LncRNA在非小細胞肺癌中的研究進展

樊黎明 胡志東

肺癌是常見的惡性腫瘤，肺癌相關死亡是世界范圍內癌癥導致死亡的最常見原因。根據(jù)不同的分化程度和形態(tài)特征，肺癌分為小細胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）及非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC），其中NSCLC占所有肺癌患者的85%左右[1]。

人類基因組測序計劃顯示僅有2%的基因編碼蛋白，有超過90%的基因轉錄為RNA，并未編碼為蛋白質[2]。這些非編碼RNA僅有非常局限或無蛋白編碼功能，可分為兩種類型：管家ncRNA（housekeeping non-coding RNA）和調節(jié)ncRNA（regulatory non-coding RNA）。調節(jié)ncRNA以空間或時間特異性模式進行表達。根據(jù)大小，調節(jié)ncRNA可被進一步分為兩個亞型：轉錄子少于200 nt的非編碼性小RNA及轉錄子介于200 nt至100 kb間的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）。非編碼性小RNA包括微小RNA（microRNA, miRNA）、核仁小RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）、小分子干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）、小核RNA（small nuclear RNA, snRNA）等。LncRNA之前一直被認為是基因組轉錄過程中的“噪音”，不具有生物學功能。隨著近年來研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA參與了表觀遺傳、轉錄及轉錄后調控等多種途徑的基因調控，成為近些年研究的熱點。本文主要結合lncRNA的概念及功能機制，探討lncRNA在NSCLC中的最新研究進展。

1 LncRNA的特點及生物學特性

LncRNA為至少包含200個核苷酸的功能性RNA，由Okazaki等[3]首次在小鼠的DNA轉錄產物中發(fā)現(xiàn)。已有的研究[4]表明，lncRNA的產生主要有以下幾種途徑：①蛋白編碼基因的結構中斷，從而形成一段lncRNA；②一個獨立基因與兩個未轉錄基因串聯(lián)，產生含多個外顯子的lncRNA；③局部的復制子串聯(lián)形成；④非編碼RNA在復制的過程中反移位產生；⑤基因中插入一個轉座成分而產生有功能的非編碼RNA。根據(jù)lncRNA的位置和來源，可將其分為內含子lncRNA（intronic lncRNA）、基因間lncRNA（intergenic lncRNA）、正義lncRNA（sense lncRNA）、反義lncRNA（antisense lncRNA）和雙向lncRNA（bidirectional lncRNA）。

LncRNA通常較長，具有mRNA樣結構，很多l(xiāng)ncRNA由RNA聚合酶II轉錄而來，有些具有poly（A）尾巴和啟動子結構，分化過程中有動態(tài)的表達與不同的剪接方式。在植物、動物、原核生物及病毒中均可發(fā)現(xiàn)lncRNA具有組織特異性：不同組織之間的lncRNA表達量不同。同時，lncRNA具有時空特異性：同一組織或器官的不同生長階段，lncRNA表達量也會變化。

2 LncRNA在NSCLC中的作用

LncRNA在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮多種作用，因此，對于闡釋癌癥的進展來說，癌癥相關lncRNA的鑒定及與之相關的生物學功能和分子機制的探究非常重要。越來越來的證據(jù)顯示，lncRNA參與NSCLC的進展。腫瘤抑制lncRNA的研究為闡釋NSCLC的發(fā)病和發(fā)展提供了一條新的路徑，同時為尋求更多有效治療NSCLC的藥物提供了新的平臺。這里，我們將介紹幾個與NSCLC有關的lncRNA并討論其在診斷、預后及治療中的潛在臨床應用。

2.1 癌癥相關lncRNA 多個生物過程參與腫瘤進展的精確調節(jié)，這些過程涉及激活癌基因或沉默腫瘤抑制基因。NSCLC的啟動也不例外。癌基因為產物可促進腫瘤啟動和進展的基因。癌基因的激活在人類腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。因此，發(fā)現(xiàn)新的癌基因并研究其功能對于開發(fā)新的治療藥物非常重要。LncRNAs可分為致癌lncRNA和腫瘤抑制lncRNA。肺腺癌轉移相關轉錄子1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）、結腸癌相關轉錄子2（colon cancer-associated transcript 2,CCAT2）、HOTAIR及AK126698為致癌lncRNAs，他們的過表達可促進細胞生長、遷移和侵襲，促進NSCLC的進展。

由于診斷技術有限，且癌癥意識薄弱，NSCLC診斷時通常已為晚期，這導致其5年生存率不理想。為了改善生存率，亟需發(fā)現(xiàn)有效的診斷和預后生物標志物。鑒于lncRNA在腫瘤進展中發(fā)揮的多種作用[5]，lncRNA作為生物標志物的相關研究亦日趨增多。目前，僅發(fā)現(xiàn)數(shù)個lncRNA在患者的體液中可作為候選的生物標志物[6]，如HULC在肝細胞癌中呈高表達[7]，在前列腺癌患者的粘液中可發(fā)現(xiàn)前列腺癌基因3（prostate cancer gene 3, PCA3），且準確性高[8]。MALAT1可作為NSCLC診斷的生物標志物，MALAT1預示NSCLC的不良預后且可誘導遷移及腫瘤生長[9]。

2.1.1 MALAT1 MALAT1，又稱核富集常染色體轉錄產物2（nuclear-enriched transcript 2, NEAT2），是高度保守的lncRNA，轉錄子大小為8.7 kb，位于染色體11q13。Tripathi等[10]認為在不同的細胞類型和細胞周期中MALAT1的異常表達發(fā)揮“分子海綿”的作用。

MALAT1在多種腫瘤中呈過表達，包括乳腺癌、前列腺癌、直腸癌、肝癌及NSCLC，特別在早期轉移的患者中。Ji等[9]研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在早期NSCLC中可預測轉移，其表達與NSCLC患者的轉移密切相關。與Ji等[9]的研究一致，Schmidt等[11]發(fā)現(xiàn)MALAT1可刺激遷移、侵襲及腫瘤生長，但其潛在的機制尚未被闡釋。其原因可能為在特定的細胞中MALAT1的異常表達可導致異常的選擇性剪接，導致基因的錯誤表達，如致癌轉錄因子B-MYB[12]。同時，他們的研究[11]認為MALAT1參與NSCLC的發(fā)展，故MALAT1的過表達可作為識別腫瘤是否具有轉移潛質的標志，同時其也是第一個被識別的可調節(jié)NSCLC轉移的lncRNA。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1可作為NSCLC的診斷性生物標志物。Weber等[13]檢測了45例NSCLC患者及25例健康人外周血中MALAT1的表達水平，他們發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中很容易檢測到MALAT1，且MALAT1滿足作為診斷生物標志物的多個重要特征：容易獲取、微創(chuàng)手段即可獲得樣本且具有高特異性。因此，他們建議MALAT1用作NSCLC的診斷生物標志物。但同時也具有兩個缺陷：①MALAT1的敏感性并不十分令人滿意，因此，他不能單獨被用作標志物，但可作為互補的標志物。②癌癥患者與健康人中MALAT1的表達水平差異顯著，但腺癌（adenocarcinoma, AdCa）與鱗癌（squamous cell carcinoma,SCC）間差異不明顯，這提示在區(qū)別AdCa與SCC方面MALAT1不具診斷價值。

除作為診斷生物標志物外，MALAT1還預示NSCLC患者的預后不良。Schmidt等[11]研究發(fā)現(xiàn)MALAT1聯(lián)合胸腺素β4（thymosin β4）可作為早期NSCLC患者生存的獨立預后因素，MALAT1的過表達與NSCLC患者的不良預后有關。

2.1.2 CCAT2 研究[14,15]發(fā)現(xiàn)，CCAT2在結直腸癌和乳腺癌中呈過表達。最近，Qiu等[16]研究發(fā)現(xiàn)CCAT2在NSCLC中表達上調，通過siRNA沉默CCAT2可抑制體外NSCLC細胞系的增殖和侵襲。至于潛在的機制，Qiu等[16]未作解釋。然而，Ling等[14]發(fā)現(xiàn)CCAT2可通過TCF7L2介導的轉錄上調MYC、miR-17-5p及miR-20a的表達，且CCAT2過表達細胞中miR-17-5p或miR-20a的敲除可導致細胞遷移能力的大幅下降。此外，CCAT2與TCF7L2的相互作用可增加Wnt的信號活動。因此我們認為CCAT2通過相同的通路在NSCLC中發(fā)揮作用。具體機制的闡釋仍需大量研究。

CCAT2在NSCLC中呈高表達，其具有作為診斷生物標志物的潛力。CCAT2與MALAT1不同，CCAT2在肺腺癌（lung adenocarcinoma, LAD）中呈特異性過表達，而MALAT1在LAD及SCC均高表達。因此，CCAT2可作為區(qū)分LAD與SCC的生物標志物。同時，Qiu等[16]研究發(fā)現(xiàn)CCAT2聯(lián)合血清癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）可顯著提高預測效率，該聯(lián)合可預測NSCLC中的淋巴結轉移。然而，Qiu等[16]研究同時發(fā)現(xiàn)，由于淋巴結陰性NSCLC中CCAT2的表達水平并不明顯，故CCAT2不可單獨作為淋巴結轉移的生物標志物。

2.1.3 HOTAIR及AK126698 對于NSCLC患者來說，手術通常為治療的第一選擇。然而由于診斷時已處于晚期，多數(shù)患者已失去最佳的手術時機。因此，化療在NSCLC的治療中發(fā)揮重要作用。目前，以鉑類為基礎的化療是NSCLC的一線化療方案。在所有的鉑類藥物中，順鉑應用最為廣泛。然而，多數(shù)患者對順鉑并不敏感，這嚴重阻礙了化療的效率。研究化療耐藥機制對于獲得較好的化療療效非常重要。

HOTAIR為長度為2.2 kb的lncRNA[17]，位于染色體12q13.13。他是第一個被發(fā)現(xiàn)的涉及腫瘤發(fā)生的lncRNA，可通過募集多硫抑制性復合體2（polycomb repress complex 2, PRC2）或重組染色質促進各種腫瘤的進展[18]。另外，HOTAIR也參與NSCLC中的順鉑的化療耐藥。近期，有研究[19]顯示HOTAIR的過表達與LAD細胞對順鉑的敏感性有關。在體外，研究發(fā)現(xiàn)與親代A549細胞相比，順鉑耐藥的A549/DDP細胞中HOTAIR呈高表達，敲除HOTAIR可恢復A549/DDP細胞對順鉑的敏感性。在體內，在順鉑敏感的LAD組織中HOTAIR的表達明顯下調。研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR與PRC2及LSD1/CoREST/REST復合體相互作用，將其招募至HOXD基因簇，使部分基因沉默。表觀遺傳沉默是腫瘤抑制基因失活的常規(guī)機制。Zeste 2增強子（enhancer of Zeste 2, EZH2）是PRC2的組分，介導通過組蛋白甲基化的轉錄抑制。P21是DNA損傷后由抑癌基因p53誘導或p53過表達誘導的細胞周期依賴性激酶抑制劑，是HOTAIR的下游靶標。Cao等[20]研究發(fā)現(xiàn)通過siRNA誘導EZH2表觀沉默，p21在NSCLC細胞中表達明顯增加，這提示，通過與PRC2相互作用，HOTAIR可調節(jié)p21的表達。因此，HOTAIR調節(jié)LAD順鉑耐藥的潛在機制可能與通過影響p21的表達而增加凋亡及G0期/G1期的細胞周期停滯有關。

AK126698，長度為3,826 bp，存在于小腦中。研究[21]證明AK126698與NSCLC中的順鉑耐藥有關。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)AK126698在NSCLC的順鉑耐藥中發(fā)揮重要作用。他們指出，AK126698與Wnt信號通路的多個成員有關，如NKD2和FZD8。β-catenin的過表達不僅可促進NSCLC的發(fā)生，還可促進化療耐藥[23]。同時，NKD2可通過與DVL結合抑制β-catenin[24]。A549細胞中AK126698的敲除可降低NKD2的表達，并增加β-catenin的表達。因此，AK126698可部分通過Wnt信號通路調節(jié)NSCLC中的順鉑耐藥。AK126698的過表達可增加NSCLC對順鉑的敏感性。

HOTAIR及AK126698均參與NSCLC中的順鉑耐藥，因此推測，他們可以作為潛在的治療靶標。因為二者發(fā)揮相反的作用（HOTAIR的過表達促進順鉑耐藥，而降低AK126698的表達可促進順鉑耐藥），可利用相反的手段來抑制他們的作用。對于HOTAIR來說，采用有效的干擾來下調其表達可增加NSCLC患者對順鉑的敏感性，敏感化AK126698可成為緩解NSCLC患者順鉑耐藥的有效治療干預措施。然而，HOTAIR及AK126698調節(jié)化療耐藥的準確機制尚需進一步闡釋。

2.2 腫瘤抑制性lncRNA 腫瘤抑制基因的失活在人類腫瘤的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。因此，發(fā)現(xiàn)新的腫瘤抑制因子并闡釋他們的功能是了解人類腫瘤啟動潛在機制的重要過程，且對進一步研發(fā)新的治療靶標非常重要。母系表達基因3（maternally expressed gene 3, MEG3）、生長停滯特異性蛋白6-反義RNA1（growth-arrest-specific gene 6-antisense RNA 1, GAS6-AS1）和BRAF激活的非編碼RNA（BRAF activated non-coding RNA, BANCR）均為腫瘤抑制性lncRNA[25]，他們的下調可促進NSCLC的進展。研究這些lncRNAs為了解NSCLC的轉移和進展提供了新的思路。

2.2.1 MEG3 MEG3位于染色體14q32.3，長度約為1.6 kb，在各種正常組織中均表達。在多種腫瘤中可見MEG3表達的缺失，MEG3的再表達可抑制體外腫瘤的增殖。MEG3表達缺失的機制包括基因缺失、啟動子甲基化等[25-29]。MEG3表達的缺失可促進不同腫瘤的進展，包括NSCLC。

Lu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，NSCLC組織中MEG3的表達明顯下降，尤其在晚期腫瘤及體積增加的腫瘤中。同時，MEG3的過表達可下調NSCLC的細胞增殖，誘導體外凋亡并阻止腫瘤發(fā)生。而且，MEG3正常或高表達患者的中位生存時間明顯高于MEG3低表達水平的患者。MEG3的表達下降可導致p53蛋白的低水平表達。P53是一種轉錄因子，可調節(jié)各種基因的表達，這些基因可抑制腫瘤進展。一旦p53發(fā)生突變或呈低水平表達，即可促進腫瘤進展。綜合來說，MEG3在NSCLC的發(fā)展中發(fā)揮重要作用。與Lu等[30]研究一致，另兩個研究小組[28,29]的研究發(fā)現(xiàn)MEG3可通過誘導p53的活化而發(fā)揮腫瘤抑制作用。Lu等[30]還發(fā)現(xiàn)，MEG3提示NSCLC患者的預后不良。

2.2.2 GAS6-AS1 GAS6-AS1是一種腫瘤抑制lncRNA，位于染色體13q34。GAS6-AS1表達缺失的機制尚未被闡明；然而，GAS6-AS1的低表達或可促進不同腫瘤的進展，包括NSCLC。Han等[31]研究顯示，與鄰近正常組織相比，NSCLC組織中GAS6-AS1的表達明顯下調，GAS6-AS1表達的下調與淋巴結轉移呈負相關。GAS6-AS1表達的缺失與NSCLC的進展有關。潛在機制可能與影響其宿主基因GAS6有關。GAS6是Axl/Sky酪氨酸激酶家族的配體，是最先被確定的在生長停滯細胞中起誘導作用的基因。Axl的過表達可促進有絲分裂并在不同腫瘤中發(fā)揮促存活功能，還可介導神經膠質瘤細胞的增殖、遷移及侵襲[32]。GAS6對Axl有很高的親和力，對于多種腫瘤的遷移和侵襲來說，GAS6/Axl是必需的。GAS6介導的細胞遷移和侵襲的機制可能為：通過AP-1活化蛋白1轉錄因子、c-Jun和ATF-2的JNK及ERK1/2依賴的機制，GAS6可誘導SLUG的表達，可降低E-cadherin的表達、誘導vimentin及細胞遷移[33]。GAS6-AS1位于GAS6的下游，在Han等[31]研究中，他們發(fā)現(xiàn)GAS6-AS1水平與GAS6 mRNA水平呈負相關。他們還發(fā)現(xiàn)在NSCLC患者中GAS6 mRNA水平與臨床病理因素間存在相關性，GAS6水平的增加與淋巴結轉移及TNM分期較晚呈正相關，提示預后不良，這顯示，GAS6可調節(jié)GAS6-AS1的功能。

NSCLC與GAS6-AS1的下調有關，尤其在診斷為晚期的患者中，可成為NSCLC患者尤其是伴有轉移患者的潛在診斷靶標。在Han等[31]研究中，單因素及多因素分析亦顯示GAS6-AS1的表達是NSCLC患者總生存期的獨立預后指標。

2.2.3 BANCR BANCR位于染色體9q21.11，大小為693 bp，可發(fā)揮腫瘤抑制作用，并可通過調節(jié)細胞生長停滯、抑制細胞侵襲而調節(jié)細胞增殖，從而降低惡性腫瘤的發(fā)病率。Flockhart等[34]在惡性黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，BANCR在介導黑色素細胞瘤細胞遷移中發(fā)揮作用。

除黑色素瘤外，BANCR也可介導NSCLC的進展。Sun等[35]研究表明，與正常肺組織相比，NSCLC腫瘤組織中BANCR的表達水平顯著下降，BANCR的異常表達與患者的總生存期相關：低BANCR表達水平患者的生存期顯著短于高表達者。另外，Sun等[35]的研究顯示上調BANCR的表達可抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，而BANCR表達的敲除可促進細胞遷移和侵襲。

BANCR抑制NSCLC侵襲和轉移的分子機制可能與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）有關。EMT的最主要特征為N-cadherin、vimentin的異常表達及E-cadherin的表達下調或缺失[36-38]。與EMT的主要特征相符合，BANCR的表達缺失可降低E-cadherin的表達，誘導N-cadherin、vimentin和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteases, MMPs）。MMPs也參與細胞遷移，這提示EMT或許是BANCR介導NSCLC侵襲和轉移的機制之一。BANCR的下調與NSCLC患者的腫瘤體積更大、病理分期更晚、轉移距離更遠和更短的生存時間有關[35]。因此，BANCR的異常表達為TNM分期提供了重要的預測價值，其或許可作為潛在的診斷和預后生物標志物。

3 結論

在所有的惡性腫瘤中，肺癌具有較高的發(fā)病率和死亡率。盡管許多研究人員致力于NSCLC發(fā)病機制的研究，然而潛在的機制仍未被完全闡明且治療效果仍不理想。為進一步揭示NSCLC的機制并探索新的治療方案，研究主要聚焦于lncRNA。LncRNA可作為新的診斷和預后生物標志物，并且可作為多種腫瘤的治療靶標。對于NSCLC，lncRNA對于早期患者來說是極具希望的標志物，且可用作非侵襲性篩查。另外，lncRNA亦可作為化療敏感性的預測標志物，利于提供更好的治療選擇。最后，lncRNA在NSCLC進展中的新興作用為更深入的研究提供了良好的基礎，且為研發(fā)更為有效的治療藥物提供了更好的途徑。