UHPLC/Q-TOF-MS/MS快速鑒定瓜馥木化學(xué)成分研究*

★　李曉芳　劉翔　李立芳　鄧紅　張建康　葉鳳玉　歐陽(yáng)輝　葉喜德*　(.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院　南昌0006；.江西湘雅萍礦合作醫(yī)院　江西 萍鄉(xiāng) 700；.江西撫州醫(yī)科研究所　江西 撫州 000；.江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)?！〗?撫州 000；.江西中醫(yī)藥大學(xué)　南昌 000)

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012A140)。

**第一作者：李曉芳，女，研究方向：中藥化學(xué)成分。

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UHPLC/Q-TOF-MS/MS快速鑒定瓜馥木化學(xué)成分研究*

★李曉芳1**劉翔2李立芳3鄧紅1張建康4葉鳳玉5歐陽(yáng)輝5葉喜德5***(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院南昌330006；2.江西湘雅萍礦合作醫(yī)院江西 萍鄉(xiāng) 337003；3.江西撫州醫(yī)科研究所江西 撫州 344000；4.江西中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校江西 撫州 344000；5.江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004)

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2012A140)。

**第一作者：李曉芳，女，研究方向：中藥化學(xué)成分。

摘要：目的：利用超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC/Q-TOF-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)瓜馥木根和藤莖的化學(xué)成分進(jìn)行分析。方法：采用Welch C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相梯度洗脫進(jìn)行色譜分離；質(zhì)譜采用電噴霧(ESI)離子源，在正離子模式下采集數(shù)據(jù)，運(yùn)行時(shí)間40 min，使用質(zhì)譜分析軟件中的目標(biāo)化合物篩查法，通過(guò)保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片鑒定化學(xué)成分。結(jié)果：初步鑒定了44個(gè)化學(xué)成分。結(jié)論：該方法快速、簡(jiǎn)單，可作為瓜馥木化學(xué)成分的一種快速鑒定方法。

關(guān)鍵詞：瓜馥木；超高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜；化學(xué)成分

瓜馥木(Fissistigmaoldhamii(Hemsl.)Merr.)，又名鉆山風(fēng)，為番荔枝科瓜馥木屬植物，多生于低海拔山谷旁、溪旁、潮濕的疏林中。該屬植物在全球約75種，我國(guó)就占有23種[1]，主要分布在福建、臺(tái)灣、浙江、江西、湖南、廣東、廣西、海南及云南等省市。瓜馥木多用根和藤莖入藥，味辛性溫，具祛風(fēng)除濕、活血化瘀、鎮(zhèn)痛消腫等功效,主治風(fēng)濕痹痛，腰痛，胃痛及跌打損傷。該植物中主要成分為次生代謝產(chǎn)物，即包括以阿樸菲類為主的生物堿，該生物堿具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用[2]，是自然界中分布較為廣泛且具有重要生物活性[3]。此外，瓜馥木中還含有黃酮類、有機(jī)酸等化學(xué)成分?，F(xiàn)有的文獻(xiàn)對(duì)瓜馥木化學(xué)成分研究不多，這不利于我們深入研究瓜馥木的物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者利用超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UHPLC/Q-TOF-MS/MS)[4-5]技術(shù)，對(duì)瓜馥木進(jìn)行了化學(xué)成分研究，希望為其進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1儀器與材料

超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(AB SCIEX Triple TOF 5600+；Foster City，CA)；島津超高效液相色譜儀(Nexera LC-30A，日本)，含在線真空脫氣機(jī)，高壓二元梯度泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，柱溫箱；Welch C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)；KQ-500DE 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorious BT25S型十萬(wàn)分之一電子分析天平(賽多利斯公司，德國(guó))。

甲酸(色譜純，美國(guó)TEDIA公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Fisher公司)；水為Milli-Q系統(tǒng)純化水(美國(guó)Millipore公司)，其余試劑為分析純。

瓜馥木根莖購(gòu)買于江西省樟樹藥材市場(chǎng)，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)黃小方老師鑒定為瓜馥木(Fissistigmaoldhamii(Hemsl.)Merr.)的根莖。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1質(zhì)譜條件離子源為電噴霧離子化源(ESI)，正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1 250；噴霧電壓：5500 V，霧化氣溫度：550℃，氣簾氣：172.36 kPa，霧化氣和輔助氣：344.74 kPa；去簇電壓(DP)：100 V；采用TOF-MS-IDA-MS/MS方法采集數(shù)據(jù)，TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描TOF/MS/MS離子累積時(shí)間分別為200、100 ms，CE碰撞能量為-65eV，CES碰撞能量疊加為(65±15)eV，觸發(fā)二級(jí)的方法為IDA，多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)為觸發(fā)二級(jí)的條件，滿足該條件的優(yōu)先進(jìn)行二級(jí)掃描。

表1　瓜馥木根莖提取物的化學(xué)成分鑒定結(jié)果

2.2液相條件流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，以梯度洗脫，0.1～2 min，1% B；2～5 min，1%～20%B；5～25 min，20%～40% B；25～33 min，40%～90% B；33～37 min，90% B；37.1～40.25 min，10%B。采用Welch C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7μm)，體積流量0.25 mL/min，柱溫箱控溫45 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.3樣品制備及檢測(cè)取瓜馥木根莖50 g，精密稱定，置于回流燒瓶中，加至石油醚500 mL，浸泡12 h，超聲振蕩0.5 h，于40℃的水浴鍋中回流提取3 h，共三次，合并提取液，濃縮，得淺黃色浸膏0.262 g。精確稱取浸膏0.200 g，置于刻度試管10 mL中，加入2 mL石油醚：苯為1∶1(v/v)的溶液當(dāng)中，充分振蕩，使其完全溶解，然后加至0.1%甲酸水溶液-乙腈1.5 mL，劇烈振蕩2 min，置于40℃水浴鍋中靜置0.5 h，將試管取出冷卻到室溫，加入重蒸餾水至刻度，分層后，取上清液，采用UHPLC/Q-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。

3結(jié)果與分析

前期通過(guò)Scifinder數(shù)據(jù)庫(kù)，建立瓜馥木屬植物化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，并在該數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索瓜馥木中潛在的化學(xué)成分。采用Analyst TF1.6和Peakview(Version1.2，AB SCIEX)軟件對(duì)瓜馥木提取物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。依據(jù)測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量與理論精確相對(duì)分子質(zhì)量的偏差小于5×10-6的原則，確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化確定各色譜峰對(duì)應(yīng)化合物的分子式，在已建立的瓜馥木植物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)中檢索并匹配化合物。

3.1瓜馥木化學(xué)成分的MS/MS分析在瓜馥木根莖提取物中共鑒定出了色譜峰44個(gè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。然后對(duì)同分異構(gòu)體進(jìn)行鑒別，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜獲得化合物的碎片信息，推測(cè)出離子裂解狀況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中各個(gè)化合物結(jié)構(gòu)，區(qū)分同分異構(gòu)體。

4討論

本文在化合物精確相對(duì)分子質(zhì)量的基礎(chǔ)上，利用UHPLC/Q-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，對(duì)瓜馥木化學(xué)成分進(jìn)行了分析，并鑒定出色譜峰44個(gè)化合物，該法為研究瓜馥木化學(xué)成分提供了相對(duì)準(zhǔn)確、高效的分析途徑，也能為瓜馥木進(jìn)一步化學(xué)成分分離提供數(shù)據(jù)參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可快速完成藥材成分分析工作，省去常規(guī)方法中由粗提物、分離、純化，到重結(jié)晶后方可鑒定化合物的繁瑣過(guò)程，節(jié)約了研究成本，并且實(shí)現(xiàn)了藥材中多組分的良好分離，為瓜馥木藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了數(shù)據(jù)支撐。但該法也存在一定的局限性，如不能提供出化合物幾何構(gòu)型，且不能準(zhǔn)確指出空間位置，如果利用該方法為導(dǎo)向，針對(duì)性地對(duì)首次發(fā)現(xiàn)或者潛在新化合物進(jìn)行定向分離得到單體，進(jìn)一步配合四大光譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證，將為傳統(tǒng)的中藥化學(xué)成分分離技術(shù)提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編委會(huì).中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社.1979，30(2):10.

[2]陳奇，畢明，王明華，等．鉆山風(fēng)的藥理研究[J].中草藥，1983，14(10)：23-25.

[3]傅春燕，尹文清，周中流.瓜馥木中阿樸菲類生物堿的研究[J].中藥材，2007，30(4)：409-412.

[4]Zhu J B, Guo X J, Fu S P, et al. Characterization of steroidal saponins in crude extracts from Dioscorea zingiberensis C. H. Wright by ultra-performance liquid chromatography/electrospray ionization quadrupoletime-of-flight tandem mass spectrometry[J].Pharm Biomed Anal,2010,53(3):462-474.

[5]Qi L W, Wan H Y, Zhang H, et al. Diagnostic ion filtering to characterize ginseng saponins by rapid liquid chromatography with time-of-flight mass spectrometry[J].J Chromatogr A,2012,1230(23):93-99.

收稿日期：(2015-06-17)編輯：曾文雪

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

通信作者：***葉喜德，男，研究方向：中草藥活性成分。