提高，資金投入的加大，以及間日瘧基因測序的進展，相信間日瘧原蟲TBVs的研制將有重大突破。但目前仍有許多問題尚待解決，如:①要選擇合適的表達體系和適宜的佐劑以增強疫苗的免疫原性;②間日瘧原蟲TBVs的研究大多在動物模型中進行，需進行臨床試驗評估候選疫苗的效果，或者探索人瘧模型的建立;③鑒于瘧原蟲的多途徑受精方式以及部分基因的不對稱地理分布，多抗原聯(lián)合疫苗的制備可能成為研究熱點。因此，開發(fā)新型有效的間日瘧原蟲TBVs仍需更多探索。

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Advances in Transmission-Blocking Vaccines of Plasmodium vivax

LIANG Yi-fan，ZHU Xiao-tong，CAO Ya-ming
(China Med.Uni.，Shenyang 110001)

Plasmodium vivax is one of the four kinds of Plasmodium causing malaria in humans.Considering that P.vivax has higher genetic diversity and is more easily to relapse，its control has been drawn more and more attention.The R＆D of transmission-blocking vaccines(TBV)against P.vivax is an important prevention and control measure，the TBV could be a vaccine to obstruct the transmission，and the related study is just in a starting stage.This article summarized the latest advances in the TBV research against P.vivax aiming at providing reference for the future development of P.vivax vaccine.

Plasmodium vivax;transmission-blocking vaccine(TBV);antigen candidate

Q939.91;R392.7

A

1005－7021(2016)04－0102－06

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.018

國家自然科學基金海外及港澳學者合作研究基金項目(81429004)

梁怡凡女，中國醫(yī)科大學七年制在讀。研究方向為抗感染免疫。E-mail:lyf0620@sohu.com

*通訊作者。男，教授，博士，博士生導師。研究方向為抗感染免疫。E-mail:ymcao@mail.cmu.edu.cn

2015-11-19;

2016-04-24