植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展

楊鎮(zhèn)，曹君

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，遼寧沈陽(yáng)1001161)

·大家專(zhuān)版·

植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展

楊鎮(zhèn)，曹君

(遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物工程中心，遼寧沈陽(yáng)1001161)

楊鎮(zhèn)，男，1990年7月碩士研究生畢業(yè)，研究員?，F(xiàn)任遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所所長(zhǎng)，微生物工程中心主任，碩士生導(dǎo)師。長(zhǎng)期從事農(nóng)作物遺傳育種和栽培工作。曾獲遼寧省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)1項(xiàng)，二等獎(jiǎng)2項(xiàng)，三等獎(jiǎng)1項(xiàng);農(nóng)業(yè)部豐收獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)1項(xiàng);獲國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利4項(xiàng);制定遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)3個(gè)。主編出版專(zhuān)著、編著5部，發(fā)表論文40余篇。曾育成高粱、玉米、花生等作物新品種20余個(gè)。目前從事植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物機(jī)理和田間應(yīng)用效果研究、食用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究。主持科技部、發(fā)改委、財(cái)政部、遼寧省科技廳、財(cái)政廳等各類(lèi)項(xiàng)目5項(xiàng)?！俺呋钚灾参飪?nèi)生菌代謝物的篩選及應(yīng)用技術(shù)研究”2013年獲遼寧省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)?，F(xiàn)擔(dān)任中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)遼寧分會(huì)理事，中國(guó)食用菌協(xié)會(huì)常務(wù)理事，中國(guó)農(nóng)學(xué)會(huì)雜糧分會(huì)常務(wù)理事，《農(nóng)業(yè)科技通訊》編委，遼寧省作物學(xué)會(huì)理事，遼寧省微生物學(xué)會(huì)食藥用菌專(zhuān)家委員會(huì)主任，遼寧省專(zhuān)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)委員，國(guó)家、省農(nóng)業(yè)項(xiàng)目專(zhuān)家評(píng)審委員會(huì)委員。

植物內(nèi)生菌經(jīng)過(guò)與寄主植物長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，成為植物內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、脅迫應(yīng)激以及產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物等生理生化行為方面具有顯著的作用。利用植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物，可以促進(jìn)農(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育、提高抗逆性，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大的研究意義和應(yīng)用價(jià)值。綜述了植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物生理功能及在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用的研究進(jìn)展。對(duì)植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物未來(lái)的研究重點(diǎn)和應(yīng)用前景做出展望。

植物內(nèi)生菌;次級(jí)代謝產(chǎn)物;抗逆;促生;應(yīng)用

植物內(nèi)生菌(Endophyte)泛指在健康植物寄主中度過(guò)全部或近乎全部生活周期而不使寄主表現(xiàn)任何癥狀的一類(lèi)微生物(主要為真菌和細(xì)菌)，它生活在植物的各種組織和器官內(nèi)部，是植物內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)中的天然組成部分。作為一個(gè)生態(tài)學(xué)概念，植物內(nèi)生菌具有獨(dú)特的系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程，無(wú)論其起源是內(nèi)源說(shuō)還是外源說(shuō)，不同的植物內(nèi)生菌都在其寄主體內(nèi)微環(huán)境中，與宿主共同經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程，并形成了密不可分的相互關(guān)系。一方面，寄主植物為特定的內(nèi)生菌提供生存所必須的生態(tài)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)成分和能量物質(zhì)等，滿(mǎn)足其生存需要;另一方面，內(nèi)生菌通過(guò)自身的生命活動(dòng)，依靠自身功能(如菌根菌)或代謝產(chǎn)物對(duì)植物體產(chǎn)生直接或間接的影響，其中一些正面的影響對(duì)于寄主植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的促進(jìn)作用。這種相互關(guān)系使內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝物成為農(nóng)業(yè)應(yīng)用新的研究熱點(diǎn)。同時(shí)，我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展依靠農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新，保障農(nóng)產(chǎn)品有效供給，保證農(nóng)產(chǎn)品供給的質(zhì)量，促進(jìn)生態(tài)環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展。為此，尋找適宜的生物源先導(dǎo)材料，替代傳統(tǒng)的農(nóng)藥，成為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綠色健康發(fā)展的重要途徑。為了更快捷地尋找適宜的新型農(nóng)用微生物資源，越來(lái)越多的科技人員開(kāi)始關(guān)注與植物本身密切相關(guān)的植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物。

1 植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的生理功能研究

1.1 促進(jìn)植物生長(zhǎng)

1.1.1 產(chǎn)生促進(jìn)植物生長(zhǎng)物質(zhì)研究表明，植物內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生如吲哚乙酸、赤霉素以及細(xì)胞分裂素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用。如葡萄球菌屬、固氮菌屬以及固氮螺菌屬的部分內(nèi)生細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中包含生長(zhǎng)素、乙烯以及細(xì)胞激動(dòng)素等植物激素類(lèi)物質(zhì)，對(duì)寄主植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用［1］。而黃花蒿內(nèi)生菌包含一種可以產(chǎn)生IAA的炭疽菌類(lèi)內(nèi)生菌，經(jīng)體外培養(yǎng)后，應(yīng)用于小麥和黃瓜幼苗時(shí)可以表現(xiàn)出不同程度的抑制和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用［2］。

1.1.2 固氮作用目前在玉米、水稻、高粱以及甘蔗等非豆科植物中均發(fā)現(xiàn)了固氮內(nèi)生細(xì)菌存在，其能夠通過(guò)自身的代謝作用，利用固氮酶將大氣中游離的N2還原成NH+4，可以供給寄主植物應(yīng)用，而寄主植物并不形成特化結(jié)構(gòu)。這類(lèi)內(nèi)生細(xì)菌生活在植物體不同營(yíng)養(yǎng)器官的微環(huán)境中，可以避免氧氣等不利因素的影響［3］。例如在甘蔗的根、莖、葉中存在著大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，這種內(nèi)生細(xì)菌能夠保持高效的固氮活性，并與甘蔗建立聯(lián)合固氮作用［4-6］。

1.1.3 促進(jìn)植物吸收氮、磷等營(yíng)養(yǎng)元素除了內(nèi)生細(xì)菌的固氮作用外，在氮源水平較低的土壤中，某些內(nèi)生真菌的存在可以提高寄主植物對(duì)于氮元素的吸收能力，對(duì)于植物體內(nèi)氮代謝和氮積累也有顯著的影響，如感染內(nèi)生真菌的高羊茅葉片中的氮素含量明顯高于未被侵染的高羊茅［7］。而Li等從大豆根瘤中分離到的多種內(nèi)生菌中，有一些菌種可以溶解磷礦物，從而促進(jìn)植物對(duì)磷元素的吸收［8］。此外，感染內(nèi)生真菌的牧草對(duì)氮、磷的攝取能力也都有所提高［9-11］。陶承光等采用一種來(lái)源于野生植物根部的鏈格孢屬內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，在試驗(yàn)中顯著提高水稻根系和莖稈的發(fā)育，增強(qiáng)植株對(duì)養(yǎng)分的吸收和運(yùn)輸能力，氮素在拔節(jié)期到抽穗期(I期)和抽穗期到收獲期(II期)的累積量比對(duì)照高出94.44%和125.45%;氮肥農(nóng)學(xué)利用率(25.44%)比對(duì)照(9.36%)增加66.67%［12］。

1.2 增加植物應(yīng)激耐受性

研究發(fā)現(xiàn)大部分的內(nèi)生菌可以增加寄主植物的應(yīng)激耐受性，以至于部分寄主植物在沒(méi)有相應(yīng)內(nèi)生菌侵染共生的情況下，甚至?xí)驗(yàn)闊o(wú)法適應(yīng)周邊生長(zhǎng)環(huán)境中的脅迫因素而無(wú)法生存［13］。而內(nèi)生菌對(duì)于植物應(yīng)激耐受性的增益作用即表現(xiàn)在非生物脅迫(如抗高溫、抗干旱等)方面，劉國(guó)麗等經(jīng)植物內(nèi)生菌處理的玉米幼苗表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力，外觀(guān)性狀表現(xiàn)為根系發(fā)達(dá)、主根變長(zhǎng)，須根數(shù)及根毛增多。處理3 d后，玉米種子的萌發(fā)率為70%，比對(duì)照高31%。萌發(fā)后7 d，玉米種子以長(zhǎng)出2葉1心，而對(duì)照組僅有20%長(zhǎng)出真葉。通過(guò)對(duì)隨機(jī)摘取的葉片進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)處理組葉片相對(duì)含水量增加了28%，說(shuō)明植株通過(guò)提高自身保水能力增強(qiáng)抗旱性;相對(duì)電導(dǎo)率降低45%，降低了干旱脅迫對(duì)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷;可溶性糖含量增加11%，表明細(xì)胞原生質(zhì)濃度提高，以適應(yīng)干旱缺水的環(huán)境;脯氨酸含量增加16%，提高了植株的滲透調(diào)節(jié)能力，從而減低了氨毒害，保護(hù)生物大分子，增加了抗旱能力［14］。同時(shí)，也表現(xiàn)在生物脅迫(如阻抑昆蟲(chóng)和食草動(dòng)物的采食、抗病害等)方面。

1.2.1 非生物脅迫應(yīng)激耐受性對(duì)于非植物脅迫方面的應(yīng)激耐受性，多是表現(xiàn)在植物內(nèi)生菌對(duì)于寄主植物滲透能力的調(diào)節(jié)。通常情況下，寄生的內(nèi)生菌所分泌胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物可以誘導(dǎo)或影響寄主植物特定的物質(zhì)代謝，并產(chǎn)生相應(yīng)的生理活性物質(zhì)，從而在外界逆境脅迫條件下，一定程度上改變植株的生理活性，提高抗逆性。通過(guò)在體外培養(yǎng)內(nèi)生菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物在某些情況下，作用于植株時(shí)也會(huì)產(chǎn)生相似的作用。Rodriguez等［13］研究發(fā)現(xiàn)某種鐮刀菌屬內(nèi)生菌在侵染一種鹽堿地植物后，可以使該植物具備很強(qiáng)大耐鹽性，并且能夠在沿海地塊生存。某種炭疽菌屬內(nèi)生真菌在侵染寄主植物后，也會(huì)使寄主產(chǎn)生很強(qiáng)的耐熱性［15-16］。部分內(nèi)生真菌還可以通過(guò)增加寄主生物氧化的方式，來(lái)減少對(duì)于水分的消耗，最終實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)寄主植物的抗旱性［17-18］。此外，部分植物根部的內(nèi)生細(xì)菌可以通過(guò)分泌胞外多糖來(lái)改變土壤的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)土壤通透性，間接改善植物根系對(duì)于土壤水分缺失或過(guò)多以及溫度變化的適應(yīng)性，從而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)［19-21］。

1.2.2 生物脅迫應(yīng)激耐受性?xún)?nèi)生菌增強(qiáng)植物對(duì)于病蟲(chóng)害等生物脅迫抗逆性有很多方式。其中一些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生抗生素類(lèi)物質(zhì)，對(duì)于病原菌有拮抗作用。這些抗菌物質(zhì)包括脂肽、藤黃綠膿菌素、吡咯菌素以及幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等。這些物質(zhì)通過(guò)影響病原菌生物被膜的形成或降解真菌的細(xì)胞壁，從而增強(qiáng)植物抵御病害的影響。例如，2，4-二乙酞藤黃酚和吩嗪羧酸對(duì)于小麥全蝕病菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)于黃瓜枯萎病也有一定的生物防治作用［22］。

內(nèi)生細(xì)菌一般是以菌體或孢子的形式通過(guò)表皮滲透或氣孔進(jìn)入等途徑進(jìn)入寄主植物體內(nèi)，這與病原菌侵染植物的途徑和方式相似，二者在植物體內(nèi)也存在生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。因此內(nèi)生菌可以?xún)?yōu)先占據(jù)病原菌的入侵位點(diǎn)，搶先利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使病原菌無(wú)法得到正常的營(yíng)養(yǎng)供給，從而間接增強(qiáng)植物抵御病害的能力。如某種內(nèi)生枯草芽胞桿菌與玉米病原真菌串珠鐮孢具有相同的生態(tài)位，因此可以在玉米生產(chǎn)中利用該內(nèi)生菌的侵染和定殖，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位與營(yíng)養(yǎng)的方式降低串珠鐮孢對(duì)于玉米植株的致病性［23］。在鐵元素不足的情況下，某些內(nèi)生菌還可以通過(guò)產(chǎn)生鐵載體，與病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵離子，抑制病菌對(duì)鐵的吸收，從而抑制病菌的生長(zhǎng)［24］。此外，某些內(nèi)生菌可以產(chǎn)生或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生酚類(lèi)、醌類(lèi)等，通過(guò)這些強(qiáng)氧化性物質(zhì)在細(xì)胞間隙的積累，構(gòu)成阻止病原菌侵染寄主植物的機(jī)械、化學(xué)屏障，從而增強(qiáng)植物對(duì)病原菌侵襲的抗性。

內(nèi)生菌對(duì)于增強(qiáng)植物對(duì)昆蟲(chóng)采食行為的抗性，主要是源于其產(chǎn)生的多種生物堿類(lèi)或神經(jīng)毒素類(lèi)，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物可以導(dǎo)致昆蟲(chóng)出現(xiàn)拒食、生長(zhǎng)發(fā)育受抑制，甚至死亡等現(xiàn)象。Cheplick等［25］給秋粘蟲(chóng)幼蟲(chóng)喂食感染內(nèi)生菌Acremoniumloli的黑麥草和高羊茅，發(fā)現(xiàn)其存活率和生長(zhǎng)速率明顯低于喂食未感染葉片的幼蟲(chóng)。

1.3 促進(jìn)植物產(chǎn)生次生代謝物

內(nèi)生菌促進(jìn)植物產(chǎn)生次生代謝物不僅是物質(zhì)量的產(chǎn)生，更多的是可以影響植物一系列的生理行為，例如調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)或提高植物的應(yīng)激耐受性。這種促進(jìn)作用涉及兩種機(jī)理，也分為兩個(gè)方面:一方面，內(nèi)生菌在植物體內(nèi)特殊的生態(tài)環(huán)境中與寄主植物長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，突變?cè)斐傻幕蛑亟M現(xiàn)象或其他信息交流使內(nèi)生菌產(chǎn)生了與寄主相同的信息傳導(dǎo)通路，從而使內(nèi)生菌可以合成與植物次生代謝物相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物［26］。而這一現(xiàn)象在某種程度上表現(xiàn)為內(nèi)生菌可以促進(jìn)植物產(chǎn)生更多的次生代謝物。例如，Stierle等［27］發(fā)現(xiàn)，短葉紅豆杉的韌皮部存在一類(lèi)內(nèi)生真菌，它和寄主植物一樣可以產(chǎn)生紫杉醇。另一方面，內(nèi)生菌還可以通過(guò)分工合作的方式，參與寄主植物的次生代謝物合成過(guò)程，如果缺少這類(lèi)內(nèi)生菌，寄主植物則無(wú)法獨(dú)立完成這些合成工作;或者是內(nèi)生菌產(chǎn)生某種具有催化作用的酶，可以改變寄主植物代謝途徑中某一反應(yīng)的方向，從而使植物產(chǎn)生特定的次生代謝產(chǎn)物［28］。

1.4 增加植物他感作用

內(nèi)生菌增加寄主植物的他感作用行為，可能是內(nèi)生菌次級(jí)代謝物對(duì)其他植物的影響，或者是內(nèi)生菌影響寄主植物分泌更多的可以影響鄰近植物的次生代謝物，這實(shí)際上也是內(nèi)生菌促進(jìn)植物產(chǎn)生次生代謝物的又一功用。例如牧草內(nèi)生菌產(chǎn)生的毒麥堿對(duì)鄰近植物有較強(qiáng)的他感作用［29］;而感染內(nèi)生細(xì)菌的紅花車(chē)軸草也具有抑制玉米生長(zhǎng)的他感作用［30］。

1.5 與植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染、有毒污染物等

在多種超富集植物中存在著耐重金屬的內(nèi)生菌，此類(lèi)內(nèi)生菌與寄主植物富集重金屬的能力密切相關(guān)。在植物修復(fù)過(guò)程中，這些內(nèi)生菌的抗性系統(tǒng)能夠降低重金屬的植物毒性，促進(jìn)植物遷移金屬。同時(shí)這些耐重金屬的內(nèi)生菌還可以通過(guò)固氮、溶解礦物元素及產(chǎn)生類(lèi)植物激素、鐵載體和ACC脫氨酶等產(chǎn)物促進(jìn)植物對(duì)重金屬的吸收，從而加強(qiáng)植物修復(fù)。例如，內(nèi)生菌可顯著提高在鉛污染土壤上的油菜對(duì)重金屬的吸收總量，顯示了植物-內(nèi)生菌系統(tǒng)潛在的促進(jìn)植物修復(fù)重金屬污染的應(yīng)用價(jià)值［31-32］。

此外，植物內(nèi)生菌還可以聯(lián)合植物降解包括農(nóng)藥殘留成分在內(nèi)的有毒污染物。鮑敏等［33］從雜交楊樹(shù)中分離獲得的一株甲醇內(nèi)生菌能夠降解TNT、RDX和HMX，在2個(gè)月內(nèi)使RDX和HMX減少了60%。Germaine等［34］發(fā)現(xiàn)當(dāng)豌豆植株中接種從雜交楊樹(shù)中分離的假單胞內(nèi)生菌Pseudomonas putida VM1450后，植株中既沒(méi)有2，4-D的積累也無(wú)任何藥害跡象，從中分離出的內(nèi)生細(xì)菌Pseudomonas putida VM1441(pNAH7)能夠降解萘，由此表明，這些內(nèi)生細(xì)菌有應(yīng)用于2，4-D和萘污染的土壤生物修復(fù)潛能。

2 植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝物在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用研究

2.1 植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

植物內(nèi)生菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用可以通過(guò)活體微生物農(nóng)藥的方式實(shí)現(xiàn)，即大量繁殖內(nèi)生菌活體，并加工成制劑后使用。使用時(shí)通過(guò)拌種、蘸根、噴灑等方法促使內(nèi)生菌以侵染方式進(jìn)入植物體內(nèi)。其作用機(jī)理是一方面利用生態(tài)位或營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、合成的抗生素類(lèi)、生物堿類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物等方式阻遏病原菌感染和昆蟲(chóng)取食;另一方面可以利用合成的植物激素類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，并增強(qiáng)植物對(duì)外界逆境的抗性。內(nèi)生菌農(nóng)藥是來(lái)源于植物體內(nèi)，作用于植物體內(nèi)，本身不含有傳統(tǒng)農(nóng)藥的毒性成份，因此屬于環(huán)境友好型的新型農(nóng)藥。

植物內(nèi)生菌本身是一個(gè)生物活體，田間環(huán)境和植物體微生態(tài)環(huán)境中許多因子都會(huì)影響內(nèi)生菌促生、抗逆等功能的發(fā)揮。而且在應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中時(shí)，內(nèi)生菌對(duì)非天然寄主植物的侵染率和是否具有致病性是非常關(guān)鍵的問(wèn)題，但這方面的研究目前尚未明確。因此，內(nèi)生菌農(nóng)藥在實(shí)際應(yīng)用時(shí)都必須考慮其生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)以及病理學(xué)等方面的影響。

2.2 植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用

植物內(nèi)生菌是一類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物豐富的資源微生物，一方面可以利用其中的植物激素類(lèi)、抗生素類(lèi)以及生物堿類(lèi)等天然活性物質(zhì)對(duì)植物的促生、抗逆等功能，分離提取后直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。另一方面可以將內(nèi)生菌次級(jí)代謝物作為綠色農(nóng)藥活性結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)構(gòu)型。最近的研究顯示，51%的從植物內(nèi)生菌分離的生物活性物質(zhì)是以前沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的化合物，而從土壤微生物發(fā)現(xiàn)的新物質(zhì)僅為38%。由此可見(jiàn)，研究植物內(nèi)生菌，尋找具有農(nóng)藥活性的次生代謝產(chǎn)物，是研發(fā)新型無(wú)公害農(nóng)藥的重要途徑。

在內(nèi)生菌與寄主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，兩者之間存在著微妙的共同作用，會(huì)產(chǎn)生相似甚至相同的次生(級(jí))代謝產(chǎn)物，例如吲哚乙酸、蕓薹素內(nèi)酯、赤霉素等內(nèi)源植物激素。應(yīng)用這些天然活性物質(zhì)為主要成分的農(nóng)藥，相當(dāng)于將“內(nèi)源”物質(zhì)以“外源”的方式作用于植物，無(wú)論是在農(nóng)田生態(tài)環(huán)境還是植物體內(nèi)微環(huán)境中，均未增加額外的化學(xué)成分。同時(shí)，以次級(jí)代謝產(chǎn)物為主要成分的農(nóng)藥，還可以避免內(nèi)生菌在非自然寄主植物中是否存在致病性的問(wèn)題。

某些植物內(nèi)生菌的次級(jí)代謝物可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物功能基因的表達(dá)，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育以及對(duì)于外界環(huán)境的響應(yīng)。王紅等在一項(xiàng)基于A(yíng)ffymetrix表達(dá)譜芯片的雜交和檢測(cè)分析試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物浸種處理的粳稻，其根部部分基因表達(dá)變異明顯。其中與植物抗逆行為關(guān)系密切的NAC轉(zhuǎn)錄因子家族中OsNAC10基因上調(diào)表達(dá)2.386，該基因的過(guò)表達(dá)促使水稻根系增粗，增強(qiáng)生殖生長(zhǎng)期抗旱能力;磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsPht1，上調(diào)表達(dá)1.634，細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性上升，提高植株轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對(duì)磷酸鹽和砷酸鹽的親和力，使水稻對(duì)磷酸鹽和砷酸鹽的運(yùn)輸量提高3～5倍，維護(hù)水稻植株體內(nèi)磷的動(dòng)態(tài)平衡;膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因OsNRAMP5，上調(diào)表達(dá)1.899，膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成增加，刺激水稻對(duì)于金屬離子等微量元素的吸收和利用，促進(jìn)植株的生長(zhǎng)發(fā)育;環(huán)型E3泛素連接酶基因GW2下調(diào)表達(dá)0.618，降低環(huán)型E3泛素連接酶的數(shù)量和活性，使得本應(yīng)降解的底物不能被特異識(shí)別，進(jìn)而激活穎花外殼細(xì)胞的分裂，從而增加穎花外殼的寬度，間接提高水稻灌漿速率，增加胚乳的大?。?5］。

3 植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究重點(diǎn)和前景

3.1 菌種資源:以特殊生境內(nèi)生菌為重點(diǎn)

建立生物菌種資源庫(kù)、基因資源庫(kù)、天然活性化合物庫(kù)，從源頭創(chuàng)制或挖掘一批基因靶標(biāo)明確、活性顯著的農(nóng)用生物制劑新資源將成為研究熱點(diǎn)。而植物內(nèi)生菌資源研究目前還處于初級(jí)階段，尤其是在高寒、干旱、高緯度等極端環(huán)境中的植物內(nèi)生菌往往會(huì)產(chǎn)生特殊的生理功能和次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大應(yīng)用價(jià)值。因此，從不同生態(tài)環(huán)境，尤其是特殊生境中篩選植物內(nèi)生菌，可以得到特異性的高活性物質(zhì)。有關(guān)單位和科技工作者進(jìn)行了大量的分離、萃取和活性測(cè)定等工作，只是目前尚少見(jiàn)先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的確定和修飾優(yōu)化的研究，相信不久的將來(lái)會(huì)有突破性的進(jìn)展。

3.2 研究方向:先導(dǎo)構(gòu)型與分子靶標(biāo)相結(jié)合

生物技術(shù)領(lǐng)域的不斷突破正推動(dòng)農(nóng)業(yè)藥物創(chuàng)制從過(guò)去的重視局部?jī)?yōu)化(只關(guān)注先導(dǎo)不關(guān)注靶標(biāo))，逐步轉(zhuǎn)換到重視整體優(yōu)化(既關(guān)注先導(dǎo)更關(guān)注靶標(biāo))的藥物分子設(shè)計(jì)的新體系，大幅度提高了農(nóng)業(yè)藥物的原創(chuàng)性、目的性、高效性，減低了開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、周期和成本。

因此，對(duì)于內(nèi)生菌農(nóng)藥的研究，可以從植物外在表型入手研究分子機(jī)制，通過(guò)探尋表型優(yōu)良植株及其內(nèi)生菌的生理生化行為的變化，同時(shí)綜合運(yùn)用基因組學(xué)、比較基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、相互作用組學(xué)等技術(shù)，結(jié)合生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)等技術(shù)，高通量預(yù)測(cè)和篩選找出內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝物的分子作用靶標(biāo)，將先導(dǎo)構(gòu)型研究與靶標(biāo)研究相結(jié)合，為新一代農(nóng)業(yè)藥物和生物制劑的研發(fā)開(kāi)創(chuàng)突破口。

3.3 作用方式:以生物控制手段取代簡(jiǎn)單的毒殺生物控制是農(nóng)藥發(fā)展的必經(jīng)之路，農(nóng)藥的含義已從“殺死”向“控制”、“生物調(diào)控”方向發(fā)展。植物內(nèi)生菌次級(jí)代謝物包含多種活性成份，更多的是以綜合性作用通過(guò)調(diào)節(jié)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)，使其本身對(duì)外界的環(huán)境變化作出應(yīng)對(duì)，提高植物的應(yīng)激耐受性，而不是簡(jiǎn)單的毒殺作用。因此，以?xún)?nèi)生菌次級(jí)代謝物為資源庫(kù)，以一種或幾種天然活性物質(zhì)的配比，作為新型農(nóng)藥或新型農(nóng)藥的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)，將會(huì)是未來(lái)綠色農(nóng)藥發(fā)展的重要途徑之一。

4 展望

植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝物可以在維護(hù)生態(tài)平衡的前提下，促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)，防治病蟲(chóng)害，提高作物抗逆性，并且減少傳統(tǒng)農(nóng)藥和化肥的使用量，最終實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo)。但是即便相關(guān)研究越來(lái)越多，仍然罕有內(nèi)生菌活菌制劑或其次級(jí)代謝產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道。目前農(nóng)用微生物制劑的應(yīng)用均面臨著應(yīng)用環(huán)境中生態(tài)位競(jìng)爭(zhēng)和拮抗作用，以及自然環(huán)境不穩(wěn)定等情況所導(dǎo)致的活菌數(shù)急劇衰降問(wèn)題。即使作用部位是在植物體內(nèi)部，內(nèi)生菌活菌制劑也存在相似的問(wèn)題，同時(shí)還面臨著寄主專(zhuān)一性和低侵染率的困境。而內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用則面臨著內(nèi)生菌篩選時(shí)期和方法、體外培養(yǎng)、發(fā)酵技術(shù)、次級(jí)代謝物分離純化等許多相關(guān)技術(shù)難題尚未完全攻克。尤其目前尚缺乏從寄主體內(nèi)直接定性?xún)?nèi)生菌的檢測(cè)技術(shù)，而在外界構(gòu)建的模擬生態(tài)環(huán)境與寄主植物體內(nèi)微環(huán)境存在明顯差異，植物內(nèi)生菌的分離、培養(yǎng)與發(fā)酵技術(shù)受此限制，難以真正得到目的菌株或代謝物。而且植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝物的種類(lèi)龐雜，相當(dāng)一部分對(duì)于特定植物而言具有致病性或生理毒性，在開(kāi)發(fā)應(yīng)用時(shí)也需要謹(jǐn)慎對(duì)待。

此外，在推廣應(yīng)用方面，植物內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物由于其作用機(jī)理，一般是微量應(yīng)用，作為農(nóng)藥應(yīng)用多以預(yù)防和提高抵抗力為主，或者作為植調(diào)劑促進(jìn)植物生長(zhǎng)，而非直接作用于病灶或提供營(yíng)養(yǎng)元素，難以達(dá)到立竿見(jiàn)影的效果。這與傳統(tǒng)農(nóng)藥和肥料是完全不同的新事物，因此在推廣工作中還應(yīng)加大宣傳力度，使內(nèi)生菌及其次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用可以更快地被人們接受和認(rèn)可。

［1］Hallmann J，Quadt Hallmann A，Mahaffee W F，et al.Bacterial endophytes in agr-icultural crops［J］.CanJ Microbiol，1997，60: 1214-1215.

［2］Lu H，Zou W X，Meng J C，et al.New bioactive metabolites produced by colle-totrichun sp.，an endophytic fungus in Artemisia annua［J］.Plant Science，2000，151:67-73.

［3］馮永君，宋未.植物內(nèi)生細(xì)菌［J］.自然雜志，2001，23(5): 249-252.

［4］陳麗梅，樊妙姬，李玲.甘蔗固氮內(nèi)生菌——重氮營(yíng)養(yǎng)醋桿菌的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2000，27(1):63-66.

［5］Cavaleante V，Dobereiner J.Anewacid，tolreant nitrogenfixing bacteriumassociatedwithsugar cane［J］.Plant Soi，1988，108: 23-31.

［6］Zou W X，Tan R X.Biological and chemical diversity of endophytes and their potent-ial applications［J］.Advanxes in Plant Sciences，1999，2:183-190.

［7］Lyons P C，Evans J J，Bacon C W.Effects of thefungal endophyte Acremonium-coenophialum on nitrogen accumulation andmetabolismin tall fescue［J］.Plant Physiology，1990，92:726-732.

［8］Li J H，Wang E，F(xiàn)eng W，et al.Genetic diversity and potential for promotion of pl-ant growth detected in nodule endophytic bacteria of soybean grown in Heilongjiang province of China［J］.Soil Biology and Biochemistry，2008，40(1):238-246.

［9］Reis V M，Baldam J I.Biological dinitrogen fixation in Gamineae and palm trees［J］.Critical Rev Plant Sci，2000，19(3): 227-247.

［10］Gasoni L，de Gurfinkel B S.The endophyte Cladorrhinum foecundissimumy in cotton roots:phosphorus uptake and host growth［J］.Mycol Res，1997，101:867-870.

［11］Malinowski D P，Brauer D K，Belesky D P.The endophyte Neotyphodium coenophia-lum affects root morphology of tall fescue grown under phosphorus deficiency［J］.J Agron C-rop Sci，1999，183:53-60.

［12］陶承光，楊濤，楊鎮(zhèn)，等.植物內(nèi)生菌活性提取物對(duì)粳稻基因表達(dá)的影響［J］，遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，(6):13-16.

［13］Rodriguez R，Redman R.More than 400 million years of evolution and some plants still can＇t make it on their own:plant stress tolerance via fungal symbiosis［J］.Journal of Experimental Botany，2008，59(5):1109-1114.

［14］劉國(guó)麗，王娜，龔娜，等.干旱脅迫下植物內(nèi)生菌提取物對(duì)玉米萌芽期抗旱性的影響［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，47(10): 39-41.

［15］Bush L P，Wilkinson H H，Schardl C L.Bioprotectivealkaloid of grassfungal endophytesymbiosis［J］.Plant Physiol，1997，114: 1-7.

［16］Rodriguez J，Henson J，Van V E，et al.Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis［J］.International Society of Microbial Ecology，2008，2(4):404-416.

［17］Rodriguez R J，White J F，Arnold A E，et al.Fungal endophytes:diversity and functional roles［J］.New Phytologist，2009，182:314-330.

［18］肇瑩，楊鎮(zhèn)，楊濤，等.植物內(nèi)生菌醇提取物草坪草抗旱性的影響［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，31(1):39-44.

［19］姚領(lǐng)愛(ài)，胡之璧，王莉莉，等.植物內(nèi)生菌與宿主關(guān)系研究進(jìn)展［J］.生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，l971:1750-1754.

［20］易婷，繆煜軒，馮永君.內(nèi)生菌與植物的相互作用:促生與生物薄膜的形成［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2008，35(11):1774-1780.

［21］Yi Ting，Miao Yuxuan，F(xiàn)eng Yongjun.Plant-endophyte interaction:Growthpromoting efect ofendophytes and their biofilm formation［J］.Microbiology，2008，35(11):1774-1780.

［22］石晶盈，陳維信，劉愛(ài)媛.植物內(nèi)生菌及其防治植物病害的研究進(jìn)展［J］.生態(tài)學(xué)報(bào)，2006，26(7):2395-2401.

［23］Yan MH，Cai ZG，Han JG，et al.The applied research of endophytic baceteria in biological control of plant disease［J］.Biotechnology Information，2004，(3):8-12.

［24］Shi JY，Chen WX，Liu AY.Advances in the study of endophytes and their effects on control of plant diseases［J］.Acta Ecologica Sinica，2006，26(7):2395-2401.

［25］Cheplick G P，Clay K.Acquired chemical delense of grasses:the role of fungal endophytes［J］.0ikis，1988，52:309-318.

［26］Strobel G，Daisy B.Bioprospecting for Microbial Endophytes and Theif Natural Products［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2003，67(4):491-502.

［27］Stierle A，Strobel G A，Stierle D.Taxol and taxane production by Taxomycesandreanae，an endophytic fyngus of Oacific yew［J］.Science，1993，260:214-216.

［28］DU SJ，Gun XH.The Impact of endophytic fungi on plant secondary metabolites［J］.Modem Agncultural Sciences，2009，16 (5):17-18.

［29］Sutherland B L，Hume D E，Tapper B A.Allelopathiceffects of endophyte-infecter perennnial ryegrass extracts on white clover seedlings［J］.New Zeal J Agr Res，1999，2:19-26.

［30］Sturz A V，Christie B R.Endophytic bactena of red clover as agents of allelppathic clover-maize syndromes.Soil Biol Biochem，1996，28:583-588.

［31］Barzanti R，Ozino F，Bazzicalupo M，et al.Isolation and characterization of endophytie bacteria from the nickel hyperaccumulator plant A slzm bertolonii［J］.Microb Ecol，2007，53(2):306-316.

［32］Powell R G，Petroski R J.Alkaloid toxins in endophytic-infected grasses［J］.Nat Toxins，1992，1(3):163-170.

［33］鮑敏，康明浩.植物內(nèi)生菌研究發(fā)展現(xiàn)狀［J］.青海草業(yè)，2011，20(1):21-25.

［34］Germaine KJ，Keogh E，Ryan D，Dowling D，et al.Bacterial endophyte-mediated naphthalene phytoprotection and phytoremediation［J］.Fems Microbiology Letter，2009，296(2):226-234.

［35］王紅，楊鎮(zhèn)，肖軍，等.兩種植物內(nèi)生菌的醇提取物對(duì)水稻根部基因表達(dá)譜的分析［J］.作物雜志，2014(2):48-51.

Research Progress of Endophytic Fungi and Their Secondary Metabolites

YANG Zhen，CAO Jun
(Research Center of Microbial Engineering of Liaoning Academy of Agr.Sci.，Shenyang 110161)

Endophytes，after the long-term co-evolution with host plants，have become an important part of ecosystem within the plants and have significant effects on physiological and biochemical behavior such as plant growth and development，nutrition absorption，responses to stress as well as secondary metabolites production.Using endophytes and their secondary metabolites in agriculture could promote crop growth and increase the stress resistance of plants.Thus endophytes and their secondary metabolites have great research significance and application value for agricultural production.In this paper，recent advances in the physiological functions of endophytes and their secondary metabolites and their applications in agriculture were reviewed.Also the future research emphases as well as the application prospect of endophytes and their secondary metabolites were discussed.

endophytes;secondary metabolites;stress resistance;growth promotion;application

Q939.9

A

1005－7021(2016)04－0001－06

10.3969/j.issn.1005－7021.2016.04.001

遼寧省科技攻關(guān)項(xiàng)目(2009208001，2011215005);遼寧省自然基金項(xiàng)目(201102100);遼寧省公益基金項(xiàng)目(2013002002)

楊鎮(zhèn)男，碩士，研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)微生物研究與應(yīng)用。E-mail:yangzh008@163.com

2016-07-18