高通量測序技術(shù)在骨質(zhì)疏松研究中的應(yīng)用

王 瀟 陳 健

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361000)

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·綜 述·

高通量測序技術(shù)在骨質(zhì)疏松研究中的應(yīng)用

王 瀟 陳 健

(廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361000)

高通量測序技術(shù)；精準(zhǔn)醫(yī)療；骨質(zhì)疏松

高通量測序(HTS)技術(shù)幾乎改變了生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的每一個領(lǐng)域，近年來高通量測序技術(shù)發(fā)展飛快，將人們真正帶入了HTS的時代。新一代高通量測序技術(shù)具有測序通量高、測序時間短和測序成本低等特點(diǎn)。2015年初，美國總統(tǒng)奧巴馬宣布推出精準(zhǔn)醫(yī)療計劃〔1〕。精準(zhǔn)醫(yī)療是在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上更精準(zhǔn)、更個體化的醫(yī)療。HTS技術(shù)為精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐，為疾病的研究、預(yù)防、診斷及治療提供了更精準(zhǔn)，更有效的手段。隨著老齡化社會的到來，骨質(zhì)疏松(OP)已成為影響人們生活質(zhì)量的一大疾病。60歲以上老年人，OP發(fā)病率男性為35.8%，女性為73%，接近40%的婦女一生中都會發(fā)生OP導(dǎo)致的骨折〔2〕。而OP的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因控制的復(fù)雜過程。因此，HTS技術(shù)的發(fā)展能更加系統(tǒng)地闡述OP的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及為其診斷和治療提供強(qiáng)有力的工具。

1 HTS技術(shù)簡介

HTS技術(shù)也稱深度測序技術(shù)或下一代測序技術(shù)〔3，4〕。其在基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、基因變達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的檢測以及甲基化等研究領(lǐng)域都有應(yīng)用。最早被用于DNA測序的是產(chǎn)生于19世紀(jì)70年代中期的傳統(tǒng)的Sanger測序技術(shù)〔5〕，其測序耗時長，通量低，費(fèi)用高，因此下一代測序技術(shù)應(yīng)勢而生。目前所說的HTS技術(shù)主要是指2005年以來454 life sciences公司(現(xiàn)已被Roche公司收購)、ABI公司和Illumina 公司推出的第二代測序技術(shù)以及Helicos Heliscope和Pacific Biosciences推出的單分子測序技術(shù)〔6〕。此外，還有第三代的納米孔測序技術(shù)。這些技術(shù)的出現(xiàn)真正達(dá)到了一個基因組測序不超過2 000美元〔7〕。第二代測序技術(shù)有Roche/454公司的焦磷酸基因組測序技術(shù)，Polonator技術(shù)，Illumina 公司的Solexa技術(shù)，ABI公司的Solid技術(shù)等。這里介紹近年來應(yīng)用較普遍的測序平臺。Illumina/Solexa公司2006年推出了AnalyzerⅡ〔7〕，隨后的幾年里不斷改進(jìn)，提高了測序通量，降低了測序成本，占據(jù)了HTS的市場。該公司最近推出了一套測序時間和測序通量最優(yōu)化的測序儀，包括Miseq、NexSeq500、Hiseq系列。其中Miseq和Hiseq是最成熟的測序平臺〔7〕。Miseq測序速度快，適合個人基因組測序、目標(biāo)測序和小基因組測序。Hiseq2500測序通量高。其在2014年推出的HiseqX10〔7〕，運(yùn)用圖案化流動槽技術(shù)，具有高通量、耗時短等特點(diǎn)。之后推出的NexSeq500〔7〕，采用一種新型雙通道測序方法，而Miseq和Hiseq都是四通道的測序方法。它的特點(diǎn)是核苷酸的檢測只需兩張圖片，減少了數(shù)據(jù)處理時間和提高了測序通量。但其誤差率與成熟的Hliseq平臺相似。2010年Life Technologies 公司推出PGM測序儀，其模版準(zhǔn)備和測序步驟與Roche/454的焦磷酸測序技術(shù)類似〔7〕。在PGM基礎(chǔ)上，2012年又推出了Ion Proton測序儀，提高了測序通量。除此之外，Pacific Biosciences 公司推出的單分子實(shí)時測序技術(shù)(SMRT)，其特點(diǎn)是不需擴(kuò)增過程，聚合過程是連續(xù)的，可以通過視頻上記錄的熒光信號實(shí)時讀取DNA序列。Dxford Nanopore technoloqies 公司在2014年推出了納米孔測序技術(shù)〔8〕，最早的設(shè)備是MinION，測序速度較快，讀長較長。如同所有的單分子測序技術(shù)，錯誤率很高，Jain等〔9〕最近報道其插入、刪除、替換率分別為4.9%，7.8%，5.1%。雖然其測序通量相對較低，精確度不高。但其在尺寸、測序速度、讀長、機(jī)器價格等方面的優(yōu)勢，將使其在不久的未來有著更好的發(fā)展。HTS技術(shù)一直在不斷地完善，不斷的改進(jìn)，并被廣泛應(yīng)用于生物科學(xué)的各個方面。

2 HTS技術(shù)在OP研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀及存在問題

2.1 HTS技術(shù)在OP研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀 OP是最常見的代謝性骨病，作為最常見且治療費(fèi)用最高的疾病之一，影響著全世界1/3的女性和1/5的男性〔10〕。其特點(diǎn)是具有低創(chuàng)傷性骨折的風(fēng)險，將近1/2女性和1/4男性在60歲以上都會受OP性骨折的影響〔11〕。其中最嚴(yán)重的是髖部骨折，50%人骨折后不能恢復(fù)到骨折前的狀態(tài)，25%需長期家庭護(hù)理，還有25%在12個月之內(nèi)死亡〔12〕。OP是一種多基因控制的家族性疾病。體內(nèi)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在骨重塑過程中扮演著重要角色。成骨細(xì)胞來自造血干細(xì)胞，破骨細(xì)胞來自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而骨細(xì)胞是從成骨細(xì)胞分化而來的。骨吸收與形成的不平衡導(dǎo)致了OP的形成。目前已知的WNT、NOTCH、Hedgehog、OPG-RANK-RANKL等信號通路可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化和形成。HTS技術(shù)可以檢測低頻率的與疾病相關(guān)的罕見的變異基因，而且已經(jīng)成功地應(yīng)用于描繪單基因疾病〔12〕。全基因組相關(guān)研究(GWAS)和全外顯子組測序(WES)可以幫助確定基因決定的單基因疾病和復(fù)雜疾病，包括OP和骨量紊亂等疾病。該方法已被用于發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致OP的新基因〔10〕，可以提升對OP發(fā)病機(jī)制的理解和推動尋找新型靶向治療的發(fā)展。影響OP性骨折的因素很多，除了鈣缺乏、雌激素缺乏、年齡因素、以前是否有過骨折等，還有骨密度(BMD)。BMD具有高度遺傳性的特點(diǎn)，60%～90%的人骨密度變化是由基因決定的〔13〕。當(dāng)然，除了BMD之外，其他與OP相關(guān)的特征也與遺傳因素相關(guān)。受研究技術(shù)的限制，傳統(tǒng)的疾病在基因方面的研究主要是以假說為導(dǎo)向的候選基因法。本世紀(jì)初，在描繪OP和大部分其他復(fù)雜疾病的基因上進(jìn)展很小。但隨著全基因組相關(guān)研究的發(fā)展和下一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，更多新的與BMD減少相關(guān)的基因位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)。近年來相關(guān)綜述表明發(fā)現(xiàn)有59個新的基因位點(diǎn)與BMD減少相關(guān)，而這些位點(diǎn)在以前的候選基因法中未被發(fā)現(xiàn)〔14〕。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量基因分型技術(shù)的出現(xiàn)，將對OP及一些其他復(fù)雜疾病進(jìn)行更進(jìn)一步的分型，有利于提高對疾病的認(rèn)識，對疾病的風(fēng)險進(jìn)行更好預(yù)測，尋找更精準(zhǔn)的治療方法和減少治療過程中副作用的產(chǎn)生。HTS技術(shù)除了在基因組測序上的應(yīng)用之外還在轉(zhuǎn)錄組測序、基因變達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的檢測以及甲基化等研究領(lǐng)域都有應(yīng)用。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)的功能缺陷可能導(dǎo)致衰老過程和年齡相關(guān)性疾病，如OP等〔15〕。通過HTS對患有OP疾病的病人進(jìn)行MSC的分析，可以提高對OP發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的更進(jìn)一步的新認(rèn)識。此外，第二代HTS技術(shù)在表觀遺傳水平的研究上也發(fā)揮著巨大作用。骨重塑是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的共同作用而產(chǎn)生的，DNA的甲基化在成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化中起著重要作用。堿性磷酸酶(ALP)是由成骨細(xì)胞分泌的具有催化骨礦化作用的一種酶。研究表明，DNA的甲基化可抑制ALP在骨細(xì)胞中的表達(dá)〔16〕。在成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)移中，硬化蛋白編碼基因(SOST)啟動子區(qū)高甲基化可導(dǎo)致成骨細(xì)胞低表達(dá)〔17〕。此外，CPG島的低甲基化也參與了成骨細(xì)胞分化過程的調(diào)控〔18〕。組蛋白修飾及染色質(zhì)重塑在成骨細(xì)胞分化過程中也發(fā)揮了不可忽視的調(diào)節(jié)作用。破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一的骨吸收細(xì)胞，DNA甲基化依賴機(jī)制可以通過影響人骨組織中的RANKL和OPG的基因轉(zhuǎn)錄參與破骨細(xì)胞分化的調(diào)控〔16〕。此外，組蛋白乙?；矃⑴c了破骨細(xì)胞的活性調(diào)節(jié)。隨著HTS技術(shù)在RNA水平測序應(yīng)用的發(fā)展，其在研究OP的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制等方面也起著不可替代的作用。MSC在向成骨細(xì)胞分化的過程中，一些Micro RNA的表達(dá)水平變化會影響目的基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控MSC的成骨分化過程〔19〕。一些體外實(shí)驗(yàn)表明，Micro RNA在破骨細(xì)胞生成及骨吸收過程中也發(fā)揮了正性調(diào)控作用〔20〕。Li等〔21〕在J Cell Mol Med 上發(fā)表的綜述中提出以下假設(shè)：Micro RNA表達(dá)模式在物種進(jìn)化中變異或者m RNA上Micro RNA結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)變異會有助于解釋進(jìn)化過程中物種間的顱面變化、人類顱面疾病的發(fā)展和年齡增長引起OP形成中的生理變化。因此，HTS技術(shù)在RNA水平的應(yīng)用可為進(jìn)一步探索OP疾病提供強(qiáng)大的技術(shù)支撐。

2.2 HTS技術(shù)在研究OP疾病中存在的問題 近年來，雖然HTS技術(shù)在測序通量、測序耗時和測序成本上都有了很大進(jìn)步，但也有著局限性。首先，其測序后的海量測序數(shù)據(jù)的后期處理和分析也是一大難題。其次，雖然其測序成本大大降低，但對于一個小型實(shí)驗(yàn)室來說還是難以承受的。除此之外，與OP相關(guān)的單個基因具體功能尚未完全明了，限制了高通量測序在OP領(lǐng)域的跨越式發(fā)展研究。由于缺乏充足的動物實(shí)驗(yàn)，基因治療在OP臨床應(yīng)用的安全性尚未闡明。

3 HTS技術(shù)在OP研究中的應(yīng)用展望

隨著人口老齡化的發(fā)展，老年人骨健康問題更為突出，患OP的患者越來越多，使其生活質(zhì)量大大下降。HTS技術(shù)的出現(xiàn)，給OP等其他復(fù)雜疾病的研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支撐。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療計劃的提出，在醫(yī)療領(lǐng)域更加注重個性化。因此，對疾病的研究更大的挑戰(zhàn)。從疾病的預(yù)測到預(yù)防到診斷到治療護(hù)理及預(yù)后的評估等都做到個性化。從基因水平預(yù)測疾病的發(fā)生及疾病的易感性，然后做到更好地預(yù)防疾病發(fā)生。當(dāng)疾病發(fā)生時應(yīng)用更個體化的治療，精準(zhǔn)治療可以大大減少治療過程中的副作用。在疾病的護(hù)理方面也做到個性化護(hù)理。此外，在疾病的預(yù)后評估時給出更精準(zhǔn)的評估以便給予更精準(zhǔn)的后期指導(dǎo)。將精準(zhǔn)醫(yī)療的概念應(yīng)用到OP，將給OP患者帶來福音。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和進(jìn)步，HTS技術(shù)也在不斷地發(fā)展，且發(fā)展速度非常之快，朝著更大通量更快速度和更低成本的方向在不斷進(jìn)步。此外，測序數(shù)據(jù)的分析技術(shù)也將不斷地進(jìn)步，相信在不久的將來HTS技術(shù)在OP及其他復(fù)雜疾病的研究中將起更大的推動作用。為精準(zhǔn)醫(yī)療在OP中的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。OP早期的癥狀和體征不明顯，缺乏特異性，故很難依據(jù)臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)來做出早期診斷〔22〕。HTS技術(shù)的發(fā)展將為預(yù)測、預(yù)防OP的發(fā)生和OP的早期診斷提供技術(shù)支撐，將為OP患者提供更精準(zhǔn)的治療，減少治療的副作用，提供更恰當(dāng)?shù)淖o(hù)理方法，給出更精準(zhǔn)的生活指導(dǎo)，將大大推動生命科學(xué)的發(fā)展和醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的進(jìn)步。

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〔2016-08-30修回〕

(編輯 曲 莉)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272168);福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2016J01623)

陳 健(1963-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

王 瀟(1991-)，女，在讀碩士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

R681

A

1005-9202(2016)19-4915-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.116