關(guān)于藍(lán)莓花青素提取及其抗氧化活性的分析

孫 莉

（呼倫貝爾市食品藥品監(jiān)督管理局執(zhí)法稽查支隊(duì) 內(nèi)蒙古 海拉爾 021008）

引言

藍(lán)莓花青素是藍(lán)莓鮮果中最為主要的活性成分，在實(shí)際研究分析時(shí)，因藍(lán)莓花青素比較容易氧化，所以，國(guó)內(nèi)外研究并未形成統(tǒng)一的定性以及定量測(cè)定方法。首先，針對(duì)花青素的定量測(cè)試方法主要包括正丁醇-鹽酸法、香草酸-鹽酸法、香草酸-硫酸法等。其中，花青素結(jié)構(gòu)對(duì)正丁醇-鹽酸法受的影響比較大，在這種情況下，不適合測(cè)定低聚合度花青素。香草酸-鹽酸法在測(cè)定花青素含量較低的提取物水溶液時(shí)，體系透明度較低；干擾較大香草酸硫酸法時(shí)，由于硫酸的強(qiáng)氧化作用使得測(cè)定結(jié)果偏低。其次，定性方法包括紅外吸收光譜法、高效液相色譜法(HPLC)等。其中，HPLC既可以對(duì)花青素定性也可以對(duì)花青素定量?；诖?， 應(yīng)利用此方法進(jìn)行藍(lán)莓中的花青素提取以及抗氧化活性分析。

一、藍(lán)莓的生物活性物質(zhì)

實(shí)驗(yàn)證明，藍(lán)莓的果實(shí)與葉子均能夠入藥，其果實(shí)藥性酸、甘、平，能夠有效防止痢疾，葉片則性比較苦、澀、溫，且有小毒，能夠起到利尿、解毒的功效。藍(lán)莓果實(shí)中包含大量的花色苷以及多酚類抗氧化活性成分，能夠?qū)θ梭w內(nèi)的自由基進(jìn)行有效清除，起到預(yù)防癌癥的作用。需要說明的是，藍(lán)莓果實(shí)中包含豐富的果膠，藍(lán)莓花色苷對(duì)血栓形成有良好的預(yù)防效果，進(jìn)而能夠降低心血管的發(fā)病幾率。藍(lán)莓花青素利用視網(wǎng)膜紅色素的增加進(jìn)而舒緩眼部疲勞，對(duì)人眼睛的機(jī)能能夠有效改善，可以起到預(yù)防白內(nèi)障的作用。藍(lán)莓還可以起到延緩腦神經(jīng)衰老的作用。再就是，藍(lán)莓果實(shí)因其維生素含量比較豐富，因而能夠起到促進(jìn)創(chuàng)傷和骨折愈合的功效，提升機(jī)體免疫力。

二、藍(lán)莓花青素提取與分析

（一）實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.實(shí)驗(yàn)材料

選取鄂倫春地區(qū)藍(lán)莓鮮果若干；藍(lán)莓花青素則通過實(shí)驗(yàn)室來加以制備；矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品，歐洲藥典(EP)對(duì)照品，CAS號(hào)：528-58-5。

2.儀器與試劑

（1）儀器

微波合成萃取儀；DS-1型高速組織搗碎；色譜柱：KromasilRP-C18柱，合肥馬伊娜分析儀器有限公司。

（2）試劑

對(duì)于新型“被XX”結(jié)構(gòu)中“被”的歸屬問題各家說法不一，主要有助詞/助動(dòng)詞說、否定標(biāo)記說、類詞綴說、副詞說。除副詞說認(rèn)為“被”是實(shí)詞外，其他幾種說法都認(rèn)為“被”是虛化程度較高的成分。

丙酮、乙腈、甲酸等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.原料預(yù)處理

選取若干藍(lán)莓樣品，其中，需要去除未成熟抑或出現(xiàn)破碎的樣品，將選取的樣品放至低溫冰箱(溫度為-20°C)中保存，使用時(shí)才取出，并用組織搗碎機(jī)搗成勻漿備用。

2.丙酮浸提法

（1）丙酮濃度對(duì)花青素提取效果的影響

稱取五份重量為5.0g的藍(lán)莓漿液，分別加入50%、60%、70%、80%、90%的丙酮溶液，料液比為1：4。在4°C的恒溫水浴中封口振蕩1.5小時(shí)后，加以過濾，以紫外-可見分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，確定最佳提取液濃度。

（2）提取溫度對(duì)花青素提取效果的影響

稱取四份重量為5.0g的藍(lán)莓漿液，分別加入濃度為70%的丙酮溶液，料液比為1：4，分別在0°C、4°C、15°C、25°C下水浴中封口振蕩1.5小時(shí)后，加以過濾，以紫外-可見分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，確定最佳提取溫度。

稱取四份重量為5.0g的藍(lán)莓漿液，分別加入濃度為70%的丙酮溶液，料液比為1：4，在4°C的水浴中分別封口振蕩0.5h、1h、1.5h、2h，加以過濾，以紫外-可見分光光度計(jì)在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，確定最佳提取時(shí)間。

（4）料液比對(duì)花青素提取效果的影響

由圖1可知，料液比為1：3時(shí)，花青素提取率最高。隨著料液比的增大，提取得到的花青素含量也逐漸增加，當(dāng)料液比為1：3時(shí)，提取率達(dá)到最大。當(dāng)料液比大于1：3時(shí)，溶液中水的體積也增大，使水中吸附更多的氧，部分花青素因而被氧化，導(dǎo)致花青素含量降低。

圖1 料液比對(duì)花青素提取率的影響

3.藍(lán)莓花青素提取最佳條件

為了尋找藍(lán)莓花青素的最佳提取條件，本試驗(yàn)對(duì)丙酮濃度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比4 個(gè)因子設(shè)計(jì)了 正交試驗(yàn)組合表( 見表1)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響次序?yàn)椋禾崛囟?丙酮濃度>提取時(shí)間>料液比，從而得出最佳提取工藝是：70%兩酮，提取溫度為4℃，提取時(shí)間為1.5h，料液比為1：3。

三、藍(lán)莓花青素的抗氧化活性分析

（一）實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

1.DPPH自由基的清除實(shí)驗(yàn)

圖2 花青素對(duì)DPPH自由基的清除作用

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，藍(lán)莓花青素和VC對(duì)DPPH自由基的清除率與它們的濃度存在劑量效應(yīng)關(guān)系，且與藍(lán)莓花青素和VC的濃度呈正相關(guān)性，并且在測(cè)定濃度范圍內(nèi)(5-25μg/mL)，表現(xiàn)出了清除率與濃度呈線性關(guān)系。清除 DPPH活性大小為：藍(lán)莓花青素>VC。根據(jù)上圖可以計(jì)算出，藍(lán)莓花青素對(duì)DPPH的清除能力的IC50約為11.5μg/mL，而VC對(duì)DPPH的清除能力的IC50約為14.2μg/mL。抑制濃度越小，則表明清除 DPPH 的能力越強(qiáng)，因此，藍(lán)莓花青素對(duì)DPPH 的清除能力強(qiáng)于VC。

圖3 花青素對(duì)HO 自由基的清除作用

2.HO自由基清除實(shí)驗(yàn)

由圖 3可知，藍(lán)莓花青素具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力。并且在測(cè)定濃度范圍內(nèi)(0.1-0.5rng/mL)，清除能力隨濃度增大而增強(qiáng)，并呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系。在低濃度時(shí)，藍(lán)莓花青素和VC對(duì)HO的清除能力比較接近；隨著濃度的增大，兩種物質(zhì)對(duì)HO的清除能力相差越來越大。濃度相同時(shí)，對(duì)HO的清除能力大小為：藍(lán)莓花青素>VC。據(jù)此可知，藍(lán)莓花青素對(duì)HO的清除能力的IC50約為0.28mg/mL，而VC對(duì)HO的清除能力的IC50約為0.36 mg/mL，表明：藍(lán)莓花青素對(duì)HO的清除能力強(qiáng)于VC。

圖4 花青素對(duì)O2-自由基的清除作用

3.超氧陰離子自由基(O2-)的清除實(shí)驗(yàn)

由圖4可知，藍(lán)莓花青素和VC對(duì)O2-自由基都有一定的清除作用。在實(shí)驗(yàn)的 l0μg/mL-50μ g/mL濃度范圍內(nèi)，隨著藍(lán)莓花青素和VC濃度的升高，其清除作用也越明顯，并且濃度與清除率之間具有較好的線性關(guān)系。據(jù)此可知，藍(lán)莓花青素對(duì) O2-自由基的清除能力的 IC50約為 29.34μ g/mL，而VC對(duì)O2-自由基的清除能力的IC50約為34.65μg/mL，表明：藍(lán)莓花青素對(duì)O2-自由基的清除能力強(qiáng)于VC。

（二）藍(lán)毒花青素抗氧化性能的研究

花青素類化合物對(duì)多種自由基都具有較強(qiáng)的捕捉能力。藍(lán)莓花青素的抗氧化能力可以通過多種途徑來表現(xiàn)，例如:通過與 O2-反應(yīng)，來抑制活性氧自由基的作用；通過整合金屬離子，來減少金屬離子對(duì)氧化反應(yīng)的催化作用；還具有阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)定藍(lán)莓花青素對(duì)DPPH自由基、HO自由基和超氧陰離子自由基(O2-)的清除能力。DPPH是一種很穩(wěn)定的自由基，它的顏色減退程度與清除劑的清除能力及數(shù)量呈定量關(guān)系。該方法穩(wěn)定性好、靈敏度高，被廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力；HO自由基和超氧陰離子自由基(O2-)在生命過程中會(huì)不斷產(chǎn)生，是最具有代表性的自由基。而且HO自由基的氧化能力很強(qiáng)，能發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，且反應(yīng)速度最快，對(duì)機(jī)體的損傷也最大；超氧陰離子自由基(O2-)的形成時(shí)間最早，它的危害性僅次于HO自由基。

四、小結(jié)

藍(lán)萄花青素的抗氧化能力很強(qiáng)。藍(lán)莓花青素能明顯抵抗DPPH自由基、HO自由基和超氧陰離子 O2-自由基，并且藍(lán)莓花青素對(duì)這三種物質(zhì)的清除率均與花青素濃度呈線性關(guān)系。在實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)莓花青素對(duì) DPPH自由基的最大清除率可達(dá)69.8%，對(duì)HO自由基的最大清除率可達(dá)74.8%，對(duì)超氧陰離子O2-自由基的最大清除率可達(dá)77.6%。而且，藍(lán)莓花青素的抗氧化能力高于同等濃度下的VC。