梅毒螺旋體脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞表達細胞因子的研究

孫 冉，劉子蓮，褚小玲，張海萍

梅毒螺旋體脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞表達細胞因子的研究

孫 冉，劉子蓮，褚小玲，張海萍

[摘要]目的 通過體外建立巨噬細胞模型，研究梅毒螺旋體(TP)相對分子質(zhì)量15 000、17 000、47 000膜脂蛋白誘導(dǎo)THP-1細胞表達細胞因子的活性，評價其在梅毒感染細胞免疫中的作用，為進一步研究梅毒螺旋體的致病機制和生物學(xué)功能提供理論基礎(chǔ)。方法 用不同劑量PMA誘導(dǎo)THP-1細胞，分別觀察細胞的形態(tài)和檢測膜表面CD14受體表達情況，確定PMA誘導(dǎo)THP-1細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞的適宜劑量與時間。在此基礎(chǔ)上利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測不同濃度合成脂肽，刺激THP-1細胞分泌細胞因子的含量，并檢測CD14抗體預(yù)處理THP-1細胞后對細胞因子分泌水平的影響。結(jié)果 THP-1細胞在5 ng/ml PMA濃度誘導(dǎo)下48 h分化較為成熟，可以作為體外實驗的巨噬細胞模型。TP15、TP17和TP47均可誘導(dǎo)THP-1細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-8。以1 000 ng/ml TP47誘導(dǎo)分泌水平較高。CD14抗體預(yù)處理后細胞對3種脂肽的反應(yīng)能力均下降，所檢測的3種細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-8）分泌量均較對照組減少，其中IL-1β及IL-8的分泌濃度下降較為明顯。結(jié)論 TP15、TP17和TP47均能誘導(dǎo)TPH-1產(chǎn)生促炎性細胞因子，但是TP15和TP17的刺激能力不如TP47。CD14分子參與了TP15、TP17和TP47活化THP-1細胞產(chǎn)生細胞因子的過程。本研究采用根據(jù)TP膜脂蛋白N端合成的脂肽，可能不能完全真實反映TP天然膜脂蛋白的活性，需要進一步研究和證實。

[關(guān)鍵詞]梅毒螺旋體；脂肽；THP-1

[中圖分類號]R759.1

[文獻標識碼]A

[文章編號]1674-1293(2015)05-0336-04

DOI：10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20150506

基金項目：北京市自然科學(xué)基金資助項目（7102079）

作者簡介：孫冉，博士研究生，研究方向：性傳播疾病的免疫學(xué)研究，E-mail: srxj2004@163.com

通訊作者：張海萍，E-mail: zhanghaiping@xwh.ccmu.edu.cn

[Abstract]Objective The study was designated to establish macrophage model and investigate the production of proinflammatory cytokines from macrophages induced by Treponema pallidum lipopeptide. Methods Different doses of PMA were used to induce THP-1 cells for 24 h, 36 h and 48 h, then morphology of the cells and the expression of CD14 receptor were observed, so as to determine the appropriate doses and times of PMA intervention. Subsequently, the concentration of TNF-alpha, secreted by THP-1 cell stimulated with TP15, TP17 and TP47, was detected by ELISA, as well as the concentration of the same indicators after blocking the CD14 receptor. Results THP-1 cells induced by 5 ng/ml PMA for 48 h, can be used as a model of macrophage in vitro experiment. TP15, TP17 and TP47 can induce THP-1 cells to secrete TNF-alpha, IL-1beta and IL-8. The level of CKs secreted by THP-1 cells induced by 1000 ng/ml TP47 is higher. The level of IL-1beta and IL-8 decreased notably after blocking CD14 receptor. Conclusions TP15, TP17 and TP47 can induce macrophage to secret cytokines, compared with TP47, the level of cytokines secreted by macrophages stimulated with TP15 and TP17 was lower, which illustrated that The latter two may not be the major pathogenic component of treponema pallidum in syphilis. Three lipopeptides stimulated macrophages through cell surface CD14 receptor molecules, and then lead to the activation of downstream signaling pathways and the secretion of the cytokines.

收稿日期（2015-05-25 修回日期 2015-06-30）

作者單位：100029 北京，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院（孫冉，褚小玲）；首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院（張海萍）；北京大學(xué)第三醫(yī)院（劉子蓮）

The research of cytokines-induced function of Treponema pallidum lipopeptides activated THP-1

SUN Ran，LIU Zi-lian，CHU Xiao-ling，et al
Department of Dermatology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029, China

[Key words]Treponema pallidum；Lipopeptide；THP-1

[J Pract Dermatol, 2015, 8(5):336-339]

梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）感染所引起的一種慢性、全身性性傳播疾病，其臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，可累及全身多個器官和系統(tǒng)，嚴重危害人類健康[1]。明確TP的致病因子及進行致病機制的研究，是防治本病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。國內(nèi)外研究表明，TP抗原的構(gòu)成相對復(fù)雜，主要為膜脂蛋白和鞭毛蛋白。TP膜脂蛋白是促炎激動劑[2,3]，能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生

較強的免疫應(yīng)答，可能是TP的主要致病因子，在梅毒的致病、感染和診斷中具有重要的作用[4,5]。Matthew等[6]發(fā)現(xiàn)至少有12種膜脂蛋白具有很強的抗原性，其中相對分子質(zhì)量為15 000、17 000和47 000的膜脂蛋白具有代表性，已廣泛用于梅毒螺旋體的特異性診斷[7]，并且可以作為主要的免疫原性蛋白。但是，由于TP體外人工培養(yǎng)尚未成功，限制了對TP的深入研究。有報道稱與天然螺旋體外膜脂蛋白N端相符合的脂肽在體外能夠誘導(dǎo)出與天然脂蛋白相似的促炎癥反應(yīng)[8,9]，可以作為研究TP膜脂蛋白的替代物。

1　材料和方法

1.1 試劑與儀器

THP-1細胞（人單核細胞株，購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞中心），相對分子質(zhì)量15 000、17 000脂蛋白合成脂肽和47 000膜抗原合成脂肽（以下簡稱TP15、TP17和TP47）（EMC microcollections GmbH），LPS（Sigma），RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone），DMSO（Applichem），PMA（Promega），CD14抗體（Invitrogen），腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β和IL-8 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒（武漢博士德），二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（Forma scientific，美國），光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本），DNM-9602型酶標分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 PMA誘導(dǎo)THP-1細胞轉(zhuǎn)化 用2.5、5、10 ng/ml PMA與THP-1細胞共培養(yǎng)后，分別于24、36、48 h觀察細胞狀態(tài)，并檢測細胞表面標志受體CD14表達率，以確定PMA誘導(dǎo)THP-1細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞的濃度及刺激時間。

1.2.2 3種不同濃度脂肽誘導(dǎo)THP-1分泌TNF-α、IL-1β和IL-8的水平 實驗組分別加入10、100、1 000 ng/ml不同濃度梯度的TP15、TP17、TP47和LPS，對照組加入含0.05 μl無菌DMSO的培養(yǎng)液孵育，空白對照組為新鮮RPMI1640培養(yǎng)液，刺激6 h后收集每孔細胞上清液，ELISA法測定細胞因子濃度，每孔設(shè)置3個復(fù)孔。

1.2.3 檢測CD14抗體預(yù)處理后對TNF-α、IL-1β和IL-8產(chǎn)生的影響 用10 μg/ml CD14抗體預(yù)處理THP-1細胞1 h后，按實驗分組分別加入100 ng/ml濃度的TP15、TP17、TP47及LPS，刺激6 h后收集上清液，ELISA法測定細胞因子濃度。對照組只加入RPMI1640，不加CD14抗體，每孔設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗均重復(fù)3次。本實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（xˉ ±s）表示，運用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包完成數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計學(xué)處理，P＜0.05表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分化的形態(tài)學(xué)變化

人單核細胞株THP-1細胞呈類圓形，表面相對光滑，在培養(yǎng)液中懸浮生長，部分細胞呈群聚葡萄串樣生長，經(jīng)PMA誘導(dǎo)后細胞形態(tài)逐漸不規(guī)則，相互聚集呈群落生長，胞體增大且胞質(zhì)出現(xiàn)空泡，細胞表面伸出偽足，12 h開始細胞逐漸相互聚集貼壁，24 h后貼壁細胞數(shù)明顯增加，細胞體積增大，開始呈梭形改變，48 h后胞質(zhì)出現(xiàn)樹枝狀突起（圖1）。

圖1　PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分化的形態(tài)學(xué)變化

2.2 流式細胞儀檢測THP-1細胞表面CD14的表達

分別收集不同時間點不同濃度PMA誘導(dǎo)后的細胞，流式細胞儀檢測細胞表面CD14受體的表達情況，顯示5 ng/ml PMA誘導(dǎo)48 h時THP-1細胞表面CD14表達率較高，可以作為體外實驗的巨噬細胞模型。

2.3 合成脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌TNF-α的水平

TP15與TP17各濃度組間誘導(dǎo)THP-1細胞分泌TNF-α的能力相近（P＞0.05）；TP47刺激其分泌TNF-α的能力隨著脂肽濃度升高而升高，各濃度組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而在濃度為1 000 ng/ml時達到398.08 pg/ml，與對照組1 000 ng/ml LPS 的分泌水平接近（圖2）。

2.4 合成脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌IL-1β的水平

TP15誘導(dǎo)THP-1細胞分泌IL-1β的濃度在1 000 ng/ml時較其他各組低（P＜0.05）；TP17和TP47均在1 000 ng/ml時分泌水平達到高峰；TP15和TP17各濃度組IL-1β分泌量均較同濃度組LPS低，TP47 在1 000 ng/ml濃度時分泌量較同濃度組LPS高（圖3）。

2.5 合成脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌IL-8水平

TP脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌IL-8的濃度均較低，其中TP17和TP47的 10 ng/ml與100 ng/ml兩濃度組的分泌水平相近（P＞0.05），而1 000 ng/ml刺激其分泌IL-8的水平達到高峰，且與同濃度組LPS分泌

量相近（圖4）。

2.6 CD14分子參與3種脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌TNF-α、IL-1β及IL-8水平

通過阻斷CD14受體之后，檢測THP-1細胞對3種合成脂肽的反應(yīng)能力，結(jié)果顯示CD14受體被阻斷后細胞對脂肽的反應(yīng)能力均下降，所檢測的3種細胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-8）分泌量均較對照組減少,其中TNF-α兩組間無明顯差異（P＞0.05），而IL-1β及IL-8的分泌濃度在CD14被阻斷后下降較為明顯（P＜0.05）（圖5-7）。

圖2　TP脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌TNF-α的濃度（pg/ml）

注：*與對照組比較，P<0.05；#與10 ng/ml組比較，P<0.05；※與100 ng/ml組比較，P<0.05(ng/ml)

此次尿常規(guī)檢測結(jié)果顯示，93例患者使用干化學(xué)法，定量白細胞檢出率為11.83%，使用沉渣鏡檢法定量白細胞檢出率為26.88%，干化學(xué)法聯(lián)合尿沉渣鏡檢法定量白細胞檢出率為39.78%，多項數(shù)據(jù)相較于聯(lián)合組都比較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖3　TP脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌IL-1β的濃度（pg/ml）

圖4　TP脂肽誘導(dǎo)THP-1細胞分泌IL-8的濃度（pg/ml）

圖5　THP-1細胞CD14受體阻斷后分泌TNF-α的濃度

圖6　THP-1細胞CD14受體阻斷后分泌IL-1β的濃度

圖7　THP-1細胞CD14受體阻斷后分泌IL-8的濃度

3　討論

目前普遍認為細胞免疫在TP感染后的致病中發(fā)揮重要作用[10]，TP侵入皮膚黏膜后，與致病相關(guān)的蛋白成分激活局部組織的單核/巨噬細胞，誘導(dǎo)合成一系列炎癥遞質(zhì)，引起宿主組織損害和細胞浸潤[11]。為了闡明TP15、TP17和TP47是否具有促炎癥活性及三者之間促炎癥活性的差別，本研究采用THP-1細胞轉(zhuǎn)化后的巨噬細胞為研究對象，主要由于其對各種刺激因素的敏感性更強，更能真實反映出對人的致病性；其次巨噬細胞在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，是炎性反應(yīng)中主要的調(diào)節(jié)細胞。當(dāng)宿主發(fā)生病原體感染后，巨噬細胞在有效清除病原體方面起了重要的作用[12]。同時為了研究可能的信號傳導(dǎo)通路，選擇了膜蛋白細胞傳導(dǎo)有關(guān)的重要分子CD14為研究對象，用CD14抗體阻斷相應(yīng)的信號通路，觀察其對細胞因子分泌的影響。

TNF-α、IL-1β和IL-8是重要的細胞因子（CKs）[13-15]，是啟動炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵。本實驗結(jié)果顯示，TP15、TP17刺激THP-1細胞分泌TNF-α的能力與脂肽濃度無相關(guān)性，而TP47的刺激能力呈劑量依賴性。以1 000 ng/ml TP47刺激能力最強，表明TP感染時主要由TP47刺激巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α，TP15和TP17也有一定作用，但可能不是主要的刺激因素。TP17刺激THP-1細胞分泌IL-1β的能力呈劑量依賴性，TP47的刺激能力以1 000 ng/ml濃度時刺激能力最強，

且高于同濃度梯度的LPS對此種細胞的刺激能力，也說明TP47刺激巨噬細胞分泌細胞因子的能力較其他兩種脂肽強。而TP15刺激THP-1細胞分泌IL-1β 于1 000 ng/ml時反而下降，可能由于高濃度TP15會干擾THP-1細胞的生物學(xué)功能。Sellati等[16]用脂肽刺激轉(zhuǎn)化后的THP-1細胞，TP47濃度為1 000 ng/ml時細胞分泌IL-8水平達到8 000 pg/ml，而本次研究結(jié)果顯示，3種脂肽在不同濃度梯度時IL-8的分泌量均較低，不超過80 pg/ml，造成這種差異的原因還有待進一步研究。

這些細胞因子的生物學(xué)功能具有多效性。一方面能促進機體固有免疫系統(tǒng)清除病原體，另一方面影響機體炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，從而可能直接或間接引起組織損傷[17]。由于細胞因子對機體具有雙重效應(yīng)，其對機體炎癥反應(yīng)的調(diào)控?zé)o疑取決于所有免疫細胞之間的相互作用。然而本研究僅限于對單核巨噬細胞系的探討，因此不能完全反應(yīng)機體感染TP后免疫系統(tǒng)的實際情況，但是對于后續(xù)的研究具有一定的指導(dǎo)意義。

在 TP脂蛋白誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的信號傳導(dǎo)過程中TLR2 發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。TLR2 表達主要是在單核/巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞表面。TP侵入皮膚黏膜后其脂蛋白首先被巨噬細胞膜上 TLR2 識別,并在膜上CD14 分子的協(xié)同作用下，形成 TLR2-CD14受體復(fù)合物，將識別的信號從胞外轉(zhuǎn)入胞內(nèi)[18,19]。為探討CD14 在 TP 感染炎癥信號傳導(dǎo)中的作用, 本研究將CD14抗體預(yù)處理THP-1細胞后，發(fā)現(xiàn)其能抑制TNF-α、IL-1β和IL-8的產(chǎn)生，而抑制IL-1β和IL-8分泌的作用更明顯，從而可初步認為這3種脂肽刺激THP-1細胞發(fā)揮前炎癥活性的信號傳導(dǎo)需要CD14 的參與。

綜上所述，本研究初步證實TP15、TP17和TP47能夠誘導(dǎo)THP-1細胞產(chǎn)生細胞因子，這些細胞因子是引起梅毒免疫病理損傷的基礎(chǔ)，但是TP15和TP17對THP-1細胞的刺激能力不如TP47，初步認為兩者可能不是梅毒感染時引起固有免疫反應(yīng)的主要致病因子；同時研究發(fā)現(xiàn)，這3種脂肽是通過激活巨噬細胞膜表面CD14受體分子，活化下游信號通路，從而誘導(dǎo)細胞因子產(chǎn)生。另外，本研究采用根據(jù)TP膜脂蛋白N端合成的脂肽，不一定能完全真實反映TP天然膜脂蛋白的活性，因此需要進一步研究和證實。

【參 考 文 獻】

[1]傅志宜. 梅毒的流行、檢測與治療現(xiàn)狀(一) [J]. 實用皮膚病學(xué)雜志, 2009, 2(12):193-195.

[2]Ulevitch RJ, Tobias PS. Recognition of gram-negative bacteria and endotoxin by the innate immune system [J]. Curr Opin Immunol, 1999, 11(1):19-22.

[3]Brandt ME, Riley BS, Radolf JD, et al. Immunogenic integral membrane proteins of Borrelia burgdorferi are lipoproteins [J]. Infect Immun, 1990, 58(4):983-991.

[4]Kim LA, Khurana RN, Parikh JG, et al. Melanin-laden macrophages in the CSF to diagnose Vogt-Koyanagi-Harada simulating ocular syphilis [J]. Ocul Immunol Inflamm, 2008, 16(1):59-61.

[5]Fitzgerald TJ. Th1/Th2-like switch in syphilitic infection: is it detrimental [J]. Infect Immun, 1992, 60(9):3475-3479.

[6]McKevitt M, Patel K, Smajs D, et al. Systematic cloning of Treponema pallidum open reading frames for protein expression and antigen discovery [J]. Genome Res, 2003, 13(7):1665-1674.

[7]Castro R, Prieto ES, Santo I, et al. Evaluation of an enzyme immunoassay technique for detection of antibodies against Treponema pallidum [J]. J Clin Microbiol, 2003, 41(1):250-253.

[8]DeOgny L, Pramanik BC, Arndt LL, et al. Solid-phase synthesis of biologically active lipopeptides as analogs for spirochetal lipoproteins [J]. Pept Res, 1994, 7(2):91-97.

[9]Hauschildt S, Hoffmann P, Beuscher HU, et al. Activation of bone marrow-derived mouse macrophages by bacterial lipopeptide: cytokine production, phagocytosis and Ia expression [J]. Eur J Immunol, 1990, 20(1):63-68.

[10]Lafond RE, Lukehart SA. Biological basis for syphilis [J]. Clin Microbiol Rev, 2006, 19(1):29-49.

[11]Peeling RW, Hook EW. The pathogenesis of syphilis: the Great Mimicker revisited [J]. J Pathol, 2006, 208(2):224-232.

[12]Gordon S, Taylor PR. Monocyte and macrophage heterogeneity [J]. Nat Rev Immunol, 2005, 12(5):953-964.

[13]Crouse DT, English BK, Livingston L, et al. Genital mycoplasmas stimulate tumor necrosis factor-α and inducible nitric oxide synthase production from a murine macrophage cell line [J]. Pediatr Res, 1998, 44(5):785-790.

[14]Perni SC, Vardhana S, Korneeva I, et al. Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum in midtrimester amniotic fluid: association with amniotic fluid cytokine levels and pregnancy outcome [J]. Am J Obstet Gynecol, 2004, 191(4):1382-1386.

[15]Tominaga K, Higuchi K, Tsuno M, et al. Induction of signal transduction pathways in rat gastric epithelial cells stimulated with interleukin-1β [J]. Aliment Pharmacol Ther, 2000, 14(Suppl 1):101-108.

[16]Sellati TJ, Bouis DA, Kitchens RL, et al. Treponema pallidum and Borrelia burgdorferi lipoproteins and synthetic lipopeptides activate monocytic cells via a CD14-dependent pathway distinct from that used by lipopolysaccharide [J]. J Immunol, 1998, 160(11):5455-5464.

[17]劉雙全, 趙飛駿, 張秋桂, 等. 梅毒螺旋體Tp0751黏附蛋白的表達、純化及免疫活性研究 [J]. 中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志, 2009, 29(7):612-615.

[18]Radolf JD, Arndt LL, Akins DR, et al. Treponema pallidum and Borrelia Burgdorferi lipoproteins and synthetic lipopeptides activate monocytes/macrophages [J]. J Immunol, 1995, 154(6):2866-2877.

[19]Bouis DA, Popova TG, Takashima A, et al. Dendritic cells phagocytose and are activated by treponema pallidum [J]. Infect Immun, 2001, 69(1):518-528.

（本文編輯 耿建麗）