• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    腸炎清對(duì)ICUC大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF—κB蛋白表達(dá)、TLR4mRNA的影響

    2016-11-29 08:22:38黃亦彤鐘志勇呂永慧藍(lán)天美潘競(jìng)鏘
    云南中醫(yī)中藥雜志 2016年9期
    關(guān)鍵詞:潰瘍性結(jié)腸炎

    黃亦彤+鐘志勇+呂永慧+藍(lán)天美+潘競(jìng)鏘+武昕

    摘要:目的通過觀察腸炎清對(duì)免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎模型(ICUC)大鼠結(jié)腸組織Toll樣受體4(TLR 4)和核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響,探討腸炎清治療IBD的作用機(jī)制。方法采用三硝基苯磺酸(TNBS)加免疫復(fù)合法造模。將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、腸炎清低、中、高劑量組(833、1667、3333mL/kg)、柳氮磺吡啶(SASP)組(05g/kg)。造模后第2 d,用藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃7d,給藥7天后麻醉處死大鼠,取新鮮結(jié)腸標(biāo)本,采用免疫組化法檢測(cè)TLR 4、NF-κBp65的表達(dá),實(shí)時(shí)定量PCR法(qRT-PCR)檢測(cè)TLR 4mRNA的表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果:NF-κBp65和TLR4在各組各只動(dòng)物均可見陽性表達(dá),其中腸炎清高劑量組及SASP組可顯著下調(diào)NF-κBp65的表達(dá),有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<005)。TLR4在各給藥組與模型組比較未見顯著差異(P>005)。PCR結(jié)果:與模型對(duì)照組相比,各給藥組大鼠結(jié)腸組織TLR4表達(dá)均為陽性,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>005)。結(jié)論下調(diào)TLR4、NF-κBp65的表達(dá),是腸炎清治療IBD的作用機(jī)制之一。

    關(guān)鍵詞:腸炎清;潰瘍性結(jié)腸炎;ICUC大鼠;TLR4;NF-κBp65

    中圖分類號(hào):R2855文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A文章編號(hào):1007-2349(2016)09-0072-04

    【Abstract】Objective: To observe the effect of Changyanqing on the colon tissue Toll-like receptor 4 (TLR 4) and nuclear factorκB (NF-κB) expression of immune complexes ulcerative colitis (ICUC) rats and explore its mechanism to treat IBD. Methods: Trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS) plus immune complex was used to make models. Rats were randomly divided into a control group, a model control group, Changyanqing groups with low, medium and high dose (833, 1667, 3333mL/kg) and sulfasalazine (SASP) group (0.5g/kg). In the following the day after modeling, the treatment groups were administered with corresponding drugs for 7 days, and the rats were sacrificed 7 days later to take their fresh colonic samples. Immunohistochemistry was used to detect TLR 4 and NF-κBp65 expression, and RT-PCR method to detect TLR 4mRNA expression. Results: Immunohistochemical results: NF-κBp65 and TLR4 in each group can be seen positive expression, among which the expression of NF-κBp65 of Changyanqing group with high dose and SASP group could be significantly down-regulated, and there are significant differences (P<005). TLR4 in each treatment group and the model group showed no significant difference (P>005). PCR Results, compared with the model group, TLR4 expressions of the colon tissue of each administration group were positive, but there was no significant difference (P>005). Conclusion: Changyanqing can down-regulate TLR4, NF-κBp65 expression, and its mechanism may be related to the regulation of TLR4 / NF-κB signal pathway.

    【Key words】Changyanqing, ulcerative colitis, ICUC rats, TLR4, NF-κBp65

    屬非特異性的自發(fā)免疫性疾病,病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層,臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液血便等。其病因和發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚,既往研究認(rèn)為,細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡在IBD的發(fā)生發(fā)展中占有極其重要的地位。近年來不少研究發(fā)現(xiàn),炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子可導(dǎo)致機(jī)體多條信號(hào)通路活化,直接或間接地影響炎癥介質(zhì)的表達(dá),導(dǎo)致腸黏膜受損產(chǎn)生。

    腸炎清是由我院自行研制的純中藥制劑,臨床用于口服和灌腸治療IBD、慢性腹瀉、結(jié)腸息肉電切術(shù)后致腸黏膜受損、腸道菌群失調(diào)及腸功能障礙等。該藥主治以濕熱內(nèi)蘊(yùn)型為多見的腸炎,或兼有脾胃虛弱、氣滯血淤,對(duì)受損腸黏膜有顯著的治療作用。腸炎清[1]經(jīng)結(jié)腸途徑治療,對(duì)UC尤其是輕到中度UC 能夠顯著縮短療程,減少或避免使用激素及SASP,減輕病人的痛苦。腸炎清在動(dòng)物炎癥模型中表現(xiàn)出良好的抗炎效應(yīng)[2-3]。

    本研究采用免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎(ICUC)大鼠模型,通過觀察腸炎清對(duì)ICUC大鼠TLR4、NF-κBp65表達(dá)的影響,探討腸炎清的作用機(jī)制。

    1材料與方法

    11材料

    111實(shí)驗(yàn)藥物腸炎清:廣州市中醫(yī)醫(yī)院自制,2~8℃保存,批號(hào):151128。柳氮磺吡啶腸溶片:上海信誼天平藥業(yè)有限公司,批號(hào):09141109生產(chǎn)日期:20141024;有效期至:201610。

    112動(dòng)物SD大鼠48只,雌性180~200g;SPF級(jí);新西蘭兔,雄性3kg左右;普通級(jí),由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)44007200024500,兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)44411600001758、44411600001799。

    113試劑石蠟:茂名市大川特種蠟廠有限公司。環(huán)保透明劑:上海宏茲實(shí)業(yè)有限公司。無水乙醇、95%乙醇、曙紅(水溶):廣州中南化學(xué)試劑有限公司。蘇木素:GEMADA,Biological Stain Commission,Inc。PBS緩沖液:pH72~76、枸櫞酸鹽緩沖液:pH60,武漢博士德生物工程有限公司。

    NF-κB p65 抗體:Arigo Biolaboratories集團(tuán)公司,TLR4 抗體:羅福斯生物制劑公司,GTVisionTM Ⅲ檢測(cè)系統(tǒng)/Mo&Rb:基因技術(shù)(上海)公司,正常山羊血清:Jackson ImmunoResearch實(shí)驗(yàn)公司,定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen公司,

    114儀器TS-12C型生物組織全自動(dòng)脫水機(jī):湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。EG1150型生物組織包埋機(jī):LEICA,德國。RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī):LEICA,德國。CS-VI型攤片烤片機(jī):湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。BX43型生物顯微鏡:OLYMPUS,日本。定量PCR儀:ABI PRISM 7500 Sequence Detection System。

    CellSens Standard顯微圖像軟件:OLYMPUS,日本。Image-Pro Plus version 60圖像分析軟件:Image-Pro 美國。

    12方法

    121模型建立健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后建模,造模前禁食24h。:取50g/L TNBS溶液與50%乙醇溶液以體積比1∶1混合配成25g/L三硝基苯磺酸(TNBS)乙醇溶液;刮取新西蘭兔結(jié)腸黏膜制成組織勻漿,以3000r/min速度離心30min,取上清液,檢測(cè)其蛋白含量并調(diào)節(jié)至20g/L,與等量完全弗氏佐劑混合配成抗原乳化液,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    動(dòng)物免疫:模型組大鼠全部于第1天、第14天在大鼠頸、背部注射抗原乳化液(體積為08mL/只動(dòng)物,含抗原8mg)。第21天,所有大鼠禁食不禁水24h,第22天,各組大鼠TNBS乙醇溶液灌腸造模。

    造模方法:大鼠戊巴比妥鈉麻醉,將一直徑20 mm、長(zhǎng)約12 cm的塑膠管由肛門輕緩插入大鼠體內(nèi)深約8cm,按照TNBS 75mg/kg的劑量,03mL/100g體重的給藥體積緩慢注入25g/LTNBS乙醇溶液,然后注入約01mL的空氣,將留在塑膠管內(nèi)的藥物排入腸內(nèi)。給藥完畢,緩慢拔出塑膠管,用手捏住肛門,提起大鼠尾部,持續(xù)倒置1min,使造模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)??瞻讓?duì)照組注入等量的生理鹽水。驗(yàn)證模型:造模后第2天隨機(jī)選取4只模型組大鼠麻醉后放血處死,剖腹取直腸和結(jié)腸,生理鹽水清洗后肉眼觀察結(jié)腸充血水腫情況,驗(yàn)證模型。

    122動(dòng)物分組及給藥選取40只成模大鼠,隨機(jī)分為5組。造模后第3天各組開始灌胃給藥:腸炎清低、中、高劑量組按照833、1667、3333mL/kg(按照人臨床用量的5、10、20倍折算);SASP組按05g/kg;給藥體積17mL/100g體重,2次/d,連續(xù)7天;空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。

    123標(biāo)本處理末次給藥后24h,戊巴比妥鈉麻醉、放血處死大鼠,開腹,取自肛門向上約10cm結(jié)腸段,沿腸系膜縱軸剪開,生理鹽水沖洗,取一半用4%中性甲醛固定,用于組織病理和免疫組化檢查,另一半液氮速凍,用于PCR檢測(cè)。

    124觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

    1241免疫組化法檢測(cè)TLR4和NF-κBp65表達(dá)組織標(biāo)本經(jīng)取材、固定、修切、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、石蠟切片(防脫)、脫蠟至水、抗原修復(fù)(微波法)、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片。

    每張切片放大400倍隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察,細(xì)胞呈棕黃色為陽性,定位以細(xì)胞核為主。用圖像分析軟件分別測(cè)定各個(gè)視野的平均光密度值,取均值作為每張切片的平均光密度值。

    1242qRT-PCR法檢測(cè)TLR4mRNA表達(dá)[4]Trizol 法提取結(jié)腸組織RNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。樣品1μl,1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20min,用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA,18s rRNA和28s rRNA條帶,三條條帶完整可證明RNA抽提比較完整。

    逆轉(zhuǎn)錄:RNase free的PCR管中配置溶液Total RNA10μg+H2O總體積12μl,將溶液吹打均勻,置85℃保溫5min,使RNA變性。隨后立即冰上致冷,以防止RNA復(fù)性;在該P(yáng)CR管中加入下列試劑Oligo(dT)15 05μl、Random primer(6-mer)05μl、二者濃度都是10uM、dNTP20μl、RNase inhibitor 05μl、5 x buffer 40μl、M-MLV 05μl總體積80μl。將上述20μl反應(yīng)溶液30℃保溫10min;42℃保溫60min;85℃保溫10min。

    定量PCR:檢測(cè)序列片段。內(nèi)參片段:GAPDH-200bp,目的片段:TLR4-386bp

    引物序列見表1。

    并列表說明,各組數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示(x±s),采用SPSS210統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料數(shù)據(jù)若方差齊,則采用單因素方差分析,組間比較用LSD法,若方差不齊,數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊,采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

    2結(jié)果)PCR表達(dá)結(jié)果(x±s,n=8):空白對(duì)照組:(274±164);模型對(duì)照組:(311±199);腸炎清低劑量組:(249±156);腸炎清中劑量組:(318±185);腸炎清高劑量組:(359±173);SASP組:(362±236)。

    與空白對(duì)照組相比,模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)有所增加,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>005)。與模型對(duì)照組相比,各給藥組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)均有不同程度的降低,但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>005)。

    3小結(jié)

    免疫組化法結(jié)果顯示:NF-κB和TLR4在各組各只動(dòng)物均可見陽性表達(dá),具體情況如下:

    NF-κB:主要表達(dá)部位為黏膜層頂端上皮細(xì)胞胞漿、腸腺近腸腔側(cè)上皮細(xì)胞胞漿、黏膜固有層及黏膜下層結(jié)締組織以及炎性細(xì)胞胞漿。模型對(duì)照組表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組。各給藥組較模型對(duì)照組NF-κB表達(dá)下調(diào),腸炎清高劑量組及SASP組NF-κB表達(dá)量顯著低于模型對(duì)照組。

    TLR4:主要表達(dá)部位與NFκB的表達(dá)部位一致,模型對(duì)照組表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組,各給藥組較模型對(duì)照組表達(dá)下調(diào),但未見顯著差異。

    qRT-PCR結(jié)果顯示:造模后動(dòng)物結(jié)腸組織TLR4mRNA的表達(dá)量有所升高,但未見顯著差異。與模型組相較,各給藥組TLR4mRNA表達(dá)均有不同程度的下調(diào),但未見顯著差異。

    4討論

    TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白,主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞上。TLR4最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放,引發(fā)炎癥反應(yīng)。其介導(dǎo)炎癥發(fā)生的相關(guān)機(jī)制目前已經(jīng)研究得比較透徹,TLR4識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecule pattern,PAMPS)并與之結(jié)合,經(jīng)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終導(dǎo)致 NF-κB 的激活,引發(fā)白 細(xì) 胞 介 素-1(IL -1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的釋放,介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。

    TLR4通過兩條經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活 NF-κB:My D88 依賴性和My D88 非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。MyD88 是含有TLR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白,是TLR 信號(hào)通路的下游信號(hào)因子,在TLR 信號(hào)通路中有關(guān)鍵性的作用[5-6]。其結(jié)構(gòu)上有3 個(gè)功能區(qū)域:N 端的死亡區(qū)(deathdomain,DD);與Toll 樣受體同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合的羧基末端及C 端的類似于IL-1 受體胞質(zhì)區(qū)的Toll 區(qū)。DD與白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶(interleukon-1 receptorassociated kinase,IRAK)的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合,并引起IRAK 的自身磷酸化,再經(jīng)過一系列的激活反應(yīng),最終引起I-κB 的活化,導(dǎo)致NF-κB 的激活和轉(zhuǎn)位,造成炎性細(xì)胞因子的合成與釋放,從而誘發(fā)機(jī)體本身的炎癥反應(yīng)過程。

    NF-κB在UC的發(fā)生、發(fā)展中是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn),在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用[7]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)各種與UC相關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8可通過啟動(dòng)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子誘發(fā)或加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)[8]。NF-κB的激活導(dǎo)致TNF-α、IL-1β轉(zhuǎn)錄增加,而TNF-α、IL-1β的釋放又進(jìn)一步激活NF-κB。后者通過正反饋進(jìn)一步增加TNF-α、IL-1β的分泌,同時(shí)使IL-6和IL-8等的表達(dá)亦增加。由此產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng),使炎癥不斷放大,形成“瀑布效應(yīng)”。有研究表明[9]應(yīng)用NF-κB抑制劑能改變患者的炎癥狀態(tài)。

    本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,腸炎清對(duì)TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)、TLR4mRNA表達(dá)出現(xiàn)不同程度下調(diào),其中,腸炎清高劑量組與SASP組顯著下調(diào)NF-κBp65表達(dá),證明腸炎清高劑量組與SASP組一樣,對(duì)ICUC大鼠可以抑制炎癥反應(yīng),減少結(jié)腸黏膜損傷。

    由此判斷,下調(diào)TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)、TLR4mRNA表達(dá),是腸炎清的作用機(jī)制之一。但要明確腸炎清治療IBD的作用靶點(diǎn),還需要做更為深入和全面的研究。

    參考文獻(xiàn):

    [1]呂永慧腸炎清對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜介素-10 和細(xì)胞間黏附分子-1 的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(10):1891-1896

    [2]呂永慧,胡品津,陳文紅中藥腸炎清治療小鼠葡聚糖硫酸鈉所致結(jié)腸炎的機(jī)制[J].世界華人消化雜志,2006,14:1283-7

    [3]呂永慧,陳文紅,胡品津腸炎清治療葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎的實(shí)驗(yàn)研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003,20:140-2

    [4]程曉磊,杜立陽,劉清芳復(fù)方青黛顆粒對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸toll 樣受體2,4基因表達(dá)的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2011,19(1):14-17

    [5]Nagpal K,Plantinga TS,Wong J,et alA TIR domain variant of MyD88adapter-like(Mal)/TIRAP results in loss of MyD88 binding and reduced TLR2/TLR4signaling[J].J Biol Chem,2009,284(38):25742-25748

    [6]Takeuchi O,Takeda K,Hoshino K,et alCellular responses to bacterial cellwall components are mediated through MyD88-dependent signaling cascades[J].Immunol,2000,12(1):113-117

    [7]陳吉,高美麗,白曉茹,等核因子-κB和細(xì)胞因子在潰瘍性結(jié)腸炎中的表達(dá)及其意義[J].世界華人消化雜志,2009,17(2):209-212

    猜你喜歡
    潰瘍性結(jié)腸炎
    潰瘍性結(jié)腸炎的中醫(yī)病因病機(jī)研究進(jìn)展
    中西醫(yī)結(jié)合三重免疫療法治療潰瘍性結(jié)腸炎100例臨床療效分析
    研究美沙拉嗪與柳氮磺吡啶治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床有效性
    健康教育在潰瘍性結(jié)腸炎患者護(hù)理中的效果
    美沙拉嗪口服聯(lián)合保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的效果
    藥物灌腸前行清潔灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的護(hù)理觀察
    美沙拉嗪聯(lián)合雙歧三聯(lián)活菌治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床效果
    血清抗體檢測(cè)在炎癥性腸病中的臨床應(yīng)用研究
    中藥灌腸療法治療潰瘍性結(jié)腸炎經(jīng)驗(yàn)體會(huì)
    血清C反應(yīng)蛋白和D—二聚體聯(lián)合檢測(cè)在潰瘍性結(jié)腸炎病情活動(dòng)性判斷中的價(jià)值
    又爽又黄无遮挡网站| 国内精品久久久久精免费| 无人区码免费观看不卡| 国产精品爽爽va在线观看网站| 悠悠久久av| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美极品一区二区三区四区| av视频在线观看入口| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产高清视频在线播放一区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黄色丝袜av网址大全| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日本一二三区视频观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产三级中文精品| 免费在线观看影片大全网站| 国产乱人伦免费视频| 久久人妻av系列| 一本久久中文字幕| 久久久国产精品麻豆| 村上凉子中文字幕在线| 午夜福利18| 亚洲自拍偷在线| 亚洲片人在线观看| 88av欧美| 床上黄色一级片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久精品人妻少妇| 亚洲自拍偷在线| 国产成年人精品一区二区| 成年女人永久免费观看视频| 黄频高清免费视频| 视频区欧美日本亚洲| 草草在线视频免费看| 亚洲美女黄片视频| 不卡一级毛片| 亚洲美女黄片视频| 五月玫瑰六月丁香| 偷拍熟女少妇极品色| 欧美黑人欧美精品刺激| 一进一出好大好爽视频| 国产成人系列免费观看| 男人舔女人的私密视频| 老汉色∧v一级毛片| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产av一区在线观看免费| 午夜免费观看网址| 欧美又色又爽又黄视频| 老司机在亚洲福利影院| 一级毛片精品| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产v大片淫在线免费观看| xxxwww97欧美| 国产精品 欧美亚洲| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产精品久久电影中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| 中出人妻视频一区二区| 国产69精品久久久久777片 | 手机成人av网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 午夜成年电影在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| 久久久色成人| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 丰满的人妻完整版| 日本 av在线| 国产欧美日韩一区二区三| 两个人的视频大全免费| 国产美女午夜福利| av在线天堂中文字幕| 久久香蕉国产精品| 午夜日韩欧美国产| 午夜福利免费观看在线| 草草在线视频免费看| 日本五十路高清| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 99国产精品一区二区三区| 久久久久久久久中文| 午夜久久久久精精品| av黄色大香蕉| 亚洲一区高清亚洲精品| 热99re8久久精品国产| 国产成人av教育| 久久久国产成人精品二区| xxxwww97欧美| 亚洲欧美激情综合另类| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 久久久国产欧美日韩av| 黄色 视频免费看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 麻豆成人av在线观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲最大成人中文| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久久久久久中文| 真实男女啪啪啪动态图| xxx96com| 高潮久久久久久久久久久不卡| 真实男女啪啪啪动态图| 国产欧美日韩精品一区二区| 91老司机精品| 观看免费一级毛片| 淫妇啪啪啪对白视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美乱色亚洲激情| 99国产精品99久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 淫妇啪啪啪对白视频| 欧美高清成人免费视频www| 成人一区二区视频在线观看| 一级毛片女人18水好多| 国产伦精品一区二区三区四那| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产高清三级在线| 日本三级黄在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 成年免费大片在线观看| 国产单亲对白刺激| 日本三级黄在线观看| 两个人看的免费小视频| 级片在线观看| 天堂网av新在线| 91在线观看av| 麻豆一二三区av精品| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产亚洲精品一区二区www| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲av成人精品一区久久| 日本在线视频免费播放| 日本三级黄在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产在线精品亚洲第一网站| netflix在线观看网站| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 免费av不卡在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 1000部很黄的大片| 波多野结衣高清无吗| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 天堂动漫精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 九九热线精品视视频播放| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 精品国产三级普通话版| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 露出奶头的视频| 国产伦人伦偷精品视频| 久久亚洲真实| 国内精品一区二区在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 不卡av一区二区三区| 麻豆成人av在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 午夜影院日韩av| 少妇丰满av| 最新中文字幕久久久久 | 亚洲18禁久久av| 日韩三级视频一区二区三区| 精品免费久久久久久久清纯| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲av美国av| a级毛片a级免费在线| 国产成人精品久久二区二区91| 美女cb高潮喷水在线观看 | 国产午夜福利久久久久久| 午夜视频精品福利| 97碰自拍视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 国产精品av久久久久免费| 午夜免费激情av| 老司机午夜福利在线观看视频| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产1区2区3区精品| h日本视频在线播放| 一区二区三区高清视频在线| 91av网一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| a级毛片a级免费在线| 成人特级av手机在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人精品无人区| 日韩有码中文字幕| 国产激情久久老熟女| 精品国内亚洲2022精品成人| 看黄色毛片网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 我的老师免费观看完整版| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 一个人免费在线观看的高清视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 成在线人永久免费视频| 亚洲九九香蕉| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 久久午夜亚洲精品久久| svipshipincom国产片| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲激情在线av| 嫩草影院精品99| 这个男人来自地球电影免费观看| 色av中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美日本视频| 成年版毛片免费区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| www.自偷自拍.com| 国产不卡一卡二| 97超视频在线观看视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产精品av久久久久免费| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 国产精品一及| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费看十八禁软件| 亚洲精品456在线播放app | 白带黄色成豆腐渣| 日本五十路高清| 国产av不卡久久| 天天躁日日操中文字幕| 午夜激情福利司机影院| 级片在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 午夜影院日韩av| 亚洲无线在线观看| 成年人黄色毛片网站| 亚洲国产精品久久男人天堂| 无限看片的www在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产一区二区在线观看日韩 | 在线a可以看的网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品 国内视频| 欧美色欧美亚洲另类二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 亚洲第一电影网av| 99热精品在线国产| 日本熟妇午夜| 国产极品精品免费视频能看的| 国产三级在线视频| 国产免费av片在线观看野外av| 麻豆国产97在线/欧美| а√天堂www在线а√下载| 男女之事视频高清在线观看| 欧美日韩福利视频一区二区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 中文资源天堂在线| 色哟哟哟哟哟哟| 一进一出好大好爽视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 一本久久中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 国产精品99久久99久久久不卡| 日韩精品青青久久久久久| 黄色女人牲交| 成在线人永久免费视频| 男人和女人高潮做爰伦理| 又爽又黄无遮挡网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 可以在线观看的亚洲视频| 高清在线国产一区| 色老头精品视频在线观看| 在线观看一区二区三区| 日本a在线网址| 午夜福利成人在线免费观看| netflix在线观看网站| 18禁观看日本| 国产一区二区在线av高清观看| 日本一二三区视频观看| 级片在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产一区二区在线观看日韩 | 曰老女人黄片| 18禁观看日本| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 午夜激情欧美在线| 欧美最黄视频在线播放免费| 熟女电影av网| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中出人妻视频一区二区| 99国产精品一区二区三区| 亚洲片人在线观看| 一个人免费在线观看电影 | 欧美激情久久久久久爽电影| 91字幕亚洲| 色吧在线观看| 亚洲黑人精品在线| 国产69精品久久久久777片 | 日韩三级视频一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 99精品在免费线老司机午夜| 久久精品人妻少妇| 美女黄网站色视频| 欧美黑人巨大hd| 久久久久国产一级毛片高清牌| 9191精品国产免费久久| 成年女人看的毛片在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产欧美一区二区综合| www.熟女人妻精品国产| 网址你懂的国产日韩在线| 国产真人三级小视频在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国产精品 欧美亚洲| 日本成人三级电影网站| 久久中文看片网| tocl精华| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品,欧美在线| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 日本一本二区三区精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久午夜亚洲精品久久| 免费在线观看日本一区| 我的老师免费观看完整版| 免费高清视频大片| 久久久国产成人免费| 成人一区二区视频在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久久久久久午夜电影| 免费在线观看亚洲国产| 丁香六月欧美| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美黄色片欧美黄色片| 在线观看午夜福利视频| 老司机福利观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 婷婷精品国产亚洲av| 美女午夜性视频免费| 欧美成人性av电影在线观看| 色视频www国产| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲专区中文字幕在线| 十八禁网站免费在线| 两性夫妻黄色片| 日本一本二区三区精品| 中文亚洲av片在线观看爽| 在线永久观看黄色视频| 亚洲精华国产精华精| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| АⅤ资源中文在线天堂| x7x7x7水蜜桃| 欧美日韩精品网址| 久久精品影院6| 国产亚洲欧美98| h日本视频在线播放| 一进一出好大好爽视频| tocl精华| 在线观看舔阴道视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 青草久久国产| 99国产精品99久久久久| 欧美在线黄色| 欧美黑人巨大hd| 九色国产91popny在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 亚洲国产精品成人综合色| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 深夜精品福利| 一级作爱视频免费观看| 亚洲无线观看免费| 岛国视频午夜一区免费看| 成年女人毛片免费观看观看9| av在线蜜桃| 色播亚洲综合网| 国产1区2区3区精品| 在线永久观看黄色视频| 亚洲人与动物交配视频| 一二三四在线观看免费中文在| 长腿黑丝高跟| 最新在线观看一区二区三区| av福利片在线观看| 麻豆国产97在线/欧美| 最新在线观看一区二区三区| 老司机在亚洲福利影院| 久久中文看片网| 精品欧美国产一区二区三| 国产激情偷乱视频一区二区| av中文乱码字幕在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品一区二区三区视频在线 | 国产亚洲欧美98| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产高清视频在线观看网站| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 99riav亚洲国产免费| 韩国av一区二区三区四区| 少妇丰满av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一区二区三区国产精品乱码| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久九九热精品免费| 人人妻人人看人人澡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 真人一进一出gif抽搐免费| 不卡av一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲成av人片在线播放无| 美女午夜性视频免费| 禁无遮挡网站| 欧美高清成人免费视频www| 日本 av在线| bbb黄色大片| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩三级视频一区二区三区| 亚洲avbb在线观看| 国产乱人视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成人av一区二区三区在线看| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本免费一区二区三区高清不卡| cao死你这个sao货| 看片在线看免费视频| 亚洲自拍偷在线| 男插女下体视频免费在线播放| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本 av在线| 国产成人aa在线观看| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 九色国产91popny在线| 日本五十路高清| 中国美女看黄片| 久久久久久久久中文| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久99久视频精品免费| 网址你懂的国产日韩在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 久久伊人香网站| 亚洲自拍偷在线| 国产亚洲精品久久久com| 天天一区二区日本电影三级| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成年免费大片在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美日韩乱码在线| 色视频www国产| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 禁无遮挡网站| 黄色日韩在线| 免费观看人在逋| 中文字幕久久专区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 成人av在线播放网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 麻豆国产97在线/欧美| 高清在线国产一区| 99国产极品粉嫩在线观看| av视频在线观看入口| 免费在线观看日本一区| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品国产亚洲在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久精品大字幕| 在线观看一区二区三区| 三级毛片av免费| 不卡一级毛片| 夜夜爽天天搞| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲av成人av| 国产综合懂色| 久久亚洲精品不卡| 两人在一起打扑克的视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩欧美免费精品| 看片在线看免费视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久精品91蜜桃| 两个人视频免费观看高清| 国产1区2区3区精品| 精品国产美女av久久久久小说| 老司机午夜十八禁免费视频| 精品久久久久久久久久久久久| 国产男靠女视频免费网站| 成年人黄色毛片网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 亚洲av电影在线进入| 制服人妻中文乱码| 国产一区在线观看成人免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 我的老师免费观看完整版| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久中文字幕人妻熟女| 怎么达到女性高潮| 国产精品久久久久久精品电影| 人妻久久中文字幕网| 波多野结衣高清无吗| 麻豆国产av国片精品| 黄色成人免费大全| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 91老司机精品| 丰满的人妻完整版| 高清在线国产一区| 国产一区二区在线观看日韩 | 露出奶头的视频| 免费在线观看日本一区| 18禁国产床啪视频网站| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲成人精品中文字幕电影| 在线免费观看不下载黄p国产 | 男女午夜视频在线观看| 成人av在线播放网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 久久亚洲真实| 超碰成人久久| 嫩草影院精品99| 麻豆一二三区av精品| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产av一区在线观看免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲人成伊人成综合网2020| 我的老师免费观看完整版| 久久久久九九精品影院| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩欧美免费精品| 亚洲成av人片在线播放无| 视频区欧美日本亚洲| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲在线观看片| 99精品欧美一区二区三区四区| 天堂影院成人在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| www.精华液| 亚洲国产看品久久| 免费看日本二区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美色欧美亚洲另类二区| 久久欧美精品欧美久久欧美| 美女 人体艺术 gogo| 大型黄色视频在线免费观看| 在线观看免费午夜福利视频| 在线a可以看的网站| 久久亚洲真实| 国产亚洲av高清不卡| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 精品久久久久久久末码| 网址你懂的国产日韩在线| 18禁美女被吸乳视频| 日本熟妇午夜| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人永久免费在线观看视频| 九九热线精品视视频播放| 黑人操中国人逼视频| 天天添夜夜摸| 超碰成人久久| 91久久精品国产一区二区成人 | 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产三级在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 午夜福利在线在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产精品影院久久| av片东京热男人的天堂| 欧美又色又爽又黄视频| 国产视频内射| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲片人在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品野战在线观看| 国产三级黄色录像| 麻豆一二三区av精品| 亚洲av电影在线进入| 在线观看舔阴道视频| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 男女午夜视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看|