閆海成　竇長(zhǎng)武　田復(fù)明　妥少勇　王薇

【摘要】目的構(gòu)建針對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的高效沉默PTTG1的RNAi載體；探討PTTFG1 siRNA干擾質(zhì)粒對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U373增殖、侵襲性的影響。方法設(shè)計(jì)三對(duì)PTTG1基因干擾序列，合成能夠特異干擾PTTG1的siRNA，然后將其與pGenesil2載體連接，構(gòu)建pGenesil2-PTTG1 siRNA干擾載體，在脂質(zhì)體作用下將PTFG1 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞后，用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)PTTG1 mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化，通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTTG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果在膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞轉(zhuǎn)染3個(gè)不同的siRNA片段干擾PTTG1的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，PTFG1 siRNA1干擾質(zhì)粒對(duì)PTFG1表達(dá)的抑制作用最明顯[（0.47±0.12）vs（1.00±0.15），P<0.01]。轉(zhuǎn)染PTFGl siRNA質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373在48h和72h細(xì)胞增殖能力均顯著低于對(duì)照組。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示干擾PTTGl可明顯縮短U373細(xì)胞的遷移距離；Transwell小室結(jié)果顯示干擾PTTG1后U373的穿膜細(xì)胞百分率明顯下降[（58.00±8.72）%vs（36.3±7.76）%，P<0.05]。結(jié)論P(yáng)TTG1 siRNA干擾質(zhì)?？擅黠@抑制膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞PTTG1的表達(dá)，并可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移能力。

【關(guān)鍵詞】垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因；RNA干擾；膠質(zhì)瘤；侵襲

【中圖分類號(hào)】R739.4 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-0616（2015）21-09-05

腦膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)惡性腫瘤，目前以手術(shù)治療為主，輔以放療及化療等綜合治療，但是由于膠質(zhì)瘤的惡性程度高，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍正常腦組織無(wú)明顯分界，易于復(fù)發(fā)，并隨著復(fù)發(fā)次數(shù)的增加其惡性程度也會(huì)不斷增加。因此，臨床療效仍不理想。目前膠質(zhì)瘤研究的重要任務(wù)是研究與膠質(zhì)瘤惡性進(jìn)展相關(guān)的基因，為膠質(zhì)瘤的診斷和治療尋找新的途徑。垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因（PTTG）是1997年，Pei等在大鼠垂體腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)的，其中PTTG1是在MG63骨肉瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)能夠抑制分離酶的活性，使姐妹染色體分離受阻，增加使細(xì)胞突變機(jī)率，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PTTG1基因在大多數(shù)惡性腫瘤及內(nèi)分泌相關(guān)性腫瘤中均有較高表達(dá)，目前研究認(rèn)為PTTG1基因與抑制染色體分離密切相關(guān)，還參與了血管生成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起到重要作用。本課題組在前期研究中已經(jīng)證實(shí)PTTG1在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)較正常腦組織明顯增強(qiáng)，并與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)。在本研究中我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建高效沉默PTTG1的siRNA干擾質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373中，探討其對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲性的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U373（ATCC編號(hào)：HTB-17），第5～8代細(xì)胞用于做細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（購(gòu)于天根生化有限公司），質(zhì)粒Pgenesil 2（購(gòu)買于武漢晶賽生物工程技術(shù)公司），RT-PCR試劑盒，鼠抗人PTTG1單克隆抗體（購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U373用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO₂、飽和濕度。細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染PTTG1干擾質(zhì)粒的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，轉(zhuǎn)染非干擾質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照組，每種實(shí)驗(yàn)方法均選用同一批次細(xì)胞進(jìn)行。

1.2.2重組Pgenesil2 PTTG1 siRNA的構(gòu)建及鑒定

根據(jù)Genbank提供的PTTG1 cDNA序列（NM-004129），應(yīng)用Ambion在線設(shè)計(jì)軟件篩選出三條PITG靶基因序列，分別為PTTG-1：TGGGAGAqL3UAAGTIqEA；PTFG-2：GTCTGTAAAGAC CAAGGGA；PTTG-3：GCATFCTGTCGACCCTGGA，根據(jù)上述靶序列設(shè)計(jì)出三對(duì)PTTG1干擾序列。

pGenesil2質(zhì)粒經(jīng)BamH I和HindⅢ雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠回收大片段。將上述合成的寡核苷酸片段溶解于退火緩沖液（50μL），分別取正鏈（2μL）、反鏈（2μL）和退火緩沖液（16μL），混勻，94℃水浴，3min，自然冷卻至室溫。用去離子水（99μL）稀釋退火產(chǎn)物（1μL），4℃保存。取稀釋后退火寡核苷酸鏈（1μL），Pgenesil2質(zhì)粒載體（1μL），10×Ligase Buffer（1μL），加入T4連接酶（1μL），加入去離子水（6μL），22℃水浴，過(guò)夜。取DH5α（5μL），涂布于LB瓊脂平板上（含Kana抗性），置于37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。挑取3個(gè)單克隆菌落，接種于LB培養(yǎng)液（5mL，含Kana抗性）中，置于恒溫?fù)u床中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。用質(zhì)粒提試劑盒提取質(zhì)粒。經(jīng)Sal Ⅰ酶切鑒定：將提取的質(zhì)粒DNA（1μL），10×H Buffer（1μL），Sal Ⅰ（1μL），去離子水（7μL）混勻，37℃水浴反應(yīng)3h，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證產(chǎn)物，并將重組質(zhì)粒菌液送大連寶生物公司測(cè)序。

1.2.3PTTG1 siRNA干擾效果鑒定 為提高PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率降低細(xì)胞毒性，我們選用脂質(zhì)體方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體是磷脂分散在水中時(shí)形成的脂質(zhì)雙分子層，可以通過(guò)膜的融合及內(nèi)吞作用，將外源物質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。將膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1×10⁵/孔）中，次日，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%融合時(shí)用脂質(zhì)體2000作為轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，每孔中分別加入2μg質(zhì)粒、8μg脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和100μL0.01M PBS混勻，室溫放置15min后，用PBS洗滌2次，棄上清，每孔中加入900μL含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h提取RNA，72h后提取蛋白，用Western Blot檢測(cè)干擾效果。endprint

1.2.4MTT檢測(cè)PTTG1 siRNA對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力影響

將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔中細(xì)胞數(shù)為3×10³個(gè)，每孔加入100μL培養(yǎng)基，每種細(xì)胞重復(fù)5個(gè)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（僅加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞），37℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)后24、48、72h檢測(cè)各孔吸光度值（OD值），在檢測(cè)前每孔加入20μL的MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜（DMSO）150μL，室溫避光孵育10min，用酶標(biāo)儀570nm測(cè)定各孔吸光度值（OD值），繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組OD值一實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒組，收集2mL轉(zhuǎn)染PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒的細(xì)胞懸液接種于6孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層匯合，用移液器槍頭在培養(yǎng)板底部呈“一”劃痕，用PBS清洗，更換含1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液分別于劃痕后0、18和36h用顯微鏡觀察并照相，記錄最初劃痕區(qū)及不同遷移時(shí)間劃痕的距離。對(duì)照組：轉(zhuǎn)染PTTG1非干擾質(zhì)粒組起始質(zhì)粒為PTTG1非干擾質(zhì)粒，其他步驟同上。

1.2.6Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)分為兩組，實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染mGl siRNA干擾質(zhì)粒組，對(duì)照組：轉(zhuǎn)染PTrGl非干擾質(zhì)粒組。將聚碳酸濾膜（8μm）粘附于Transwell小室上方后，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠（1：3），加至Transwell上室，覆蓋整個(gè)聚碳酯膜，37℃，放置30min，使Matrigel聚合成膠。用0.25%胰蛋白酶消化各組細(xì)胞，PBS洗三次，重懸于含0.1%BSA的培養(yǎng)基中，取2×106/mL細(xì)胞懸液100μL加入上室，在下室內(nèi)加入500μL全培，放于37℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)24h。棄去上室中的培養(yǎng)液，并用生理鹽水棉簽緩慢檫去Matrigel膠，使用0.1%結(jié)晶紫染色，置于倒置顯微鏡下觀察，10×40倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中的細(xì)胞數(shù)目，每個(gè)標(biāo)本重復(fù)2次，本部分實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次，并以侵襲細(xì)胞占原細(xì)胞總數(shù)的百分比來(lái)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，若呈正態(tài)分布，兩組間數(shù)據(jù)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，若數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，用秩合檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PTTGl siRNA質(zhì)粒干擾效果鑒定

構(gòu)建的三個(gè)pGenesil2-PTTG-1干擾質(zhì)粒經(jīng)Sal I酶切電泳鑒定及測(cè)序證實(shí)序列正確，將上述質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U373細(xì)胞，48h后提取細(xì)胞總RNA，用RT-PCR方法檢測(cè)構(gòu)建的PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒抑制PTTG1表達(dá)的效果，結(jié)果圖1-A顯示，與轉(zhuǎn)染非干擾質(zhì)粒的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染3個(gè)干擾質(zhì)粒后PTTGl mRNA表達(dá)明顯減少，組間多重比較結(jié)果顯示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=12.784，P=0.002），其中PTTG1 siRNA1干擾質(zhì)粒對(duì)PTTG1表達(dá)的抑制作用最為明顯[（0.47±0.12）vs（1.00±0.15），t=4.679，P=0.001]。再取轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒72h后的細(xì)胞，用Western Blot方法進(jìn)一步驗(yàn)證三個(gè)PTTG1siRNA干擾質(zhì)粒對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PTTG1的干擾效率（圖1-B），結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致。上述結(jié)果均證實(shí)三個(gè)PTTG1 siRNA干擾質(zhì)?？梢种颇z質(zhì)瘤細(xì)胞U373中PTTG1的表達(dá)，其中PTTG1 siRNA1的抑制作用最為明顯。因此，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選用PTTG1siRNA 1干擾片段來(lái)進(jìn)行。

2.2PTTG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖能力的影響、侵襲和遷移能力的影響

MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果，轉(zhuǎn)染PTTG1siRNA質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373在48和72h細(xì)胞增殖能力均顯著低于對(duì)照組，結(jié)果提示PITG1 siRNA質(zhì)?？梢燥@著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373的增殖。見(jiàn)表1。

2.3PTTG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒于膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞48h后，再通過(guò)劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTTG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力的影響。見(jiàn)圖2-A。結(jié)果顯示，通過(guò)定性比較轉(zhuǎn)染PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒的U373細(xì)胞與轉(zhuǎn)染非干擾質(zhì)粒組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在劃痕后18h和36h的遷移距離明顯縮短，其中在36h改變化較為明顯，說(shuō)明PTTG1促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移，抑制PTTG1后可抑制細(xì)胞遷移。

采用Transwell小室檢測(cè)PTTG1對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力的影響，圖2-B中箭頭所指為穿過(guò)Martrigel膠的細(xì)胞，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒后U373的穿膜細(xì)胞百分率明顯減少（[58.00±8.72）%vs（36.3±7.76）%，t=-3.214，P=0.032]，這些結(jié)果表明PTTG1可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲，抑制PTTG1后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯降低。

3討論

膠質(zhì)瘤是一種預(yù)示著不良預(yù)后的實(shí)體腫瘤。其早期診斷困難，侵襲性強(qiáng)，即使在腫瘤診斷技術(shù)與治療方法日新月異的今天，全世界膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后依然沒(méi)有顯著的提高。腦膠質(zhì)瘤的形成是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過(guò)程，由于原癌基因被激活，抑癌基因失活，從而造成細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)異常、細(xì)胞的凋亡缺陷等，從而造成細(xì)胞增殖的失控，最終轉(zhuǎn)化為惡性。近年來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)了與腦膠質(zhì)瘤形成及進(jìn)展相關(guān)的原癌基因及抑癌基因，為膠質(zhì)瘤的診斷及治療提供了更為廣闊的基礎(chǔ)。

垂體瘤轉(zhuǎn)化基因1（pituitary tumor-transforminggene 1，PTTG1）編碼的蛋白最早在垂體瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，之后鑒定為保全素（securin），因其在細(xì)胞周期中調(diào)控有絲分裂姐妹染色單體的分離，又稱分離酶抑制蛋白。PTTG1是一種原癌基因，在很多細(xì)胞活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，比如有絲分裂、DNA損傷/修復(fù)、凋亡和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，以及器官發(fā)育與代謝過(guò)程中起到重要作用。大量證據(jù)表明，PTTG1和腫瘤發(fā)展、惡性轉(zhuǎn)移密切關(guān)系。除了血癌和星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤外，甲狀腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、胸腺癌、肝細(xì)胞癌（HCC）、肺癌和食管癌中的mG表達(dá)都有所增加。

研究發(fā)現(xiàn)體外PTTG過(guò)度表達(dá)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化及裸鼠的腫瘤形成，并與一些腫瘤高侵襲性相關(guān)，因此PTTG1已經(jīng)被證實(shí)是與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要標(biāo)記基因。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)PTTG1在膠質(zhì)瘤中表達(dá)量與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也支持上述推斷。在本研究中我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了PTTG1 siRNA干擾質(zhì)粒，可明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U373中PTTG1的表達(dá)，客觀證明了構(gòu)建的干擾載體有效，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供了有效措施。

Baldwin等研究發(fā)現(xiàn)，采用RNAi技術(shù)，可使U87MG細(xì)胞株中的PKC表達(dá)下調(diào)，并可明顯降低腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性與增殖侵襲性。本研究中MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PTTG1 siRNA質(zhì)粒的膠質(zhì)瘤U373細(xì)胞在48h和72h細(xì)胞增殖能力均顯著低于對(duì)照組，提示在PTTG1基因被干擾后，目的細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活的能力受到了明顯的抑制，細(xì)胞活力也產(chǎn)生了巨大的變化。進(jìn)一步的細(xì)胞遷移和Transwell實(shí)驗(yàn)也均證實(shí)PTTG1 siRNA通過(guò)降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞PTTG1表達(dá)來(lái)明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。最近研究證實(shí)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在結(jié)腸癌、乳腺癌及卵巢癌中通過(guò)降解基底膜的Ⅳ型膠原成分和胞外基質(zhì)，調(diào)節(jié)腫瘤新生血管的形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞之間以及宿主細(xì)胞之間的相互粘附、移行，參與了腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的過(guò)程，有學(xué)者在垂體腫瘤中研究發(fā)現(xiàn)PTTG1與MMP9存在較高表達(dá)，但兩者之間的表達(dá)關(guān)聯(lián)仍然存在較大爭(zhēng)論。另有研究表明，降低PTTG1蛋白在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的高表達(dá)，不僅可以有效的降低其侵襲性，而且可以提高惡性膠質(zhì)瘤患者的生存率并改善預(yù)后，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。上述結(jié)果提示PTTG1是與膠質(zhì)瘤增殖、侵襲相關(guān)的靶標(biāo)基因，但其促進(jìn)膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的具體作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究，RNA干擾技術(shù)為研究膠質(zhì)瘤的生物學(xué)活性及治療提供了新手段。endprint