HPLC法同時(shí)測定梔子膠囊中梔子苷和葛根素含量

★　周美娟　胡浩武　沈麗琴　耿炤　(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)　上海 010；.上海中創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司　上海 010；.江西匯仁藥業(yè)有限公司　南昌 005)

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HPLC法同時(shí)測定梔子膠囊中梔子苷和葛根素含量

★周美娟1,3胡浩武2沈麗琴2耿炤3(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)上海 201203；2.上海中創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司上海 201203；3.江西匯仁藥業(yè)有限公司南昌 330052)

摘要：目的：建立梔子膠囊的含量測定方法。方法：采用高效液相色譜(HPLC)法對制劑中梔子和葛根的有效成分梔子苷和葛根素進(jìn)行定量研究。結(jié)果：確定同時(shí)對兩種成分進(jìn)行定量測定的方法，梔子苷在0.0531～5.31μg/mL、葛根素在0.0288～2.88μg/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，梔子苷的平均加樣回收率為101.52%(RSD=0.58%，n=6)，葛根素的平均加樣回收率為103.41%(RSD=0.60%，n=6)。結(jié)論：建立的方法分析效率高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高。

關(guān)鍵詞：梔子膠囊；高效液相色譜法；梔子苷；葛根素

梔子膠囊是由梔子、葛根等中藥材提取制得，并對化學(xué)性肝損傷具有輔助保護(hù)作用的中藥保健品。根據(jù)藥材中已知化學(xué)成分的藥理作用及其在梔子膠囊中存在的量，我們對制劑中的梔子苷和葛根素進(jìn)行了定量研究，建立了一測多評的HPLC含量測定方法，并準(zhǔn)確和迅速的控制該產(chǎn)品質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如下。

1儀器與試藥

AgiLent 1100高效液相色譜儀；梔子苷對照品(購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110749-200714，供含量測定用)，葛根素對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200209，供含量測定用)，甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水，其它試劑為分析純。

梔子膠囊(規(guī)格：0.4g/片；批號：1211001、1211002、1211003；江西匯仁藥業(yè)有限公司)

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：采用C18色譜柱YMC(4.6mm×250mm,5μm)；流動相：乙腈-水(11∶89)。

檢測波長：經(jīng)紫外掃描梔子苷最大吸收波長為238nm；葛根素最大吸收波長為250nm；因?yàn)闂d子苷為該制劑的功效成分，所以以梔子苷的最大吸收波長238nm定為該方法的檢測波長。柱溫：35℃；流速：1.0mL/min。

2.2試驗(yàn)方法對照品溶液的制備：取梔子苷對照品、葛根素對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成每1mL中含梔子苷30μg、葛根素20μg的溶液，即得。

供試品溶液的制備：取裝量差異項(xiàng)下的梔子膠囊，研細(xì)，取約0.1g，精密稱定，置50mL量瓶中，加50%乙醇適量，超聲處理(功率200W，頻率50kHz)50分鐘，放冷，加50%乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

測定方法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀。

2.3流動相的選擇分別采用甲醇-水和乙腈-水不同比例進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)采用C18色譜柱YMC(4.6mm×250mm,5μm)在乙腈-水(11∶89)的比例，梔子苷和葛根素分離度均較好，故采用乙腈-水(11∶89)作為該制劑中梔子苷和葛根素的含量測定時(shí)流動相。

2.4提取方法考察

2.4.1提取溶劑的選擇取樣品(批號：1211001)0.2g，分別精密稱定至50mL量瓶中，分別加入適量的甲醇、乙醇、50%甲醇溶液和50%乙醇溶液，超聲30min，放置，加相應(yīng)的溶液至刻度，搖勻，濾過，即得。結(jié)果見表1。

結(jié)果選取50%乙醇溶液做為該樣品的提取溶劑。由于此兩種成分峰面積均較高，故減小該樣品的取樣量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.4.2提取方法及時(shí)間的選擇取樣品(批號：1211001)0.1g，分別采用超聲和水浴回流的方法用50%乙醇溶液進(jìn)行超聲40，50，60min，回流30，50，60min進(jìn)行比較提取方法和時(shí)間對結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示超聲方法和回流方法在不同時(shí)間的提取效果RSD梔子苷為0.89%，葛根素為0.72%，說明兩種方法并沒有顯著性差異，從方便操作和節(jié)能綜合考慮，擬采用超聲50min作為提取的方法及時(shí)間。

表2　梔子膠囊提取時(shí)間的選擇　mg/g

2.5方法學(xué)考察

2.5.1色譜系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)按梔子膠囊制備方法制備缺梔子和葛根的雙陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性樣品溶液。

在以上條件下，梔子苷和葛根素與其它相鄰組分分離度大于1.5，且缺梔子和葛根的陰性對照在相同保留時(shí)間下無吸收峰，說明陰性無干擾，見圖1-3。

2.5.2線性關(guān)系的考察取梔子苷和葛根素對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成含梔子苷0.531mg/mL，葛根素0.288 mg/mL的混合對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液1mL至5，10，25，50，100mL量瓶中，并用50%乙醇稀釋至刻度，得到以下濃度的對照品溶液，分別吸入10μL注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，結(jié)果見表3。

表3　梔子膠囊梔子苷與葛根素線性關(guān)系表

以對照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)，其中，梔子苷回歸方程為Y=14.502X+0.9963(r=1)，葛根素回歸方程為Y=34.698X-2.7179(r=1)，以上結(jié)果表明：梔子苷在0.0531～5.31μg/mL、葛根素在0.0288～2.88μg/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系。

圖1　陰性樣品圖

圖2　樣品液相圖

圖3　對照品圖(1.梔子苷；2.葛根素)

進(jìn)樣次數(shù)峰面積梔子苷葛根素平均值梔子苷葛根素RSD/%梔子苷葛根素1310.2402.92310.8400.53309.5400.04309.3399.15309.3400.06309.3400.1 309.7400.4 0.200.32

2.5.3精密度試驗(yàn)取含梔子苷21.24μg/mL和葛根素11.52μg/mL的混合對照品溶液，進(jìn)樣10μL，連續(xù)進(jìn)6次，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表4。

表5　梔子膠囊供試品溶液穩(wěn)定性

表6　梔子膠囊重復(fù)性試驗(yàn)

表7　梔子膠囊梔子苷加樣回收率試驗(yàn)

表8　梔子膠囊葛根素加樣回收率試驗(yàn)

2.5.4溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液在不同時(shí)間分別進(jìn)樣10μL，計(jì)算峰面積的RSD，結(jié)果表5。

2.5.5重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取供試品6份(批號：1211001)，按2.2項(xiàng)下方法測定樣品中梔子苷和葛根素的含量，計(jì)算平均值和RSD，結(jié)果見表6。

2.5.6準(zhǔn)確度精密稱取供試品6份，每份約0.05g，精密稱定，分別精密加入含梔子苷0.531mg/mL、葛根素0.288 mg/mL的混合對照品溶液1.70mL，并隨行供試品樣品一份，測定樣品中梔子苷和葛根素的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表7、8。

計(jì)算公式：

通過以上方法學(xué)考察，各項(xiàng)指標(biāo)均符合規(guī)定，該方法適用于制劑中梔子苷和葛根素的檢測。

2.6三批樣品檢測結(jié)果見表9。

表9　樣品含量測定結(jié)果　mg/粒

3討論

本文采用一測多評的方法對方中兩味藥材進(jìn)行定量分析，方法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度均達(dá)到要求，并通過了耐用性試驗(yàn)。該方法準(zhǔn)確、迅速、高效。

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，一定要結(jié)合藥物本身的特性，選擇適宜的指標(biāo)，才能起到穩(wěn)定化學(xué)指標(biāo)進(jìn)而保證藥效作用的目的。中藥成分復(fù)雜，目標(biāo)成分含量極其低，甚至乎是萬分之幾，采用有效成分定量檢測作為質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中指標(biāo)，是否能充分代表其藥物的本身價(jià)值，是每個(gè)起草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)人員需充分考慮的問題。

征稿啟事

《江西中醫(yī)藥》所設(shè)的重點(diǎn)欄目有《明醫(yī)心鑒》、《滕王閣醫(yī)話》等。《明醫(yī)心鑒》以介紹名老中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)和中醫(yī)臨證心得為主，重點(diǎn)刊載中醫(yī)關(guān)于疑難病的診療經(jīng)驗(yàn)，要求觀點(diǎn)、方法新，經(jīng)驗(yàn)獨(dú)到?！峨蹰w醫(yī)話》主要反映中醫(yī)教學(xué)、科研、臨床的一得之見，要求以小見大，有感而文，語言生動流暢，可讀性強(qiáng)，富于知識性、趣味性。

收稿日期：(2015-02-03)編輯：翟興英

中圖分類號：R286.0

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B