聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷的實驗研究

許長春　許可鵬

【摘要】目的探討聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷的效果。方法選取30只成年Wistar大鼠，將模型動物隨機分為三組：正常組、損傷組及聯(lián)合移植組，每組10只。觀察三組的BBB評分，誘發(fā)電位潛伏期及板試驗角度值的變化。結(jié)果聯(lián)合移植組的1，2，4，8周的BBB評分皆明顯高于損傷組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而兩組的BBB評分顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。大鼠CSEP的波形為“W”形，所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的潛伏期正常。4周后，聯(lián)合移植組出現(xiàn)“W”形，但是誘發(fā)電位潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。自損傷后1周起，各時間點損傷組及聯(lián)合移植組大鼠行斜板試驗角度值均逐漸上升，聯(lián)合移植組所測得角度值均大于單純損傷組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷，可以激活Wnt/p-catenin信號通路使脊髓損傷后部分內(nèi)源性神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，減輕膠質(zhì)瘢痕，從而改善大鼠后肢功能的恢復(fù)。

【關(guān)鍵詞】姜黃素；神經(jīng)干細胞；治療；脊髓損傷；聯(lián)合應(yīng)用；臨床療效

【中圖分類號】R651.2 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】2095-0616（2015）21-30-04

脊髓損傷（spinal cotd injury，SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）創(chuàng)傷，目前尚無有效的治療手段。傳統(tǒng)觀念認為，困擾脊髓損傷后神經(jīng)功能修復(fù)的關(guān)鍵問題是損傷的神經(jīng)組織及細胞無法再生。干細胞的發(fā)現(xiàn)使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究進入了新的領(lǐng)域。目前，SCI后的細胞替代治療已成為神經(jīng)功能修復(fù)的熱點問題。常用的方法有外源性干細胞移植與激活并誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（endogenous neural stemcells，ENSCs），與外源性干細胞移植相比，激活并誘導(dǎo)內(nèi)源性神經(jīng)干細胞來修復(fù)脊髓損傷，不存在安全及倫理問題，其新生的神經(jīng)組織細胞在與機體整合上具有同源性，不存在排斥反應(yīng)。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞干預(yù)大鼠脊髓挫傷模型，觀察損傷后大鼠神經(jīng)功能修復(fù)情況，分析其效果，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

30只成年Wistar大鼠，體重（250.0±50.0）g，雌雄不拘，合格證號00005907，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。將模型動物隨機分為三組：正常組、損傷組及聯(lián)合移植組，每組10只。三組月齡、體重等一般資料比餃，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2脊髓損傷模型的制備

動物腹腔麻醉后，背部剪毛，常規(guī)碘酒酒精消毒。沿脊柱正中切開皮膚，分離肌肉，暴露椎骨，用咬骨鉗仔細咬去椎板，在T₉與T₁₁椎骨平面打開椎管，充分暴露T₁₀節(jié)段脊髓背面及兩側(cè)，用彎頭眼科鑷將脊髓輕輕挑起，用眼科剪將脊髓完全剪斷，將分離的肌肉縫合封閉椎管缺損，縫合皮膚，制成脊髓損傷模型。

1.3方法

正常組：僅行切皮、打開椎管，不施行SCI。

損傷組：脊髓全橫斷損傷。

聯(lián)合移植組：在脊髓完全橫斷后1周移植大鼠NSCs懸液+姜黃素組（500nmol/L）。

1.4神經(jīng)干細胞的提取、培養(yǎng)及鑒定

取孕14.5d左右的SD大鼠。常規(guī)消毒后用5mL注射器按0.06mL/10g劑量抽取適量5%水合氯醛腹腔麻醉，胚胎組織取出于無菌PBS中清洗，取胚胎額頂部2/3組織于盛有適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用刀片小心切碎后用200目濾網(wǎng)濾過，以去除大的組織塊、血管、腦膜等組織。用5mL槍頭小心用力均勻吹打15～20次，再經(jīng)過400目細胞篩過濾來制成單細胞懸液。將制好的單細胞懸液分裝到25mL無菌培養(yǎng)瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育中進行培養(yǎng)。Nestin抗體及熒光二抗進行標(biāo)識。

1.5BBB功能評分評價大鼠下肢功能行為學(xué)檢測參照Basso等提出的大鼠SCI后功能評判標(biāo)準(zhǔn)（簡稱BBB評分法）對各實驗動物后肢的運動功能進行評分。所有觀察都在上午進行，評分前應(yīng)將所有動物的膀胱排空，時間為4min，評分時采用雙盲法。分別對損傷后1，2，4，8周的BBB評分進行比較。

1.6動物皮層體感誘發(fā)電位（CSEP）的測定

模型動物在術(shù)后1d及9周行CSEP檢查。每只動物均測雙下肢。

1.7斜板試驗

將厚度為1cm表面帶有溝槽的膠墊固定于一木板上，在術(shù)前及術(shù)后相應(yīng)時間點將大鼠置于測試斜板上，斜板一端位置固定，另一端由水平位，即0度角逐漸升高，直至大鼠在斜板上所處位置無法停留達到5s時，用電子角度尺測量斜板與地面之間的夾角，獲得該次斜板試驗的角度值。每只大鼠共進行三次斜板試驗，取平均值。

1.8統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比表示，采用x²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1脊髓組織標(biāo)本形態(tài)觀察

假手術(shù)組脊髓組織形態(tài)正常，表面光滑，呈白色，橫截面呈橢圓形。單純損傷組及姜黃素干預(yù)組在脊髓夾傷后即刻便可見損傷部位一橫行血腫帶。損傷后1d脊髓組織標(biāo)本可見夾傷部位有一暗紅色、寬約1mm的橫行出血帶，自損傷部位向上及向下2～3個脊髓節(jié)段可見脊髓實質(zhì)彌散性出血，呈紅褐色，但脊髓外觀大體形態(tài)基本正常。損傷后1周脊髓組織標(biāo)本可見血腫大部分吸收，脊髓鉗夾部位可見一呈淡黃色的橫行損傷帶。自損傷后2周起脊髓背側(cè)因缺乏椎板骨質(zhì)，與周圍肌肉或軟組織粘連明顯，出血基本吸收完全，損傷部位開始出現(xiàn)較明顯的縮窄，隨時間推移上述情況逐漸加重，至8周時單純損傷組損傷節(jié)段縮窄明顯，損傷部位上下端脊髓連接疏松，在剝離脊髓過程中如操作不慎極易離斷，部分標(biāo)本在強光下可見損傷部位脊髓實質(zhì)中有囊腔形成。endprint

2.2大鼠脊髓損傷后各時間點BBB評分

聯(lián)合移植組的1，2，4，8周的BBB評分皆明顯高于損傷組兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），兩組的BBB評分顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.3三組動物的皮層體感誘發(fā)電位潛伏期比較

大鼠CSEP的波形為“W”形，所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的潛伏期正常。4周后，聯(lián)合移植組出現(xiàn)“W”形，但是誘發(fā)電位潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示脊髓傳導(dǎo)速度明顯下降。見表2。

2.4三組大鼠脊髓損傷后各時間點斜板試驗角度值比較

自損傷后1周起，各時間點損傷組及聯(lián)合移植組大鼠行斜板試驗角度值均逐漸上升，聯(lián)合移植組所測得角度值均大于單純損傷組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表3。

3討論

脊髓損傷是一種嚴(yán)重致殘性神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，傷后立即出現(xiàn)損傷水平以下運動、感覺和括約肌功能障礙。世界范圍總發(fā)生率為每年12.1～57.8/百萬人，交通意外及高處墜落為最常見致傷因素。至今尚無有效的治療措施。

脊髓損傷的病理生理過程經(jīng)歷了由機械外力引起的原發(fā)性損傷并觸發(fā)級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致繼發(fā)性損傷，細胞損害由最初的損傷部位向臨近區(qū)域及遠側(cè)的白質(zhì)及灰質(zhì)擴散。對繼發(fā)性損傷的研究提示眾多有害因素同時出現(xiàn)，包括缺血、自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過氧化及有害的離子流等進一步加劇損傷程度。

由于脊髓損傷是突發(fā)機械性創(chuàng)傷導(dǎo)致的出血、組織壞死，原發(fā)損傷及繼發(fā)損傷多種相關(guān)的病理生理改變恰好與姜黃素的抗氧化、抗纖維化、抗炎、抗膠質(zhì)細胞等特性相契合。因此，我們將姜黃素作為干預(yù)措施，觀察其對預(yù)防和治療脊髓損傷的功效。

姜黃素（curcmnin）是姜科姜黃屬植物根莖的提取物，作為傳統(tǒng)中藥材，廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕病、發(fā)熱、腸道疾病、外傷、閉經(jīng)等，當(dāng)代研究表明姜黃素對炎癥、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、代謝性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等多種疾病均有療效而無明顯毒副作用。近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究顯示姜黃素具有明顯的神經(jīng)保護作用，并且姜黃素可刺激胚胎神經(jīng)前體細胞增殖，也可增強成年海馬的神經(jīng)發(fā)生。

本研究中，聯(lián)合移植組的1，2，4，8周的BBB評分皆明顯高于損傷組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而兩組的BBB評分顯著低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。大鼠CSEP的波形為“W”形，所有大鼠在術(shù)前和正常組術(shù)后的潛伏期正常。4周后，聯(lián)合移植組出現(xiàn)“W”形，但是誘發(fā)電位潛伏期明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。自損傷后1周起，各時間點損傷組及聯(lián)合移植組大鼠行斜板試驗角度值均逐漸上升，聯(lián)合移植組所測得角度值均大于單純損傷組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

綜上所述，聯(lián)合應(yīng)用姜黃素與神經(jīng)干細胞治療脊髓損傷，可以激活Wnt/p-catenin信號通路使脊髓損傷后部分內(nèi)源性神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元方向分化，減輕膠質(zhì)瘢痕，從而改善大鼠后肢功能的恢復(fù)。endprint