• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    復發(fā)膠質(zhì)瘤組織中miRNA-200c的表達 及作用機制研究

    2020-06-08 15:22:58恒聰李鎮(zhèn)宇鄧敏峰曹志愷
    中國醫(yī)學創(chuàng)新 2020年12期
    關(guān)鍵詞:干性高級別級別

    恒聰 李鎮(zhèn)宇 鄧敏峰 曹志愷

    【摘要】 目的:探討各級別及復發(fā)膠質(zhì)瘤中miRNA-200c(miR-200c)的表達及可能機制。方法:收集本院收治的43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者腫瘤切除標本,按照組織學分級不同將43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者分為低級別膠質(zhì)瘤組15例、高級別膠質(zhì)瘤組22例、復發(fā)膠質(zhì)瘤組6例,另選取10例正常腦組織標本為對照組。使用RT-PCR檢測各級別初發(fā)膠質(zhì)瘤及復發(fā)膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中miR-200c的表達水平,通過Western blotting檢測腫瘤干性指標(CD133、Nestin)及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)在各組織中的表達。結(jié)果:各組miR-200c表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組Nestin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸升高,E-cadherin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05);高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高(P<0.05),且復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05)。結(jié)論:miR-200c在復發(fā)及高級別膠質(zhì)瘤中表達下降,其缺失可能誘導EMT使腫瘤干性增加,可作為高級別及復發(fā)膠質(zhì)瘤治療的潛在靶點。

    【關(guān)鍵詞】 miR-200c 復發(fā)膠質(zhì)瘤 上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 膠質(zhì)瘤腫瘤干細胞

    [Abstract] Objective: To investigate the expression and possible mechanism of miRNA-200c (miR-200c) in different grades of glioma and recurrent glioma. Method: The tumor resection specimens of 43 patients with glioma were collected, according to the histological classification, 43 patients were divided into low-grade glioma group (15 cases), high-grade glioma group (22 cases) and recurrent glioma group (6 cases), another 10 normal brain tissues were selected as the control group. RT-PCR was used to detect the expression of miR-200c in primary and recurrent glioma, Western blotting was used to detect the expression of tumor dryness index (CD133, Nestin) and epithelial mesenchymal transition (EMT) markers (E-cadherin, N-cadherin, Vimentin) in various tissues. Result: The miR-200c expression level of each group decreased with the increase of glioma grade, the differences between the two groups were statistically significant (P<0.05). The Nestin expression level of each group increased with the increase of glioma grade, the E-cadherin expression level of each group decreased with the increase of glioma grade, the differences between the two groups were statistically significant (P<0.05). The expression level of CD133 in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in control group and low-grade glioma group (P<0.05). The expression levels of N-cadherin and Vimentin in high-grade glioma group and recurrent glioma group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), and the expression levels of N-cadherin and Vimentin in the recurrent glioma group were significantly higher than those in the low-grade glioma group and the high-grade glioma group (P<0.05). Conclusion: The expression of miR-200c decreased in recurrent and high-grade glioma, and the absence of miR-200c may induce EMT to increase tumor dryness, which may be a potential target for the treatment of high-grade and recurrent glioma.

    神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤,具有發(fā)病率、致死率高的特點,其中高級別膠質(zhì)瘤患者的平均生存期僅為12~15個月[1-2]。目前膠質(zhì)瘤復發(fā)的機制仍不明確,有學者認為目前的常規(guī)治療并未能有效地清除膠質(zhì)瘤腫瘤干細胞(glioma stem cells,GSCs),所以復發(fā)也就在所難免[3]。有研究證實,腫瘤干細胞和上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)之間有密切聯(lián)系[4-5],而MicroRNA(miR)-200c是調(diào)節(jié)腫瘤干細胞及腫瘤細胞EMT過程的重要分子[6]。盡管miR-200c在各類腫瘤中均有不同程度的改變,其是否參與膠質(zhì)瘤的復發(fā)仍需要進一步探討。該研究采用RT-PCR方法檢測miR-200c在各級別及復發(fā)膠質(zhì)瘤中的表達情況,并通過Western blotting分析EMT相關(guān)分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及腫瘤干性相關(guān)分子(NESTIN、CD133)在各組織樣本中表達情況,探討miR-200c在復發(fā)膠質(zhì)瘤發(fā)放發(fā)展中的作用,為復發(fā)膠質(zhì)瘤的診治提供前期基礎(chǔ)?,F(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 標本來源及分組 收集2017年1月-2019年12月本院收治的43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者腫瘤切除標本,男28例、女15例;年齡<50歲24例、年齡≥50歲19例;腫瘤直徑<5 cm 16例、腫瘤直徑≥5 cm 27例;根據(jù)WHO 2007年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準進行組織學分級:初發(fā)患者中Ⅰ級7例、Ⅱ級8例、Ⅲ級13例、Ⅳ級9例,復發(fā)膠質(zhì)瘤為二次及多次手術(shù)患者6例(病理均為WHO Ⅳ級)。納入標準:所有初發(fā)患者術(shù)前均未進行放化療;所有患者術(shù)后均行同步放化療(同步放化療采用直線加速器放療,根據(jù)頭顱MRI定位,采用局部擴大放療,總劑量60 Gy,分30次,共6周),口服替莫唑胺75 ms/(m2·d),共42 d。排除標準:復發(fā)膠質(zhì)瘤術(shù)后未進行放化療及術(shù)后病理分級為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級的不納入組。另選取同期10例正常腦組織標本為對照組,均取自同期因顱腦損傷或腦出血需行內(nèi)減壓術(shù)的患者,術(shù)后病理檢查證實均為正常腦組織。按照組織學分級不同將43例膠質(zhì)瘤手術(shù)患者分為低級別膠質(zhì)瘤組(WHO-Ⅰ/Ⅱ級)15例、高級別膠質(zhì)瘤組(WHO-Ⅲ/Ⅳ級)22例、復發(fā)膠質(zhì)瘤組(WHO-Ⅳ級)6例。該研究獲得廣州市第一人民醫(yī)院倫理委員會同意及患者家屬簽字認可,操作符合臨床試驗倫理規(guī)范。

    1.2 RT-PCR法檢測各組miR-200c 常規(guī)Trizol試劑抽提總RNA,無酶水溶解沉淀。紫外分光光度計測定RNA提取液的A260及A280吸光度值,檢測RNA純度和濃度。逆轉(zhuǎn)錄反應按轉(zhuǎn)錄miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海吉瑪生物技術(shù)有限公司)說明書進行。反應體系:5×RT緩沖液4 μL、1 μmol/L miRNA特異性RT引物1.2 μL、25 mmol/L鎂離子3 μL、10 mmol/L dNTP 0.75 μL、40 U/μL RNA酶抑制劑0.25 μL、200 U/μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶0.2 μL、RNA 1 μg,用無酶水補至20 μL。反應條件:25 ℃ 30 min,42 ℃ 30 min,85 ℃ 5 min,4 ℃保存。采用SYBR方法,應用Biorad公司的定量PCR儀IQ5進行定量PCR反應,U6作為內(nèi)對照。反應體系:2×PCR緩沖液10 μL、5 μmol/L miRNA特異性PCR引物0.4 μL、RT產(chǎn)物1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、無酶水加至20 μL。反應條件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 12 s、62 ℃ 40 s,共40個循環(huán)。

    miR-200c的相對表達量通過公式2-△Ct計算,其中,△Ct=miR-200c平均Ct值-U6平均Ct值。

    1.3 Western blotting檢測各組相關(guān)分子表達情

    況 裂解液冰上裂解各組組織提取總蛋白,測定蛋白濃度,每孔上樣量為40 μg。按SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明配置10%分離膠,電泳液,140 V電壓電泳1.5 h。按分子量切取相應目的條帶,280 MA濕轉(zhuǎn)80 min。封閉液(用1×TBST稀釋的5% BSA)封閉1 h。加入兔抗人Nestin(1︰1 000)、CD133(1︰1 000)、E-cadherin(1︰1 000)、N-cadherin(1︰1 000),鼠抗人Vimentin(1︰100)、β-Actin一抗(1︰500),雜交袋4 ℃孵育過夜。1×TBST洗膜3次,5 min/次。加入山羊抗兔、山羊抗鼠IgG二抗(1︰10 000),室溫孵育1 h。1×TBST洗膜3次,5 min/次。ECL化學發(fā)光法曝光顯影。以image J分析條帶的灰度值。所需抗體均采購自Abcam公司。

    1.4 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,計量資料用(x±s)表示,多組比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnetts T3檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組一般資料比較 各組一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性,見表1。

    2.2 各組miR-200c表達比較 檢測結(jié)果顯示,對照組、低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組miR-200c表達水平分別為(12.327±1.737)、(7.998±0.978)、(1.720±0.315)、(1.279±0.301),組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=371.890,P=0.000),且各組miR-200c表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

    2.3 各組腫瘤干性指標表達比較 Werstern blotting法檢測結(jié)果顯示,各組間CD133、Nestin表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,且復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平較高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組Nestin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸升高,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

    2.4 各組EMT相關(guān)分子表達比較 各組N-cadherin、E-cadherin、Vimentin表達水平比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);其中高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高(P<0.05),且復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05);各組E-cadherin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3、圖3。

    3 討論

    膠質(zhì)瘤是成人常見的顱內(nèi)腫瘤,其中惡性程度高的膠質(zhì)瘤侵襲性強,手術(shù)難以完全切除,術(shù)后復發(fā)率高,預后差[7]。而手術(shù)后放、化療等序貫治療還是難以避免膠質(zhì)瘤的復發(fā),這和腫瘤干細胞的存在有一定的關(guān)系。腫瘤干細胞學說認為腫瘤組織或者腫瘤轉(zhuǎn)移灶中存在極少且具有無限自我更新能力并可導致腫瘤發(fā)生的細胞-腫瘤干細胞樣細胞(cancer stem like cells,CSLCs)[8]。這類細胞具有成體干細胞的某些功能特征,包括自我增殖和多向分化的能力,稱為“干性(stemness)”[9]。研究發(fā)現(xiàn),腫瘤干細胞在放化療抵抗和腫瘤復發(fā)過程中起關(guān)鍵作用[10],而目前的常規(guī)治療可能并未能有效地清除這些細胞,所以復發(fā)也就在所難免[3]。因此深入探討腫瘤干性與復發(fā)膠質(zhì)瘤的分子機制尤為重要。

    miR為在真核細胞生物體中廣泛存在的非編碼小分子單鏈RNA,可以參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,并在其侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起促進或抑制作用。因此通過檢測各級別膠質(zhì)瘤組織中miR表達情況,可對其預后的判斷提供重要依據(jù)。有研究表明miR-200家族成員(miR-200s)在晚期癌癥中經(jīng)常被沉默。在膠質(zhì)瘤中同樣可見miR-200b的低表達[11]。文獻[12]報道,miR-200c在人乳腺腫瘤干細胞及非致瘤癌細胞中存在差異性表達,可通過調(diào)節(jié)干細胞因子BMI1,抑制正常乳腺干細胞分化為乳腺小管,也可以抑制乳腺癌干細胞的成瘤能力。miR-200c下調(diào)在乳腺癌細胞中表達腫瘤干細胞標志物,重新表達miR-200可逆轉(zhuǎn)腫瘤標志物的特點[13]。腫瘤標志物表型的主要特點(無黏附力和增加細胞活力的能力)在目前的研究中都被確定為miR-200c的直接調(diào)控[14]。本研究結(jié)果顯示,各組miR-200c表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),提示miR-200c在正常腦組織中的表達情況明顯高于膠質(zhì)瘤組織,且miR-200c的表達情況與膠質(zhì)瘤的級別呈負相關(guān)趨勢,特別是在復發(fā)膠質(zhì)瘤中其表達經(jīng)常被沉默。說明了在生長活躍、惡性程度高的膠質(zhì)瘤中miR-200c水平明顯下降。

    另一方面,miR不僅能參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展,并對正常胚胎干細胞的自我更新能力以及細胞分化能力起著重要的調(diào)節(jié)作用。目前越來越多的研究表明,EMT參與腫瘤的侵襲及遷移并與腫瘤細胞的干細胞特征密切相關(guān)。EMT通過改變腫瘤的微環(huán)境使腫瘤細胞獲得干細胞特性[15-18],并在腫瘤轉(zhuǎn)移、治療抵抗和再復發(fā)中起關(guān)鍵作用[4-5]。同樣miR-200家族成員(miR-200s)亦參與了EMT過程。miR-200抑制EMT,上皮細胞獲得遷移、侵襲和間質(zhì)細胞抗凋亡的能力。筆者研究了miR-200c是否調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)EMT過程從而通過影響腫瘤干性調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展及復發(fā)。研究發(fā)現(xiàn),在EMT的過程中伴隨著上皮標記分子E-cadherin的下調(diào)和間充質(zhì)標記分子N-cadherin的上調(diào)。本研究檢測EMT相關(guān)分子(E-cadherin、N-cadherin、Vimentin)及腫瘤干性相關(guān)分子(NESTIN、CD133)在各組織樣本中表達情況,結(jié)果顯示,高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平均較對照組、低級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,且復發(fā)膠質(zhì)瘤組CD133表達水平較高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各組Nestin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸升高,E-cadherin表達水平隨著膠質(zhì)瘤級別升高逐漸降低,兩兩組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高級別膠質(zhì)瘤組、復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較對照組顯著升高(P<0.05),且復發(fā)膠質(zhì)瘤組N-cadherin、Vimentin表達水平均較低級別膠質(zhì)瘤組、高級別膠質(zhì)瘤組顯著升高(P<0.05)。上述結(jié)果與EMT的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)一致,且與本研究中腫瘤干性指標及miR-200c表達趨勢相一致,且Siebzehnrubl等[19]指出在膠質(zhì)瘤和正常腦組織中可出現(xiàn)N-cadherin的明顯升高。上述結(jié)果提示,復發(fā)及高級別膠質(zhì)瘤Vimentin表達明顯增高、E-cadherin表達明顯減少,的確有EMT的發(fā)生;但在低級別膠質(zhì)瘤中,相比正常組織,EMT標記分子變化不明顯,表明在低級別膠質(zhì)瘤中EMT不是其侵襲、遷移的主要特征。

    綜上所述,復發(fā)及高級別膠質(zhì)瘤比起正常組織及低級別膠質(zhì)瘤,腫瘤細胞干性明顯增強,并有明確的EMT發(fā)生,且miR-200c表達水平也同各分子表達呈線性相關(guān)趨勢。證實了miR-200c參與調(diào)控了復發(fā)及惡性膠質(zhì)瘤EMT發(fā)生,并調(diào)控了其腫瘤細胞的干性,這三者緊密聯(lián)系,可能是膠質(zhì)瘤復發(fā)的重要原因之一。miR-200c一方面可以調(diào)控EMT發(fā)生,另一方面調(diào)控腫瘤細胞的干性,可以認為是EMT和腫瘤干細胞的樞紐調(diào)控分子。但對于其中調(diào)控的分子機制仍有待進一步的研究,從而尋找一條治療膠質(zhì)瘤的新道路。

    參考文獻

    [1] Weller M,Van Den Bent M,Tonn J C,et al.European Association for Neuro-Oncology(EANO) guideline on the diagnosis and treatment of adult astrocytic and oligodendroglial gliomas[J].Lancet Oncol,2017,18(6):e315-e329.

    [2] Omum A,DeAngelis L M.Glioblastoma and other malignant gliomas:a clinical review[J].JAMA,2013,310(17):1842-1850.

    [3] Blanco E,Shen H,F(xiàn)errari M.Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery[J].Nat Biotechnol,2015,33(9):941-951.

    [4] Zhang Y,Weinberg R A.Epithelial-to-mesenchymal transition in cancer:complexity and opportunities[J].Front Med,2018,12(4):361-373.

    [5] Ouanouki A,Lamy S,Annabi B.Periostin,a signal transduction intermediate in TGF-β-induced EMT in U-87MG human glioblastoma cells,and its inhibition by anthocyanidins[J].Oncotarget,2018,9(31):22023-22037.

    [6] Krebs A M,Mitschke J,Lasierra Losada M,et al.The EMT-activator Zeb1 is a key factor for cell plasticity and promotes metastasis in pancreatic cancer[J].Nat Cell Biol,2017,19(5):518-529.

    [7] Ponnampalam S N,Kamaluddin N R,Zakaria Z,et al.A blood-based gene expression and signaling pathway analysis to differentiate between high and low grade gliomas[J].Oncol Rep,2017,37(1):10-22.

    [8] Brooks M D,Burness M L,Wicha M S.Therapeutic implications of cellular heterogeneity and plasticity in breast cancer[J].Cell Stem Cell,2015,17(3):260-271.

    [9] Ciardiello C,Leone A,Budillon A.The crosstalk between cancer stem cells and microenvironment is critical for solid tumor progression:The significant contribution of extracellular vesicles[J].Stem Cells Int,2018,2018:6392198.

    [10] Hale J S,Sinyuk M,Rich J N,et al.Decoding the cancer stem cell hypothesis in glioblastoma[J].CNS Oncol,2013,2(4):319-330.

    [11] Guo E,Wang Z,Wang S.MiR-200c and miR-141 inhibit ZEB1 synergistically and suppress glioma cell growth and migration[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2016,20(16):3385-3391.

    [12] Nieto M A,Huang R Y J,Jackson R A,et al.EMT:2016[J].Cell,2016,166(1):21-45.

    [13] Michalak E M,Burr M L,Bannister A J,et al.The roles of DNA,RNA and histone methylation in ageing and cancer[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2019,20(1):573-589.

    [14] Humphries B,Yang C.The microRNA-200 family:small molecules with novel roles in cancer development,progression and therapy[J].Oncotarget,2015,6(9):6472-6498.

    [15] Fischer K R,Durrans A,Lee S,et al.Epithelial-to-mesenchymal transition is not required for lung metastasis but contributes to chemoresistance[J].Nature,2015,527(7579):472-476.

    [16] Shibue T,Weinberg R A.EMT,CSCs,and drug resistance:the mechanistic link and clinical implications[J].Nat Rev Clin Oncol,2017,14(10)611-629.

    [17] Ahmed N,Abubaker K,F(xiàn)indlay J,et al.Epithelial mesenchymal transition and cancer stem cell-like phenotypes facilitate chemoresistance in recurrent ovarian cancer[J].Curt Cancer Drug Targets,2010,10(3):268-278.

    [18] Jiao F,Hu H,Han T,et al.Long noncoding RNA MALAT-1 enhances stem cell-like phenotypes in pancreatic cancer cells[J].Int J Mol Sci,2015,16(4):6677-6693.

    [19] Siebzehnrubl F A,Silver D J,Tugertimur B,et al.The ZEB1 pathway links glioblastoma initiation,invasion and chemoresistance[J].EMBO Mol Med,2013,5(8):1196-1212.

    (收稿日期:2020-03-05) (本文編輯:董悅)

    猜你喜歡
    干性高級別級別
    成人高級別腦膠質(zhì)瘤術(shù)后復發(fā)相關(guān)因素分析
    肺原發(fā)未分化高級別多形性肉瘤1例
    薯蕷皂苷元調(diào)控Nrf2信號通道干預大鼠干性AMD氧化應激機制的研究
    痘痘分級別,輕重不一樣
    高級別管線鋼X80的生產(chǎn)實踐
    山東冶金(2019年2期)2019-05-11 09:12:00
    邁向UHD HDR的“水晶” 十萬元級別的SIM2 CRYSTAL4 UHD
    新年導購手冊之兩萬元以下級別好物推薦
    夏季頻發(fā)溺水事件,“干性溺水”是怎么回事
    方圓(2017年12期)2017-07-17 17:48:12
    你是什么級別的
    中學生(2017年13期)2017-06-15 12:57:48
    夏季游泳要提防“干性溺水”
    日韩大尺度精品在线看网址| 人人妻人人澡欧美一区二区| 97超视频在线观看视频| 一级毛片我不卡| 亚洲av不卡在线观看| 国内精品久久久久精免费| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美xxxx性猛交bbbb| av在线老鸭窝| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 深夜a级毛片| 国产视频首页在线观看| 韩国av在线不卡| 久久这里有精品视频免费| 天堂中文最新版在线下载 | 91精品国产九色| 在线播放无遮挡| 午夜福利高清视频| 久久久久久大精品| 一进一出抽搐动态| 少妇的逼水好多| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品免费一区二区三区在线| 午夜免费激情av| 国产精品永久免费网站| 国产精品久久久久久久电影| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 在线天堂最新版资源| 搡女人真爽免费视频火全软件| 搡老妇女老女人老熟妇| 成人二区视频| 成年版毛片免费区| avwww免费| 成人午夜高清在线视频| 99久久人妻综合| 白带黄色成豆腐渣| 99久久中文字幕三级久久日本| 美女内射精品一级片tv| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 日本黄大片高清| 五月玫瑰六月丁香| 欧美xxxx性猛交bbbb| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久午夜欧美精品| 久久久精品94久久精品| 国产中年淑女户外野战色| 一级毛片aaaaaa免费看小| 三级国产精品欧美在线观看| a级毛片免费高清观看在线播放| 成人av在线播放网站| 欧美最黄视频在线播放免费| 一进一出抽搐gif免费好疼| 亚洲国产欧美在线一区| 在线免费十八禁| 99热精品在线国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 黄色视频,在线免费观看| 国产中年淑女户外野战色| 看黄色毛片网站| 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久国产a免费观看| 精品人妻熟女av久视频| 特级一级黄色大片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久午夜福利片| 亚洲美女搞黄在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 久久这里只有精品中国| 国产精华一区二区三区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 午夜福利在线在线| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品永久免费网站| 国产精品.久久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产一区二区激情短视频| 久久久精品94久久精品| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 免费av不卡在线播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩av在线大香蕉| 久久久久九九精品影院| 日韩一区二区三区影片| 青春草视频在线免费观看| 久久亚洲国产成人精品v| 老司机福利观看| 青春草视频在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产老妇女一区| 男的添女的下面高潮视频| 久久亚洲精品不卡| 免费电影在线观看免费观看| 久久久久久国产a免费观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 99久久成人亚洲精品观看| 激情 狠狠 欧美| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美zozozo另类| 性色avwww在线观看| 少妇熟女欧美另类| 少妇的逼水好多| 成人毛片60女人毛片免费| 热99在线观看视频| 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品夜色国产| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲在久久综合| 亚洲真实伦在线观看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 嫩草影院入口| 亚洲av电影不卡..在线观看| 日韩国内少妇激情av| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产黄a三级三级三级人| 好男人视频免费观看在线| 免费在线观看成人毛片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 国内精品久久久久精免费| av福利片在线观看| 欧美性感艳星| 久久久a久久爽久久v久久| 高清毛片免费观看视频网站| 精品免费久久久久久久清纯| av在线天堂中文字幕| 长腿黑丝高跟| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 男女边吃奶边做爰视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久精品国产自在天天线| 日日啪夜夜撸| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 免费av不卡在线播放| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av福利片在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲天堂国产精品一区在线| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 一本一本综合久久| 国产麻豆成人av免费视频| 桃色一区二区三区在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲综合色惰| 少妇人妻精品综合一区二区 | 99在线人妻在线中文字幕| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产伦一二天堂av在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 能在线免费观看的黄片| www.av在线官网国产| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产成人影院久久av| 国产 一区 欧美 日韩| 国内精品美女久久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 51国产日韩欧美| 成人永久免费在线观看视频| 高清日韩中文字幕在线| 久久精品夜色国产| 免费无遮挡裸体视频| 美女黄网站色视频| 色视频www国产| 99久久九九国产精品国产免费| av免费在线看不卡| 成人av在线播放网站| av在线亚洲专区| 男女下面进入的视频免费午夜| 男插女下体视频免费在线播放| 中文字幕久久专区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 成人午夜高清在线视频| 日韩一区二区视频免费看| 久久人人精品亚洲av| 色播亚洲综合网| 久久久a久久爽久久v久久| 22中文网久久字幕| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 中文在线观看免费www的网站| 国产高潮美女av| 免费观看人在逋| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 嫩草影院精品99| 青春草国产在线视频 | 丰满人妻一区二区三区视频av| 精品欧美国产一区二区三| 久久久欧美国产精品| 在线观看一区二区三区| 51国产日韩欧美| 黄色一级大片看看| 长腿黑丝高跟| 亚洲不卡免费看| 亚洲成人久久性| 超碰av人人做人人爽久久| 久久精品国产亚洲av天美| 国产精品综合久久久久久久免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美高清成人免费视频www| 精品久久久久久久久亚洲| 国产精华一区二区三区| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 色吧在线观看| 亚洲精品456在线播放app| 九九在线视频观看精品| 综合色丁香网| 精品国内亚洲2022精品成人| 搡女人真爽免费视频火全软件| 成人av在线播放网站| 天天一区二区日本电影三级| 国产精品日韩av在线免费观看| 99热这里只有精品一区| 2022亚洲国产成人精品| 久久午夜亚洲精品久久| 91精品一卡2卡3卡4卡| 三级国产精品欧美在线观看| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产黄色小视频在线观看| 欧美成人a在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 内射极品少妇av片p| 亚洲无线观看免费| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 成人特级av手机在线观看| 成人午夜高清在线视频| 久久精品综合一区二区三区| 午夜a级毛片| 午夜福利在线在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 在线免费十八禁| 久久韩国三级中文字幕| 久久久久久大精品| 99热只有精品国产| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本黄色视频三级网站网址| 日韩一区二区视频免费看| 老司机福利观看| 好男人在线观看高清免费视频| 国产视频首页在线观看| 精品国产三级普通话版| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 99在线视频只有这里精品首页| 日本av手机在线免费观看| 99久久中文字幕三级久久日本| 日日啪夜夜撸| 人体艺术视频欧美日本| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 久99久视频精品免费| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产精品三级大全| 一区福利在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国语自产精品视频在线第100页| 啦啦啦韩国在线观看视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产麻豆成人av免费视频| 六月丁香七月| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 免费电影在线观看免费观看| 91av网一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久久色成人| 久久久国产成人精品二区| 国产成人a区在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| av.在线天堂| 国产一区二区三区av在线 | 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美+日韩+精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 日韩精品有码人妻一区| 九九热线精品视视频播放| 99riav亚洲国产免费| 中出人妻视频一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 女同久久另类99精品国产91| 91aial.com中文字幕在线观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 内地一区二区视频在线| 波野结衣二区三区在线| av免费在线看不卡| 毛片一级片免费看久久久久| a级毛色黄片| 日韩视频在线欧美| 一级黄色大片毛片| 一级毛片电影观看 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 黄色欧美视频在线观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av免费在线观看| av视频在线观看入口| 欧美色欧美亚洲另类二区| 青春草视频在线免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲真实伦在线观看| 一级毛片我不卡| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲成人中文字幕在线播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 级片在线观看| 国产高潮美女av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产高清三级在线| 国产精品福利在线免费观看| 男插女下体视频免费在线播放| 中文资源天堂在线| 在线免费观看的www视频| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产一区二区在线av高清观看| 成年av动漫网址| 悠悠久久av| 免费搜索国产男女视频| a级一级毛片免费在线观看| eeuss影院久久| 1024手机看黄色片| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产男人的电影天堂91| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 欧美在线一区亚洲| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 日韩精品有码人妻一区| 51国产日韩欧美| 欧美日韩综合久久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| av黄色大香蕉| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久国产成人免费| 看十八女毛片水多多多| 激情 狠狠 欧美| 99热这里只有是精品50| av免费观看日本| 欧美色视频一区免费| 久久久久久久久久久免费av| 丰满乱子伦码专区| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品欧美国产一区二区三| 99久久九九国产精品国产免费| 亚洲精品国产成人久久av| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 91av网一区二区| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲在线自拍视频| 日韩精品有码人妻一区| 日韩一区二区三区影片| 亚洲一区二区三区色噜噜| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 成人综合一区亚洲| 国内揄拍国产精品人妻在线| 久久久久性生活片| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 亚洲综合色惰| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 少妇的逼水好多| 日韩欧美三级三区| 亚洲人成网站在线播| 国产极品天堂在线| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 看十八女毛片水多多多| 69人妻影院| 日韩成人伦理影院| 精品久久国产蜜桃| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| eeuss影院久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 人人妻人人看人人澡| 亚洲国产欧美在线一区| 国产91av在线免费观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 69av精品久久久久久| 免费黄网站久久成人精品| 国产爱豆传媒在线观看| 天美传媒精品一区二区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产不卡一卡二| 国产日本99.免费观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 中文字幕av在线有码专区| 国产精品,欧美在线| 极品教师在线视频| 日韩av不卡免费在线播放| 国模一区二区三区四区视频| 成人永久免费在线观看视频| 国产一区二区激情短视频| 午夜激情福利司机影院| 国产成人一区二区在线| 国产男人的电影天堂91| 国产美女午夜福利| 欧美日本视频| 精品久久国产蜜桃| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 国产伦在线观看视频一区| 国产成人福利小说| 观看免费一级毛片| 在线观看一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 在现免费观看毛片| 国产精品蜜桃在线观看 | 欧美bdsm另类| 久久草成人影院| 在线观看免费视频日本深夜| а√天堂www在线а√下载| 亚洲人成网站在线观看播放| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲人成网站在线播| 五月伊人婷婷丁香| 久久久国产成人精品二区| av在线观看视频网站免费| 国产精品.久久久| 久久精品91蜜桃| 欧美激情在线99| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 国产黄片美女视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产高潮美女av| 国产日本99.免费观看| 日韩中字成人| 国产在线精品亚洲第一网站| 国国产精品蜜臀av免费| 国产探花极品一区二区| 久久久久九九精品影院| 日韩精品青青久久久久久| 婷婷色av中文字幕| 国产成人91sexporn| 国产色婷婷99| 一级二级三级毛片免费看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 老司机影院成人| 亚洲av中文av极速乱| 国产v大片淫在线免费观看| 99热网站在线观看| 波多野结衣巨乳人妻| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产伦在线观看视频一区| 天天躁日日操中文字幕| 一进一出抽搐gif免费好疼| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲美女视频黄频| 免费观看精品视频网站| 一级毛片久久久久久久久女| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜激情欧美在线| 精品国产三级普通话版| 青春草视频在线免费观看| 18禁在线播放成人免费| 日本成人三级电影网站| 国产人妻一区二区三区在| 国产真实伦视频高清在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 97超视频在线观看视频| 日韩成人伦理影院| videossex国产| 久久久久久九九精品二区国产| 欧美3d第一页| 国产精品久久久久久精品电影| 美女被艹到高潮喷水动态| 日本爱情动作片www.在线观看| 插逼视频在线观看| 久久人人爽人人片av| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩一区二区视频免费看| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 久久99热6这里只有精品| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 精品国内亚洲2022精品成人| 69人妻影院| 天堂中文最新版在线下载 | 国产爱豆传媒在线观看| 人妻久久中文字幕网| av免费在线看不卡| 99热这里只有是精品50| 波多野结衣高清作品| 亚洲av成人精品一区久久| 久久久久久久久大av| 国产精品久久电影中文字幕| 最新中文字幕久久久久| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产精品无大码| 欧美丝袜亚洲另类| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 在线免费十八禁| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 在线免费十八禁| ponron亚洲| 久久久国产成人免费| 男的添女的下面高潮视频| 国产美女午夜福利| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产熟女欧美一区二区| 国产亚洲精品久久久com| 永久网站在线| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲成人久久性| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 51国产日韩欧美| 91av网一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| а√天堂www在线а√下载| 亚洲一区二区三区色噜噜| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 黑人高潮一二区| 搞女人的毛片| 久久久国产成人免费| 国产不卡一卡二| 久久这里有精品视频免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 人妻久久中文字幕网| 少妇的逼好多水| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 精品久久久久久久人妻蜜臀av| av卡一久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 天堂影院成人在线观看| 亚洲av一区综合| 国产精品一区二区性色av| 人妻久久中文字幕网| 国产一区二区激情短视频| 色综合色国产| 51国产日韩欧美| 99热网站在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 久久午夜亚洲精品久久| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久这里有精品视频免费| 精品久久久久久久末码| 神马国产精品三级电影在线观看| 天堂影院成人在线观看| 我要搜黄色片| 亚洲成人久久性| 日本三级黄在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 在线a可以看的网站| 日韩一区二区三区影片| 亚洲av免费在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲成人久久爱视频| 免费av毛片视频| 18+在线观看网站| 美女cb高潮喷水在线观看| 成人三级黄色视频| 联通29元200g的流量卡| 亚洲精品影视一区二区三区av| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲av成人精品一区久久| 欧美zozozo另类| 此物有八面人人有两片| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品女同一区二区软件| 欧美三级亚洲精品| 精品日产1卡2卡| 国产精品三级大全| 99视频精品全部免费 在线| 一级av片app| 成年女人永久免费观看视频| 在线观看免费视频日本深夜| 嘟嘟电影网在线观看| 少妇的逼好多水| 成人亚洲欧美一区二区av| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 婷婷亚洲欧美| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产亚洲91精品色在线| 黄色日韩在线| 国产69精品久久久久777片| 亚洲内射少妇av| 欧美区成人在线视频| 久久久国产成人精品二区| 国产精品三级大全| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 晚上一个人看的免费电影| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲美女搞黄在线观看| 我要搜黄色片| 中文字幕av成人在线电影| 国产高清三级在线| 两个人视频免费观看高清| 日日啪夜夜撸|