禽巴氏桿菌株粘附蛋白基因的克隆和序列分析

段世雄1，吾魯木汗·那孜爾別克1,2，恩特馬克·布拉提白1,2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；

2.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000)

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禽巴氏桿菌株粘附蛋白基因的克隆和序列分析

段世雄1，吾魯木汗·那孜爾別克1,2，恩特馬克·布拉提白1,2

(1.吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南 吉首 416000；

2.伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，新疆 伊寧 835000)

摘要：用PCR從禽巴氏桿菌P-1059基因組DNA中分別擴(kuò)增編碼粘附蛋白OmpH，PtfA，PlpE和PM1665的基因序列，將PCR產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選含有重組質(zhì)粒DNA的重組子，并對目的基因進(jìn)行測序.DNA測序結(jié)果表明，P-1059株ompH，plpE，ptfA和pm1665基因大小分別為1 032，1 008，435，348 bp，分別編碼343，335，144，115個(gè)氨基酸的多肽.Blast分析結(jié)果顯示，P-1059株與已報(bào)道不同血清型巴氏桿菌ompH基因的同源性為95%~97%，與ptfA基因的同源性為95%~99%，與plpE基因的同源性為94%~97%，而與pm1665基因的同源性為99%.克隆得到的ompH，ptfA，plpE和pm1665基因，為禽巴氏桿菌粘附因子及其致病機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：禽多殺性巴氏桿菌；粘附蛋白；基因克??；核苷酸序列同源性

多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，簡稱巴氏桿菌)是革蘭氏陰性的短桿菌，能感染畜禽并引發(fā)豬萎縮性鼻炎和肺炎、牛出血性敗血癥、兔膿血癥和鳥類禽霍亂等疾病.根據(jù)細(xì)胞壁表面莢膜多糖(Capsular polysaccharide)的抗原性，將巴氏桿菌分為A，B，D，E和F等5種莢膜血清型，而根據(jù)細(xì)胞壁脂多糖(Lopopolysaccharide)的抗原性將巴氏桿菌分為16種菌體血清型[1-2].臨床研究表明，引起禽霍亂的菌株一般為血清型A∶1，A∶3和A∶4的巴氏桿菌，而其余血清型的巴氏桿菌能引起豬萎縮性鼻炎、牛出血清敗血癥、兔膿血癥等疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4].目前，國內(nèi)外用滅活疫苗和活疫苗來預(yù)防巴氏桿菌病，但這些疫苗存在保護(hù)周期短、交叉保護(hù)作用差和易出現(xiàn)毒力返強(qiáng)等缺點(diǎn)，所以至今本病未得到有效控制.國內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為，有效抑制細(xì)菌與宿主粘膜細(xì)胞表面相應(yīng)受體的結(jié)合過程是控制病原菌傳染的關(guān)鍵步驟，而病原菌的菌毛、莢膜和外膜蛋白一般具有粘附作用和免疫保護(hù)作用[5-6].因此，研究禽巴氏桿菌菌體表面粘附素及其致病機(jī)理，為禽霍亂的預(yù)防和治療提供十分重要的線索.

Dabo S M等[7]對A型牛源巴氏桿菌外膜蛋白A(outer membrane protein A，OmpA)的編碼基因進(jìn)行了表達(dá)和純化并檢測其粘附作用，結(jié)果顯示重組rOmpA和其抗體均能抑制細(xì)菌對牛腎細(xì)胞的粘附.Mullen L M等[8]用PCR從A型豬源巴氏桿菌基因組中擴(kuò)增纖連蛋白結(jié)合蛋白(fibronection binding protein)的編碼基因pm1665，并對pm1665基因進(jìn)行了表達(dá)和純化，粘附試驗(yàn)結(jié)果顯示重組rPM1665和其抗血清均能抑制牛源巴氏桿菌對纖連蛋白的結(jié)合.Ruffolo C G等[9]用RP-HPLC法從A型巴氏桿菌菌毛提取液中純化得到18 ku的蛋白并測定其氨基酸序列，結(jié)果表明其N端21個(gè)氨基酸序列與綠膿桿菌、節(jié)瘤擬桿菌、淋球菌和牛莫拉氏菌等病原菌的IV型菌毛亞單位蛋白(type IV fimbrial subunit protein，PtfA)具有很高的同源性，因此將其命名為巴氏桿菌IV型菌毛亞單位蛋白PtfA，而Western印跡結(jié)果顯示抗PtfA抗體分別能夠與A，B，D型巴氏桿菌的18 kDa蛋白質(zhì)結(jié)合，表明不同血清型巴氏桿菌都具有PtfA.Wu J R等[10]對A∶1型禽源巴氏桿菌的編碼脂蛋白E(P.multocidalipoprotein E，PlpE)進(jìn)行了克隆和表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組rPlpE免疫組雞對X-73株攻毒的保護(hù)率為100%，而對P-1059株(A∶3)和P-1662株(A∶4)攻毒的保護(hù)率為80%.Steen J A等[11]發(fā)現(xiàn)禽源巴氏桿菌莢膜自發(fā)突變與fis基因單點(diǎn)突變密切有關(guān)，并驗(yàn)證fis基因是莢膜多糖生物合成基因和plpE基因的正調(diào)控因子.Borrathybay E等[12]的研究表明，A型禽源巴氏桿菌的OmpH具有粘附作用，與本菌的致病性密切相關(guān).從上述研究結(jié)果可以看出，外膜蛋白和菌毛在A型巴氏桿菌對宿主的感染和致病過程中發(fā)揮重要作用，但它們的致病機(jī)理尚未清楚.筆者對A型禽源巴氏桿菌P-1059株的ptfA，plpE，pm1665和ompH基因進(jìn)行克隆和測序，為禽源巴氏桿菌致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、試劑及培養(yǎng)基血清型A∶3禽巴氏桿菌P-1059株購自中國獸醫(yī)菌種保藏管理中心;pMD18-T載體為大連寶生物工程公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，膠回收試劑盒，質(zhì)粒DNA提取試劑盒，標(biāo)準(zhǔn)DNA DL2000，PCR試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；Dextrose Starch Agar(DSA)和Tryptose Broth(TB)培養(yǎng)基為Difco公司產(chǎn)品.

1.1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)禽巴氏桿菌P-1059株的ompH基因和plpE基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)2對引物，根據(jù)禽巴氏桿菌Pm70株基因組DNA序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增pm1665和ptfA基因的引物，引物序列及其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號見表1.引物由上海生工生物工程有限責(zé)任公司合成.

表1　引物的序列、位置及擴(kuò)增片段長度

注禽巴氏桿菌P-1059株ompH和plpE基因的GenBank登錄號分別為EF203904a和EF219455b；cpm1665和ptfA基因在禽巴氏桿菌Pm70株基因組序列(AE004439)中的相應(yīng)位置.

1.2 方法

1.2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增將禽巴氏桿菌P-1059株接種于10 mL的TB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18 h，用細(xì)菌基因組提取試劑盒制備基因組DNA.用引物OmpH-F/OmpH-R從P-1059株基因組中擴(kuò)增出編碼OmpH的ompH基因，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.用引物PlpE-F/plpE-R從P-1059株基因組中擴(kuò)增出plpE基因，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.用引物PM1665-F/PM1665-R從P-1059株基因組中擴(kuò)增出pm1665基因，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.用引物PtfA-F/PtfA-R從P-1059株基因組中擴(kuò)增出ptfA基因，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

1.2.2 目的基因的克隆和測序用切膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，用T4DNA連接酶將PCR產(chǎn)物連接至pMD18-T 載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化子涂布于含有氨芐青霉素和X-Gal的LB瓊脂平板上培養(yǎng)18 h.隨機(jī)挑取抗氨芐青霉素抗性的單個(gè)白色菌落，接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)37 ℃培養(yǎng)18 h，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒制備質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切檢測這些質(zhì)粒DNA是否含有相應(yīng)的目的基因片段.將雙酶切鑒定正確的質(zhì)粒DNA送上海生工生物工程有限責(zé)任公司進(jìn)行序列測定.

1.2.3 目的基因序列的同源性分析用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Blast軟件對目的基因序列進(jìn)行同源性分析，從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)取與目的基因序列同源性較高的相關(guān)基因序列，用ClustalW軟件分析P-1059株和相關(guān)參考菌株基因的同源性.

2結(jié)果與討論

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，用引物對OmpH-F/OmpH-R，PlpE-F/PlpE-R，PM1665-F/PM1665-R和PtfA-F/PtfA-R從禽巴氏桿菌P-1059株基因組DNA中分別擴(kuò)增大小約為1.0，0.9，0.4，0.3 kb的PCR產(chǎn)物(見圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符.

M—標(biāo)準(zhǔn)DNA DL2000;1—PCR產(chǎn)物ompH基因;2—PCR產(chǎn)物plpE基因;3—PCR產(chǎn)物ptfA基因;4—PCR產(chǎn)物pm1665基因.圖1　禽巴氏桿菌P-1059株目的基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒DNA的鑒定

隨機(jī)挑取氨芐青霉素抗性的單個(gè)白色菌落，將其接種于5 mL的LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)18 h，用質(zhì)粒DNA提取試劑盒提取制備質(zhì)粒DNA.瓊脂糖凝膠電泳顯示，從白色菌落中提取的質(zhì)粒DNA大小顯著大于pUC18空載體(見圖2(a)).酶切鑒定結(jié)果顯示，用BamHI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-OmpH，pMD18-PlpE，pMD18-ptfA和pMD18-PM1665后觀察到大小約為1.1，1.0，0.4，0.3 kb的DNA片段(見圖2(b))，與預(yù)期值相符.

M—λ-HindIII酶切的標(biāo)準(zhǔn)DNA;1—空質(zhì)粒pUC18;2—pDM18-OmpH;3—pDM18-PlpE;4—pDM18-PtfA;5—pMD18-PM1665.

1—BamHI和SalI酶切的pDM18-OmpH;2—BamHI和SalI酶切的pDM18-PlpE;3—BamHI和SalI酶切的pDM18-PtfA;4—BamHI和SalI酶切的pMD18-Pm1665.

2.3 目的基因的序列分析

DNA測序結(jié)果表明，血清型A∶3禽巴氏桿菌P-1059株ompH，plpE，ptfA和pm1665基因序列長度分別為1 032，1 008，435，348 bp，GenBank登錄號分別為EF203904，EF219455，KP726887和KP726888.同源性對比顯示：P-1059株ompH基因與已報(bào)道的A型巴氏桿菌CU株(登錄號：U52213)的同源性為97%，與A型巴氏桿菌HN06株(CP003313)和D型巴氏桿菌HN-13株(AY864815)的同源性均為95%；P-1059株plpE基因與已報(bào)道的血清型A∶3巴氏桿菌P-470株(EF219453)、血清型A∶4巴氏桿菌P-1662株(EF219456)、血清型B∶2巴氏桿菌(GQ202239)、血清型A∶5巴氏桿菌C48-1株(GU108958)的同源性均為97%，而與血清型A∶1巴氏桿菌X-73株(EF219452)和血清型D∶11巴氏桿菌ATCC12948株(EF219457)的同源性分別為96%和94%；P-1059株ptfA基因與已報(bào)道的血清型A∶1巴氏桿菌IndPm94株(JX139092)和Pm70株(AE004439)的同源性均為99%，而與血清型B∶2巴氏桿菌P52株和血清型D∶1巴氏桿菌的同源性分別為98%和95%；P-1059株pm1665基因與已報(bào)道的血清型A∶1巴氏桿菌Pm70株(AE004439)和HN06株(CP003313)的同源性均為99%.

上述結(jié)果表明，粘附蛋白基因ompH，plpE，ptfA和pm1665基因序列在不同血清型巴氏桿菌中具有較高的保守性.

3結(jié)語

Borrathybay E等[12]研究表明，A禽巴氏桿菌外膜蛋白OmpH是本菌對雞胚成纖維(Chicken Embryo Fibroblast，CEF)細(xì)胞的粘附因子，而OmpH含量與莢膜厚度直接相關(guān).吾魯木汗等[13]通過同源重組原理構(gòu)建了血清型A∶1禽巴氏桿菌C48-3株ompH基因的缺失突變株ΔompH，用生物學(xué)功能實(shí)驗(yàn)檢測突變株的莢膜結(jié)構(gòu)和致病性，結(jié)果證實(shí)ompH基因的缺失突變影響細(xì)菌莢膜多糖的合成能力，與母株C48-3相比突變株對CEF細(xì)胞的粘附能力顯著降低，而突變株對小鼠的致病性相對減弱.最近，韋東等[14]比較C48-3株和突變株ΔompH的血清抵抗性和抗吞噬作用，結(jié)果顯示野生株在雞血清中的存活率顯著高于突變株，而小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對突變株的吞噬能力顯著高于野生株.上述研究表明，OmpH在血清型A∶1禽巴氏桿菌對宿主的感染和治病過程中發(fā)揮重要的作用.筆者對血清型A∶3禽巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān)-1059株的ompH基因進(jìn)行了克隆和測序.測序結(jié)果顯示，P-1059株ompH基因長度為1 032 bp，與A型巴氏桿菌CU株和D型巴氏桿菌HN-13株的同源性分別為97%和95%，表明不同血清型巴氏桿菌ompH基因序列可能有較大的差異.

Wu J R等[10]的研究表明，血清型A∶1禽源巴氏桿菌的脂蛋白PlpE具有交叉保護(hù)作用，它可以作為禽霍亂亞單位疫苗的候選抗原.Steen J A等[11]發(fā)現(xiàn)血清型A∶1禽源巴氏桿菌fis基因的突變導(dǎo)致莢膜的自發(fā)突變并降低plpE基因表達(dá)水平，暗示PlpE可能與禽巴氏桿菌的致病性相關(guān)，但其致病性及其致病機(jī)理尚未清楚.筆者對血清型A∶3禽巴氏桿菌P-1059株的plpE基因序列進(jìn)行克隆和序列分析，結(jié)果顯示plpE基因大小為1 008 bp，編碼335個(gè)氨基酸的多肽，與已報(bào)道的血清型A∶3，A∶4，A∶5和B∶2巴氏桿菌plpE基因序列的同源性均為97%，而與血清型A∶1和D∶11巴氏桿菌的同源性低于95%，表明不同血清型巴氏桿菌plpE基因序列有較大的差異.

Ruffolo C G等[9]首次從A型巴氏桿菌菌毛提取液中純化得到了Ⅳ型菌毛亞單位蛋白PtfA，通過免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PtfA在A，B，D型巴氏桿菌中普遍存在.但是禽巴氏桿菌PtfA的致病作用尚未清楚.因此，筆者對血清型A∶3禽巴氏桿菌ptfA基因進(jìn)行了克隆和測序，結(jié)果顯示P-1059株ptfA基因序列長度為435 bp，編碼335個(gè)氨基酸，與血清型A，B，D型巴氏桿菌的同源性分別為99%，98%和95%，表明不同血清型巴氏桿菌ptfA基因序列存在較大的差異.Mullen L M等[8]的研究表明，A型巴氏桿菌基因的PM1665蛋白具有粘附作用，其受體是宿主細(xì)胞表面的纖連蛋白(fibronection)，但PM1665蛋白的致病作用尚未清楚.本研究結(jié)果表明，P-1059株pm1665基因長度為348 bp，編碼115個(gè)氨基酸，與已報(bào)道的血清型A∶1巴氏桿菌的同源性為99%.

采用PCR從血清型A∶3禽巴氏桿菌基因組DNA中分別擴(kuò)增出ompH，plpE，ptfA和pm665基因，并確定它們的核苷酸序列，為進(jìn)一步開展OmpH，PlpE，PtfA和PM1665的表達(dá)及其致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯陳炳權(quán))

Cloning and Sequencing of Adhesive Protein Genes of

AvianPasteurellaMultocida

DUAN Shixiong1,NAZIERBIEKE Wulumuhan1,2,BORRATHYBAY Entomack1,2

(1.College of Biology and Environmental Sciences,Jishou University,Jishou 416000,Hunan China;2.College of

Chemistry and Biological Sciences,Yili Normal University,Yining 835000,Xinjiang China)

Abstract:The genes encoding the outer membrane protein H (OmpH),lipoprotein E (PlpE),type 4 fimbrial subunit protein (PtfA) and fibronectin binding protein (PM1665) were amplified by PCR from genomic DNA of avianPasteurellamultocidaP-1059,respectively.The PCR products were cloned into the pMD18-T vector and then sequenced.Sequence analyses showed that the open reading frames (ORFs) of theompH,plpE,ptfAandpm1665 genes were 1 032,1 008,435 and 348 bp in length,and encoded the 343,335,144 and 115 amino acid residues.Nucleotide sequence homologies of theompH,plpE,ptfAandpm1665 genes between the P-1059 and the previously reported different serotype strains ofP.multocidawere 95%~97%,95%~99%,94%~97% and 99%,respectively.In conclusion,the cloned genes encoding the adhesive proteins of avianP.multocidaP-1059 will contribute to further study on pathogenesis of this organism.

Key words:Pasteurellamultocida;adhesive protein;gene cloning;nucleotide sequence homology

通信作者：恩特馬克·布拉提白(1961—)，男，新疆伊犁昭蘇縣人，伊犁師范學(xué)院化學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院教授，博士，主要從事動(dòng)物病原微生物學(xué)研究.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30972206,31360613)

作者簡介：段世雄(1984—)，男，湖南長沙人，吉首大學(xué)生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院碩士研究生，主要從事微生物分子生物學(xué)研究

收稿日期：2015-01-16

中圖分類號：Q751

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.3969/j.issn.1007-2985.2015.02.015

文章編號：1007-2985(2015)02-0077-05