當(dāng)歸多糖對結(jié)腸炎小鼠peyer's patches結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群水平的調(diào)控作用*

★　潘琦虹　李燕珍　劉端勇　趙海梅　(.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院　南昌 33005；.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院　南昌 330004)

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)科研計劃項(xiàng)目(2008A068)。

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當(dāng)歸多糖對結(jié)腸炎小鼠peyer's patches結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群水平的調(diào)控作用*

★潘琦虹1李燕珍1劉端勇1趙海梅2**(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院南昌 330025；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院南昌 330004)

*基金項(xiàng)目：江西省衛(wèi)生廳中醫(yī)科研計劃項(xiàng)目(2008A068)。

摘要：目的：探討當(dāng)歸多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠小腸peyer's patches結(jié)(PP結(jié))T淋巴細(xì)胞亞群水平的調(diào)控作用。方法：50只雄性小鼠分成5組，正常對照組(normal)、模型對照組(model)、當(dāng)歸多糖低劑量觀察組(low)、當(dāng)歸多糖高劑量觀察組(high)、柳氮磺吡啶陽性對照組(SASP)，采用傳統(tǒng)的TNBS乙醇復(fù)合法建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，給藥7d后，觀察小鼠病理組織學(xué)變化，并分離其小腸上皮淋巴細(xì)胞，檢測各種淋巴細(xì)胞亞群水平。結(jié)果：各觀察組結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸損傷評分、病理組織學(xué)評分較模型組明顯下降(P<0.01或P<0.05)。同時當(dāng)歸多糖在一定的劑量下，可明顯下調(diào)PP結(jié)中CD4+、CD8+T細(xì)胞水平(P<0.01或P<0.05)，且高劑量組可降低CD4/CD8水平(P<0.05)。結(jié)論：當(dāng)歸多糖可緩解潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸粘膜損傷，且緩解作用可能與調(diào)節(jié)結(jié)腸炎小鼠小腸PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群平衡、糾正腸粘膜免疫狀態(tài)的紊亂有關(guān)。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸多糖；潰瘍性結(jié)腸炎；淋巴細(xì)胞亞群；粘膜免疫

潰瘍性結(jié)腸炎是一種以結(jié)腸(直腸)粘膜慢性炎癥和潰瘍形成為特點(diǎn)的疾病，其發(fā)病與粘膜免疫狀態(tài)密切相關(guān)。據(jù)報道，當(dāng)歸多糖可調(diào)節(jié)免疫及治療實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)炎，但其能否調(diào)節(jié)粘膜免疫治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用并沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1動物昆明小鼠50只，清潔級，18～22g，雄性，購于湖南景達(dá)斯萊克實(shí)驗(yàn)動物公司(SCXK 2009-0004)。

1.2藥物當(dāng)歸多糖購于江西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)中藥鑒定室鑒定，由教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取分離，純度為95%，干燥粉末，-4℃下保存?zhèn)溆谩Ａ沁拎?SASP)(滬衛(wèi)藥準(zhǔn)字(1995)第002083號)由上海三維制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3主要試劑及儀器2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)購于sigma公司(2508-19-2)，單克隆熒光標(biāo)記抗體CD3-PE、CD4-APC、CD8-FITC均購于eBioscience公司。光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)、Leica圖像分析儀(LEICA DC100，德國LEICA公司)、流式細(xì)胞儀(FACSCalibur型，美國BD公司)

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1造模方法[1]模型對照組、當(dāng)歸多糖觀察組、柳氮磺吡啶陽性對照組動物，復(fù)合麻醉劑麻醉后，用塑料軟管(直徑1mm)插入肛門4cm，按體重注入100mg/kg含30%乙醇的TNBS藥液，小鼠倒立1min使藥液達(dá)全結(jié)腸，然后動物放回原籠中自然蘇醒；正常對照組小鼠注入等量的生理鹽水。

2.2分組與給藥昆明小鼠50只，經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，按體重隨機(jī)分為5組，即正常對照組、模型對照組、當(dāng)歸多糖高劑量觀察組、當(dāng)歸多糖低劑量觀察組、柳氮磺吡啶陽性對照組，每組10只。造模成功后第1d，按體表面積換算，當(dāng)歸多糖低、高劑量觀察組分別給予0.5g/kg、1g/kg灌胃給藥；而柳氮磺吡啶對照組給予60mg/kg；正常組和模型組均給予等容積的蒸餾水同等方法灌胃，連續(xù)給藥7d，每天一次。第8d脫椎處死動物，分離小腸、結(jié)腸等，待用。

2.3取材各組動物在末次給藥后禁食12 h，脫椎處死動物，迅速自肛門上2cm處向上分離結(jié)腸6～8cm，稱重，計算結(jié)腸重量指數(shù)(結(jié)腸指數(shù)=結(jié)腸重(g)/體重(kg)×100%)。剪取部分結(jié)腸組織，10%福爾馬林溶液固定，病理切片，HE染色，光鏡下觀察潰瘍生成情況，部分結(jié)腸組織迅速于液氮中保存待用。分離小腸，收集小腸PP結(jié)。

2.4結(jié)腸組織損傷評分及評分標(biāo)準(zhǔn)動物處死后，迅速分離結(jié)腸，沿腸系膜縱軸剪開，用生理鹽水沖洗干凈，并將腸粘膜向上平鋪于蠟板上固定，觀察炎癥及潰瘍發(fā)生情況，根據(jù)炎癥損傷程度進(jìn)行結(jié)腸組織損傷評分，其評分標(biāo)準(zhǔn)[2]為：0分：無損傷；1分：粘膜充血、水腫、未出現(xiàn)潰瘍；2分：粘膜充血、水腫、輕度糜爛，無潰瘍；3分：粘膜充血、水腫、中度糜爛，有單個潰瘍；4分：粘膜充血、水腫、高度糜爛，有多處潰瘍；5分：粘膜充血、水腫、重度糜爛，有>1cm潰瘍。鏡下病理損傷評分參考Dielman等[3]提出的評分標(biāo)準(zhǔn)，評分指標(biāo)包括潰瘍、炎癥、肉芽腫、及病變深度,按有無及輕重分別記0、1、2分，病變深度達(dá)黏膜下層、肌層、漿膜層分別計1、2、3分。各項(xiàng)相加得總分。

2.5機(jī)械分離法分離小腸PP結(jié)淋巴細(xì)胞禁食12h后，脫椎處死動物，取出全部小腸，置于冰生理鹽水中，剝離腸系膜和脂肪組織，用生理鹽水沖洗腸腔5～7遍，洗去小腸內(nèi)容物，從小腸腸壁上剪下的PP結(jié)，置冰生理鹽水中反復(fù)清洗3～5遍，將PP結(jié)置于300目細(xì)胞篩中，加適量1640培養(yǎng)液研碎，制成PP結(jié)組織勻漿，濾液1500rpm，離心5min，去上清，兩次，加入1mL的1640培養(yǎng)液搖勻，即得。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群檢測分別取細(xì)胞懸液100μL與CD3(0.5μg)/CD4單克隆抗體(0.25μg)和CD3(0.5μg)/CD8單克隆抗體(0.125μg)的離心管中震勻，4℃下孵育30min；加入適量生理鹽水，以1500 r/min離心1.5min，反復(fù)幾次，棄其上清，加生理鹽水恢復(fù)體積至500μL，過濾后上流式細(xì)胞儀檢測。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1結(jié)腸損傷評分見表1。肉眼下可見模型組結(jié)腸粘膜明顯充血、水腫，中到重度糜爛和多個潰瘍，潰瘍呈圓形或橢圓形，底部干凈，或可見少量淡黃色覆蓋物，邊緣充血水腫；鏡下可見粘膜糜爛脫落、充血水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，形成多個潰瘍?nèi)睋p，結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸損傷評分及病理組織學(xué)評分明顯高于正常組(P<0.01)；各觀察組亦可見少量充血水腫和部分結(jié)腸可見輕度糜爛和潰瘍，鏡下可見潰瘍數(shù)目明顯減少，底部可見纖維結(jié)締組織增生，充血水腫明顯減輕，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤，與模型組比較結(jié)腸指數(shù)、結(jié)腸損傷評分及病理組織學(xué)評分明顯下降并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01或P<0.05)。提示當(dāng)歸多糖各劑量組可明顯緩解結(jié)腸損傷局部充血水腫，減輕炎癥細(xì)胞浸潤程度，減少潰瘍數(shù)目，促進(jìn)結(jié)腸上皮損傷修復(fù)、潰瘍愈合。

表1　結(jié)腸粘膜損傷修復(fù)情況

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01，#P<0.05。

3.2小腸粘膜PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)水平見表2。與正常組比較，模型組小鼠腸道PP結(jié)淋巴細(xì)胞中CD3+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯下降，并具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而CD4+T細(xì)胞有上升趨勢，CD8+T細(xì)胞有下降趨勢，不過其二者比值(CD4/CD8)顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，各觀察組對CD3+T淋巴細(xì)胞作用不明顯，均可明顯下調(diào)CD4+、CD8+T細(xì)胞水平，高劑量組及柳氮磺吡啶對照組可使CD4/CD8升高，并具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表2　小腸PP結(jié)淋巴細(xì)胞亞群水平

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4討論

性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎和克隆病，目前普遍認(rèn)為IBD的產(chǎn)生主要來自于黏膜免疫、相關(guān)基因和環(huán)境因素，效應(yīng)T細(xì)胞的活化是腸黏膜免疫及其后續(xù)炎癥的起點(diǎn)，外周T細(xì)胞亞群中，已明確CD4+T細(xì)胞是導(dǎo)致腸黏膜炎癥的主要效應(yīng)細(xì)胞。腸道共生的微生物抗原刺激腸黏膜T細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞或非典型NKT細(xì)胞活化后，分泌IL-13，IL-4，IL-5等。腸黏膜免疫調(diào)節(jié)紊亂導(dǎo)致炎癥性腸病的發(fā)生，表現(xiàn)與潰瘍性結(jié)腸炎相似[5-6]。在本實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠外周血CD4+T細(xì)胞水平顯著升高正好印證了這一點(diǎn)。當(dāng)歸多糖是當(dāng)歸中的主要成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，當(dāng)歸多糖具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、對血液循環(huán)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗放射損傷等其他方面的作用[6]。當(dāng)歸多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑和抗放射損傷劑已應(yīng)用于臨床，但治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床應(yīng)用鮮見報道。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)歸多糖可以通過降低大鼠潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸損傷分?jǐn)?shù)，顯著降低MDA、NO含量，MPO活性及IL-2、TNF-α水平SOD活性，升高TGF-β、IL-10水平，表明當(dāng)歸多糖可通過拮抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、損傷修復(fù)作用，緩解免疫性結(jié)腸炎大鼠炎癥反應(yīng)，減輕結(jié)腸損傷[7]。正如本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，當(dāng)歸多糖給藥后小鼠結(jié)腸少量充血水腫和部分結(jié)腸可見輕度糜爛和潰瘍，鏡下可見潰瘍數(shù)目明顯減少，底部可見纖維結(jié)締組織增生，充血水腫明顯減輕，伴少量炎癥細(xì)胞浸潤，病理損傷評分明顯下降，提示當(dāng)歸多糖可有效治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，同時當(dāng)歸多糖在一定的劑量下，可明顯下調(diào)PP結(jié)中CD4+、CD8+T細(xì)胞水平，下調(diào)CD4/CD8水平，表明當(dāng)歸多糖可能是通過明顯調(diào)節(jié)腸道粘膜免疫系統(tǒng)T淋巴細(xì)胞亞群平衡，恢復(fù)免疫耐受狀態(tài)，進(jìn)而防止或降低致炎因子的分泌或高表達(dá)，減輕炎性損傷，從而治療潰瘍性結(jié)腸炎。當(dāng)然，當(dāng)歸多糖調(diào)節(jié)腸道粘膜免疫細(xì)胞平衡的分子基礎(chǔ)未得到很好的詮釋，是否和T淋巴細(xì)胞的活化，活化的途徑，與抗原遞呈細(xì)胞活化相關(guān)性等等并不清楚，還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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收稿日期：(2015-06-22)編輯：翟興英

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

通信作者：**趙海梅(1979—)，女，博士，副教授。研究方向：中醫(yī)臨床基礎(chǔ)。Tel:0791-86588407，E-mail:haimei79@163.com。