• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    復發(fā)膠質(zhì)瘤組織中miRNA-200c的表達 及作用機制研究

    2020-06-08 15:22:58恒聰李鎮(zhèn)宇鄧敏峰曹志愷
    中國醫(yī)學創(chuàng)新 2020年12期
    關(guān)鍵詞:干性高級別級別

    恒聰 李鎮(zhèn)宇 鄧敏峰 曹志愷

    【摘要】 目的:探討各級別及復發(fā)膠質(zhì)瘤中miRNA-200c(miR-200c)的表達及可能機制。方法:收集本院收治的43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者腫瘤切除標本,按照組織學分級不同將43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者分為低級別膠質(zhì)瘤組15例、高級別膠質(zhì)瘤組22例、復發(fā)膠質(zhì)瘤組6例,另選取10例正常腦組織標本為對照組。使用RT-PCR檢測各級別初發(fā)膠質(zhì)瘤及復發(fā)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中miR-200c的表達水平,通過Western blotting檢測腫瘤干性指標(CD133、Nestin)及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)在各組織中的表達。結(jié)果:各組miR-200c表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組Nestin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸升高,E-cadherin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05);高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高(P<0.05),且復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論:miR-200c在復發(fā)及高級別膠質(zhì)瘤中表達下降,其缺失可能誘導EMT使腫瘤干性增加,可作為高級別及復發(fā)膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點。

    【關(guān)鍵詞】 miR-200c 復發(fā)膠質(zhì)瘤 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 膠質(zhì)瘤腫瘤干細胞

    [Abstract] Objective: To investigate the expression and possible mechanism of miRNA-200c (miR-200c) in different grades of glioma and recurrent glioma. Method: The tumor resection specimens of 43 patients with glioma were collected, according to the histological classification, 43 patients were divided into low-grade glioma group (15 cases), high-grade glioma group (22 cases) and recurrent glioma group (6 cases), another 10 normal brain tissues were selected as the control group. RT-PCR was used to detect the expression of miR-200c in primary and recurrent glioma, Western blotting was used to detect the expression of tumor dryness index (CD133, Nestin) and epithelial mesenchymal transition (EMT) markers (E-cadherin, N-cadherin, Vimentin) in various tissues. Result: The miR-200c expression level of each group decreased with the increase of glioma grade, the differences between the two groups were statistically significant (P<0.05). The Nestin expression level of each group increased with the increase of glioma grade, the E-cadherin expression level of each group decreased with the increase of glioma grade, the differences between the two groups were statistically significant (P<0.05). The expression level of CD133 in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in control group and low-grade glioma group (P<0.05). The expression levels of N-cadherin and Vimentin in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), and the expression levels of N-cadherin and Vimentin in the recurrent glioma group were significantly higher than those in the low-grade glioma group and the high-grade glioma group (P<0.05). Conclusion: The expression of miR-200c decreased in recurrent and high-grade glioma, and the absence of miR-200c may induce EMT to increase tumor dryness, which may be a potential target for the treatment of high-grade and recurrent glioma.

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,具有發(fā)病率、致死率高的特點,其中高級別膠質(zhì)瘤患者的平均生存期僅為12~15個月[1-2]。目前膠質(zhì)瘤復發(fā)的機制仍不明確,有學者認為目前的常規(guī)治療并未能有效地清除膠質(zhì)瘤腫瘤干細胞(glioma stem cells,GSCs),所以復發(fā)也就在所難免[3]。有研究證實,腫瘤干細胞和上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)之間有密切聯(lián)系[4-5],而MicroRNA(miR)-200c是調(diào)節(jié)腫瘤干細胞及腫瘤細胞EMT過程的重要分子[6]。盡管miR-200c在各類腫瘤中均有不同程度的改變,其是否參與膠質(zhì)瘤的復發(fā)仍需要進一步探討。該研究采用RT-PCR方法檢測miR-200c在各級別及復發(fā)膠質(zhì)瘤中的表達情況,并通過Western blotting分析EMT相關(guān)分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及腫瘤干性相關(guān)分子(NESTIN、CD133)在各組織樣本中表達情況,探討miR-200c在復發(fā)膠質(zhì)瘤發(fā)放發(fā)展中的作用,為復發(fā)膠質(zhì)瘤的診治提供前期基礎(chǔ)?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 標本來源及分組 收集2017年1月-2019年12月本院收治的43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者腫瘤切除標本,男28例、女15例;年齡<50歲24例、年齡≥50歲19例;腫瘤直徑<5 cm 16例、腫瘤直徑≥5 cm 27例;根據(jù)WHO 2007年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準進行組織學分級:初發(fā)患者中Ⅰ級7例、Ⅱ級8例、Ⅲ級13例、Ⅳ級9例,復發(fā)膠質(zhì)瘤為二次及多次手術(shù)患者6例(病理均為WHO Ⅳ級)。納入標準:所有初發(fā)患者術(shù)前均未進行放化療;所有患者術(shù)后均行同步放化療(同步放化療采用直線加速器放療,根據(jù)頭顱MRI定位,采用局部擴大放療,總劑量60 Gy,分30次,共6周),口服替莫唑胺75 ms/(m2·d),共42 d。排除標準:復發(fā)膠質(zhì)瘤術(shù)后未進行放化療及術(shù)后病理分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的不納入組。另選取同期10例正常腦組織標本為對照組,均取自同期因顱腦損傷或腦出血需行內(nèi)減壓術(shù)的患者,術(shù)后病理檢查證實均為正常腦組織。按照組織學分級不同將43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者分為低級別膠質(zhì)瘤組(WHO-Ⅰ/Ⅱ級)15例、高級別膠質(zhì)瘤組(WHO-Ⅲ/Ⅳ級)22例、復發(fā)膠質(zhì)瘤組(WHO-Ⅳ級)6例。該研究獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會同意及患者家屬簽字認可,操作符合臨床試驗倫理規(guī)范。

    1.2 RT-PCR法檢測各組miR-200c 常規(guī)Trizol試劑抽提總RNA,無酶水溶解沉淀。紫外分光光度計測定RNA提取液的A260及A280吸光度值,檢測RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應按轉(zhuǎn)錄miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海吉瑪生物技術(shù)有限公司)說明書進行。反應體系:5×RT緩沖液4 μL、1 μmol/L miRNA特異性RT引物1.2 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL、200 U/μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL、RNA 1 μg,用無酶水補至20 μL。反應條件:25 ℃ 30 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。采用SYBR方法,應用Biorad公司的定量PCR儀IQ5進行定量PCR反應,U6作為內(nèi)對照。反應體系:2×PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miRNA特異性PCR引物0.4 μL、RT產(chǎn)物1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、無酶水加至20 μL。反應條件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s,共40個循環(huán)。

    miR-200c的相對表達量通過公式2-△Ct計算,其中,△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值。

    1.3 Western blotting檢測各組相關(guān)分子表達情

    況 裂解液冰上裂解各組組織提取總蛋白,測定蛋白濃度,每孔上樣量為40 μg。按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明配置10%分離膠,電泳液,140 V電壓電泳1.5 h。按分子量切取相應目的條帶,280 MA濕轉(zhuǎn)80 min。封閉液(用1×TBST稀釋的5% BSA)封閉1 h。加入兔抗人Nestin(1︰1 000)、CD133(1︰1 000)、E-cadherin(1︰1 000)、N-cadherin(1︰1 000),鼠抗人Vimentin(1︰100)、β-Actin一抗(1︰500),雜交袋4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次,5 min/次。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗(1︰10 000),室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次,5 min/次。ECL化學發(fā)光法曝光顯影。以image J分析條帶的灰度值。所需抗體均采購自Abcam公司。

    1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnetts T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組一般資料比較 各組一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

    2.2 各組miR-200c表達比較 檢測結(jié)果顯示,對照組、低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組miR-200c表達水平分別為(12.327±1.737)、(7.998±0.978)、(1.720±0.315)、(1.279±0.301),組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=371.890,P=0.000),且各組miR-200c表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

    2.3 各組腫瘤干性指標表達比較 Werstern blotting法檢測結(jié)果顯示,各組間CD133、Nestin表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,且復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平較高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組Nestin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸升高,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

    2.4 各組EMT相關(guān)分子表達比較 各組N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高(P<0.05),且復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05);各組E-cadherin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

    3 討論

    膠質(zhì)瘤是成人常見的顱內(nèi)腫瘤,其中惡性程度高的膠質(zhì)瘤侵襲性強,手術(shù)難以完全切除,術(shù)后復發(fā)率高,預后差[7]。而手術(shù)后放、化療等序貫治療還是難以避免膠質(zhì)瘤的復發(fā),這和腫瘤干細胞的存在有一定的關(guān)系。腫瘤干細胞學說認為腫瘤組織或者腫瘤轉(zhuǎn)移灶中存在極少且具有無限自我更新能力并可導致腫瘤發(fā)生的細胞-腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem like cells,CSLCs)[8]。這類細胞具有成體干細胞的某些功能特征,包括自我增殖和多向分化的能力,稱為“干性(stemness)”[9]。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞在放化療抵抗和腫瘤復發(fā)過程中起關(guān)鍵作用[10],而目前的常規(guī)治療可能并未能有效地清除這些細胞,所以復發(fā)也就在所難免[3]。因此深入探討腫瘤干性與復發(fā)膠質(zhì)瘤的分子機制尤為重要。

    miR為在真核細胞生物體中廣泛存在的非編碼小分子單鏈RNA,可以參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,并在其侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起促進或抑制作用。因此通過檢測各級別膠質(zhì)瘤組織中miR表達情況,可對其預后的判斷提供重要依據(jù)。有研究表明miR-200家族成員(miR-200s)在晚期癌癥中經(jīng)常被沉默。在膠質(zhì)瘤中同樣可見miR-200b的低表達[11]。文獻[12]報道,miR-200c在人乳腺腫瘤干細胞及非致瘤癌細胞中存在差異性表達,可通過調(diào)節(jié)干細胞因子BMI1,抑制正常乳腺干細胞分化為乳腺小管,也可以抑制乳腺癌干細胞的成瘤能力。miR-200c下調(diào)在乳腺癌細胞中表達腫瘤干細胞標志物,重新表達miR-200可逆轉(zhuǎn)腫瘤標志物的特點[13]。腫瘤標志物表型的主要特點(無黏附力和增加細胞活力的能力)在目前的研究中都被確定為miR-200c的直接調(diào)控[14]。本研究結(jié)果顯示,各組miR-200c表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示miR-200c在正常腦組織中的表達情況明顯高于膠質(zhì)瘤組織,且miR-200c的表達情況與膠質(zhì)瘤的級別呈負相關(guān)趨勢,特別是在復發(fā)膠質(zhì)瘤中其表達經(jīng)常被沉默。說明了在生長活躍、惡性程度高的膠質(zhì)瘤中miR-200c水平明顯下降。

    另一方面,miR不僅能參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,并對正常胚胎干細胞的自我更新能力以及細胞分化能力起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前越來越多的研究表明,EMT參與腫瘤的侵襲及遷移并與腫瘤細胞的干細胞特征密切相關(guān)。EMT通過改變腫瘤的微環(huán)境使腫瘤細胞獲得干細胞特性[15-18],并在腫瘤轉(zhuǎn)移、治療抵抗和再復發(fā)中起關(guān)鍵作用[4-5]。同樣miR-200家族成員(miR-200s)亦參與了EMT過程。miR-200抑制EMT,上皮細胞獲得遷移、侵襲和間質(zhì)細胞抗凋亡的能力。筆者研究了miR-200c是否調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)EMT過程從而通過影響腫瘤干性調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展及復發(fā)。研究發(fā)現(xiàn),在EMT的過程中伴隨著上皮標記分子E-cadherin的下調(diào)和間充質(zhì)標記分子N-cadherin的上調(diào)。本研究檢測EMT相關(guān)分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及腫瘤干性相關(guān)分子(NESTIN、CD133)在各組織樣本中表達情況,結(jié)果顯示,高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,且復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平較高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組Nestin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸升高,E-cadherin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高(P<0.05),且復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果與EMT的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)一致,且與本研究中腫瘤干性指標及miR-200c表達趨勢相一致,且Siebzehnrubl等[19]指出在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中可出現(xiàn)N-cadherin的明顯升高。上述結(jié)果提示,復發(fā)及高級別膠質(zhì)瘤Vimentin表達明顯增高、E-cadherin表達明顯減少,的確有EMT的發(fā)生;但在低級別膠質(zhì)瘤中,相比正常組織,EMT標記分子變化不明顯,表明在低級別膠質(zhì)瘤中EMT不是其侵襲、遷移的主要特征。

    綜上所述,復發(fā)及高級別膠質(zhì)瘤比起正常組織及低級別膠質(zhì)瘤,腫瘤細胞干性明顯增強,并有明確的EMT發(fā)生,且miR-200c表達水平也同各分子表達呈線性相關(guān)趨勢。證實了miR-200c參與調(diào)控了復發(fā)及惡性膠質(zhì)瘤EMT發(fā)生,并調(diào)控了其腫瘤細胞的干性,這三者緊密聯(lián)系,可能是膠質(zhì)瘤復發(fā)的重要原因之一。miR-200c一方面可以調(diào)控EMT發(fā)生,另一方面調(diào)控腫瘤細胞的干性,可以認為是EMT和腫瘤干細胞的樞紐調(diào)控分子。但對于其中調(diào)控的分子機制仍有待進一步的研究,從而尋找一條治療膠質(zhì)瘤的新道路。

    參考文獻

    [1] Weller M,Van Den Bent M,Tonn J C,et al.European Association for Neuro-Oncology(EANO) guideline on the diagnosis and treatment of adult astrocytic and oligodendroglial gliomas[J].Lancet Oncol,2017,18(6):e315-e329.

    [2] Omum A,DeAngelis L M.Glioblastoma and other malignant gliomas:a clinical review[J].JAMA,2013,310(17):1842-1850.

    [3] Blanco E,Shen H,F(xiàn)errari M.Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery[J].Nat Biotechnol,2015,33(9):941-951.

    [4] Zhang Y,Weinberg R A.Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer:complexity and opportunities[J].Front Med,2018,12(4):361-373.

    [5] Ouanouki A,Lamy S,Annabi B.Periostin,a signal transduction intermediate in TGF-β-induced EMT in U-87MG human glioblastoma cells,and its inhibition by anthocyanidins[J].Oncotarget,2018,9(31):22023-22037.

    [6] Krebs A M,Mitschke J,Lasierra Losada M,et al.The EMT-activator Zeb1 is a key factor for cell plasticity and promotes metastasis in pancreatic cancer[J].Nat Cell Biol,2017,19(5):518-529.

    [7] Ponnampalam S N,Kamaluddin N R,Zakaria Z,et al.A blood-based gene expression and signaling pathway analysis to differentiate between high and low grade gliomas[J].Oncol Rep,2017,37(1):10-22.

    [8] Brooks M D,Burness M L,Wicha M S.Therapeutic implications of cellular heterogeneity and plasticity in breast cancer[J].Cell Stem Cell,2015,17(3):260-271.

    [9] Ciardiello C,Leone A,Budillon A.The crosstalk between cancer stem cells and microenvironment is critical for solid tumor progression:The significant contribution of extracellular vesicles[J].Stem Cells Int,2018,2018:6392198.

    [10] Hale J S,Sinyuk M,Rich J N,et al.Decoding the cancer stem cell hypothesis in glioblastoma[J].CNS Oncol,2013,2(4):319-330.

    [11] Guo E,Wang Z,Wang S.MiR-200c and miR-141 inhibit ZEB1 synergistically and suppress glioma cell growth and migration[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(16):3385-3391.

    [12] Nieto M A,Huang R Y J,Jackson R A,et al.EMT:2016[J].Cell,2016,166(1):21-45.

    [13] Michalak E M,Burr M L,Bannister A J,et al.The roles of DNA,RNA and histone methylation in ageing and cancer[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2019,20(1):573-589.

    [14] Humphries B,Yang C.The microRNA-200 family:small molecules with novel roles in cancer development,progression and therapy[J].Oncotarget,2015,6(9):6472-6498.

    [15] Fischer K R,Durrans A,Lee S,et al.Epithelial-to-mesenchymal transition is not required for lung metastasis but contributes to chemoresistance[J].Nature,2015,527(7579):472-476.

    [16] Shibue T,Weinberg R A.EMT,CSCs,and drug resistance:the mechanistic link and clinical implications[J].Nat Rev Clin Oncol,2017,14(10)611-629.

    [17] Ahmed N,Abubaker K,F(xiàn)indlay J,et al.Epithelial mesenchymal transition and cancer stem cell-like phenotypes facilitate chemoresistance in recurrent ovarian cancer[J].Curt Cancer Drug Targets,2010,10(3):268-278.

    [18] Jiao F,Hu H,Han T,et al.Long noncoding RNA MALAT-1 enhances stem cell-like phenotypes in pancreatic cancer cells[J].Int J Mol Sci,2015,16(4):6677-6693.

    [19] Siebzehnrubl F A,Silver D J,Tugertimur B,et al.The ZEB1 pathway links glioblastoma initiation,invasion and chemoresistance[J].EMBO Mol Med,2013,5(8):1196-1212.

    (收稿日期:2020-03-05) (本文編輯:董悅)

    猜你喜歡
    干性高級別級別
    成人高級別腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復發(fā)相關(guān)因素分析
    肺原發(fā)未分化高級別多形性肉瘤1例
    薯蕷皂苷元調(diào)控Nrf2信號通道干預大鼠干性AMD氧化應激機制的研究
    痘痘分級別,輕重不一樣
    高級別管線鋼X80的生產(chǎn)實踐
    山東冶金(2019年2期)2019-05-11 09:12:00
    邁向UHD HDR的“水晶” 十萬元級別的SIM2 CRYSTAL4 UHD
    新年導購手冊之兩萬元以下級別好物推薦
    夏季頻發(fā)溺水事件,“干性溺水”是怎么回事
    方圓(2017年12期)2017-07-17 17:48:12
    你是什么級別的
    中學生(2017年13期)2017-06-15 12:57:48
    夏季游泳要提防“干性溺水”
    国产精品 欧美亚洲| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产黄色免费在线视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 老司机影院毛片| 好男人视频免费观看在线| 在线观看免费日韩欧美大片| 51午夜福利影视在线观看| 在线看a的网站| 看免费成人av毛片| 午夜福利,免费看| 99国产综合亚洲精品| 国产精品.久久久| 新久久久久国产一级毛片| 高清欧美精品videossex| 人人澡人人妻人| 夫妻午夜视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲一区中文字幕在线| 亚洲国产欧美网| 欧美中文综合在线视频| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品aⅴ在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲av中文av极速乱| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲av国产av综合av卡| 久久人妻熟女aⅴ| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品国产一区二区精华液| 日本一区二区免费在线视频| av.在线天堂| 国产成人一区二区在线| 91成人精品电影| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产 一区精品| 欧美激情高清一区二区三区 | 中国国产av一级| 丰满迷人的少妇在线观看| 成人影院久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 久久久久精品久久久久真实原创| 91国产中文字幕| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲欧洲国产日韩| 午夜91福利影院| 999久久久国产精品视频| 人妻一区二区av| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 欧美日韩av久久| 国产xxxxx性猛交| 久久女婷五月综合色啪小说| 极品人妻少妇av视频| 久久韩国三级中文字幕| tube8黄色片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 街头女战士在线观看网站| 精品一区在线观看国产| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 欧美黑人精品巨大| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 看非洲黑人一级黄片| 国产1区2区3区精品| 妹子高潮喷水视频| 精品酒店卫生间| 少妇被粗大猛烈的视频| 99九九在线精品视频| 999久久久国产精品视频| www.av在线官网国产| 观看av在线不卡| xxxhd国产人妻xxx| 老汉色∧v一级毛片| 99国产精品免费福利视频| 1024视频免费在线观看| 色视频在线一区二区三区| 亚洲精品国产区一区二| 午夜福利免费观看在线| 亚洲av男天堂| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 成人黄色视频免费在线看| 日本av手机在线免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 在线观看三级黄色| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜免费男女啪啪视频观看| 制服诱惑二区| 国产免费一区二区三区四区乱码| av在线老鸭窝| 这个男人来自地球电影免费观看 | 性高湖久久久久久久久免费观看| 中国三级夫妇交换| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产精品国产av在线观看| 亚洲精品视频女| 久久久久人妻精品一区果冻| 999久久久国产精品视频| 蜜桃在线观看..| 国产毛片在线视频| 少妇被粗大的猛进出69影院| 两个人免费观看高清视频| 亚洲成人av在线免费| 91国产中文字幕| 在线观看免费午夜福利视频| 在线观看免费午夜福利视频| 七月丁香在线播放| 制服诱惑二区| 国产97色在线日韩免费| 久久久久国产一级毛片高清牌| av一本久久久久| 99九九在线精品视频| 悠悠久久av| 丁香六月天网| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 女性生殖器流出的白浆| 日韩av不卡免费在线播放| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 最黄视频免费看| 男女边吃奶边做爰视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 满18在线观看网站| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 三上悠亚av全集在线观看| 国产在线免费精品| xxx大片免费视频| av女优亚洲男人天堂| 久久毛片免费看一区二区三区| 大香蕉久久成人网| 久久精品国产综合久久久| av在线老鸭窝| 日本av免费视频播放| 99久久综合免费| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 天美传媒精品一区二区| 国产成人系列免费观看| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲国产精品999| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 老司机深夜福利视频在线观看 | 伊人久久国产一区二区| 欧美精品一区二区大全| 一二三四中文在线观看免费高清| 男人添女人高潮全过程视频| 日韩精品有码人妻一区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免| 七月丁香在线播放| 国产一级毛片在线| 成人毛片60女人毛片免费| 久久综合国产亚洲精品| 丝袜喷水一区| 欧美精品一区二区免费开放| 在现免费观看毛片| 黄色视频不卡| 成人国语在线视频| 亚洲精品第二区| 国产在线免费精品| 久久久久精品国产欧美久久久 | 一二三四中文在线观看免费高清| 赤兔流量卡办理| 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美av亚洲av综合av国产av | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久免费观看电影| 久久 成人 亚洲| 午夜影院在线不卡| 少妇被粗大猛烈的视频| 曰老女人黄片| 午夜福利在线免费观看网站| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 涩涩av久久男人的天堂| 一级片免费观看大全| 天堂8中文在线网| 新久久久久国产一级毛片| 老鸭窝网址在线观看| 国产成人av激情在线播放| 精品人妻一区二区三区麻豆| 中文欧美无线码| 国产在视频线精品| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲成国产人片在线观看| 午夜激情av网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 精品一区在线观看国产| 国产免费又黄又爽又色| 午夜av观看不卡| 亚洲综合精品二区| 国产探花极品一区二区| 丰满乱子伦码专区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲成人手机| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99香蕉大伊视频| 无限看片的www在线观看| 国产午夜精品一二区理论片| 国产成人免费观看mmmm| 秋霞在线观看毛片| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久热在线av| 成年动漫av网址| 超色免费av| av电影中文网址| 亚洲欧美成人精品一区二区| 操美女的视频在线观看| 久久久久久久国产电影| 国产精品国产三级专区第一集| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 99热网站在线观看| 婷婷色av中文字幕| 母亲3免费完整高清在线观看| 久久青草综合色| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲欧美清纯卡通| 性高湖久久久久久久久免费观看| 成人影院久久| 一区福利在线观看| 操出白浆在线播放| 国产 精品1| 成人亚洲精品一区在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 秋霞伦理黄片| 各种免费的搞黄视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久亚洲精品成人影院| 丝袜美足系列| 十八禁网站网址无遮挡| 青春草亚洲视频在线观看| 在线观看人妻少妇| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产一区二区三区综合在线观看| 9色porny在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 女人精品久久久久毛片| 男人舔女人的私密视频| 欧美精品一区二区免费开放| 国产 精品1| 丝袜美腿诱惑在线| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 99热国产这里只有精品6| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费观看人在逋| 中文字幕av电影在线播放| 人妻 亚洲 视频| 极品人妻少妇av视频| 九色亚洲精品在线播放| 久久婷婷青草| 国产男女超爽视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看 | 在线观看一区二区三区激情| 欧美在线一区亚洲| 日本av手机在线免费观看| 黑人猛操日本美女一级片| 热re99久久精品国产66热6| 欧美激情高清一区二区三区 | 国产成人精品福利久久| 2018国产大陆天天弄谢| 自线自在国产av| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| e午夜精品久久久久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 大话2 男鬼变身卡| 久久国产亚洲av麻豆专区| 午夜福利一区二区在线看| 99热网站在线观看| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久久久久久国产电影| av有码第一页| 国产成人91sexporn| 日本欧美国产在线视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 99久久99久久久精品蜜桃| 少妇精品久久久久久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 天堂8中文在线网| av在线app专区| 国产成人精品无人区| xxxhd国产人妻xxx| 男人舔女人的私密视频| 国产 一区精品| 亚洲欧美激情在线| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品99久久99久久久不卡 | 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线看a的网站| 美国免费a级毛片| 国产精品.久久久| www.熟女人妻精品国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费不卡黄色视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 午夜av观看不卡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 欧美黑人精品巨大| 日韩中文字幕视频在线看片| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美日韩一级在线毛片| 久久久久久人人人人人| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产成人欧美| 街头女战士在线观看网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 午夜福利视频精品| 波野结衣二区三区在线| 一级毛片我不卡| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日日摸夜夜添夜夜爱| 男女床上黄色一级片免费看| 日本爱情动作片www.在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 国产精品 欧美亚洲| 日韩视频在线欧美| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲成人免费av在线播放| 日本vs欧美在线观看视频| 久久精品国产a三级三级三级| 视频区图区小说| 三上悠亚av全集在线观看| 免费观看a级毛片全部| 婷婷色av中文字幕| 欧美日韩一级在线毛片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲av男天堂| 国产日韩欧美在线精品| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久久精品免费免费高清| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 在线观看一区二区三区激情| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩电影二区| 国产精品 欧美亚洲| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 国产片内射在线| 日韩电影二区| 欧美精品av麻豆av| 免费在线观看完整版高清| 在线观看国产h片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 午夜免费鲁丝| 啦啦啦 在线观看视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 看十八女毛片水多多多| av电影中文网址| 中文字幕人妻丝袜制服| 曰老女人黄片| 国产精品国产三级专区第一集| 国产乱来视频区| 国产精品成人在线| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产av新网站| 国产成人系列免费观看| 国产精品三级大全| 国产伦理片在线播放av一区| 国产99久久九九免费精品| 九草在线视频观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩大码丰满熟妇| 婷婷成人精品国产| 免费观看a级毛片全部| 中文字幕制服av| 日韩伦理黄色片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成人国产av品久久久| av.在线天堂| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 一级,二级,三级黄色视频| 国产亚洲av高清不卡| 青草久久国产| 亚洲国产成人一精品久久久| av片东京热男人的天堂| 日韩精品免费视频一区二区三区| 中国国产av一级| 国产探花极品一区二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产精品一区二区在线观看99| 最近中文字幕高清免费大全6| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 免费看a级黄色片| tocl精华| 中文亚洲av片在线观看爽| av视频在线观看入口| netflix在线观看网站| 99国产综合亚洲精品| 天天一区二区日本电影三级 | 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲欧美激情综合另类| 搡老岳熟女国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 中文字幕久久专区| 国产精品av久久久久免费| 又黄又粗又硬又大视频| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美成人午夜精品| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最新在线观看一区二区三区| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲国产欧美网| 免费观看人在逋| 老司机在亚洲福利影院| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 免费不卡黄色视频| 在线观看免费视频网站a站| 91大片在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 中文字幕高清在线视频| 日本免费a在线| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 色哟哟哟哟哟哟| 精品无人区乱码1区二区| 丁香欧美五月| 最近最新中文字幕大全电影3 | 高清黄色对白视频在线免费看| 久热爱精品视频在线9| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 成人三级做爰电影| 深夜精品福利| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产成人精品无人区| 午夜两性在线视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 一级a爱片免费观看的视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 午夜久久久在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产极品粉嫩免费观看在线| 999久久久精品免费观看国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| АⅤ资源中文在线天堂| 级片在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 最新在线观看一区二区三区| 韩国精品一区二区三区| 一区在线观看完整版| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 人成视频在线观看免费观看| 欧美乱色亚洲激情| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲av美国av| 制服人妻中文乱码| 他把我摸到了高潮在线观看| 国产精品永久免费网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 日本a在线网址| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 欧美日韩一级在线毛片| 欧美在线黄色| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久中文字幕人妻熟女| av免费在线观看网站| 国产av又大| 91成人精品电影| 国产av一区在线观看免费| 黄色视频不卡| 色老头精品视频在线观看| 成年人黄色毛片网站| 97碰自拍视频| 久久伊人香网站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 欧美精品啪啪一区二区三区| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产三级在线视频| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产野战对白在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 女警被强在线播放| 国产主播在线观看一区二区| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品免费久久久久久久清纯| 身体一侧抽搐| 少妇的丰满在线观看| 午夜福利,免费看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 色精品久久人妻99蜜桃| 波多野结衣高清无吗| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久久久久午夜电影| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 99热只有精品国产| 无限看片的www在线观看| 午夜福利视频1000在线观看 | 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品日韩av在线免费观看 | 国产欧美日韩一区二区精品| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲 欧美一区二区三区| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲欧美激情在线| 女人精品久久久久毛片| 99热只有精品国产| 欧美性长视频在线观看| 午夜精品在线福利| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 丁香六月欧美| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品电影一区二区在线| 亚洲男人的天堂狠狠| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 日本欧美视频一区| 国产精品电影一区二区三区| 国产成人精品无人区| 老熟妇仑乱视频hdxx| 成人亚洲精品av一区二区| 美女高潮到喷水免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 麻豆国产av国片精品| 国产不卡一卡二| 窝窝影院91人妻| 国产精品 国内视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| www.熟女人妻精品国产| 久久中文字幕人妻熟女| 亚洲一区二区三区色噜噜| 午夜福利成人在线免费观看| 成人免费观看视频高清| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲成国产人片在线观看| 长腿黑丝高跟| 日韩精品中文字幕看吧| 美女 人体艺术 gogo| 宅男免费午夜| 亚洲最大成人中文| 69精品国产乱码久久久| 男女下面进入的视频免费午夜 | av免费在线观看网站| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 日本一区二区免费在线视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 国产免费男女视频| 波多野结衣一区麻豆| 欧美黑人精品巨大| 精品久久久精品久久久| 99在线视频只有这里精品首页| 国产主播在线观看一区二区| 在线观看舔阴道视频| 国产精华一区二区三区| 在线视频色国产色| 丁香六月欧美| 高清毛片免费观看视频网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲五月婷婷丁香| 久久狼人影院| 在线观看舔阴道视频| 久9热在线精品视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| av电影中文网址| 中文字幕人妻熟女乱码| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 色综合站精品国产| 女同久久另类99精品国产91| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 香蕉国产在线看| 国产主播在线观看一区二区| av电影中文网址| 欧美日韩一级在线毛片| 国产私拍福利视频在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| aaaaa片日本免费| 欧美黑人欧美精品刺激| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美丝袜亚洲另类 | 免费无遮挡裸体视频| 国产亚洲欧美98| 久久香蕉国产精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产亚洲欧美精品永久| av在线天堂中文字幕|