胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA表達變化及意義

黃克楠，劉冬艷，王愛民，白志超，崔保栓，殷培培，馬良(中國人民解放軍第二五二醫(yī)院，河北保定071000)

胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA表達變化及意義

黃克楠，劉冬艷，王愛民，白志超，崔保栓，殷培培，馬良
(中國人民解放軍第二五二醫(yī)院，河北保定071000)

摘要:目的觀察胃癌組織中微小染色體維持蛋白2( MCM2) mRNA和增殖細胞核抗原( PCNA) mRNA的表達變化。方法應(yīng)用實時定量PCR檢測48例份胃癌組織(觀察組)及其相應(yīng)癌旁組織(對照組)中MCM2、PCNA mRNA，分析胃癌組織中兩者的表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果觀察組、對照組MCM2 mRNA相對表達量分別為16.27±0.368、5.32±0.401，PCNA mRNA相對表達量分別為22.12±0.289、7.88±0.374，兩組比較，P均＜0.05。不同分化程度、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中MCM2、PCNA mRNA表達比較，P均＜0.05。胃癌組織中MCM2 mRNA與PCNA mRNA的表達呈正相關(guān)( r = 0.531，P＜0.01)。結(jié)論胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA的表達增多，兩者可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

關(guān)鍵詞:胃腫瘤;微小染色體維持蛋白2;增殖細胞核抗原

胃癌是臨床最常見惡性腫瘤之一，盡管近年來在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有所下降，但其病死率在腫瘤中位居第二位［1］。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多因素、多階段的動態(tài)順序演變過程，涉及到多種癌基因的激活、抑癌基因的失活以及由此引起的細胞周期的改變等。目前，我國首次就診的胃癌患者中有超過一半的患者已為中晚期。腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是胃癌治療后復(fù)發(fā)或進展的主要原因，因此，如何早期發(fā)現(xiàn)并診斷胃癌顯得尤為重要。微小染色體維持蛋白( MCM)為真核生物DNA復(fù)制的主要調(diào)控因子之一，其成員MCM2在靜止期細胞中不表達，在增殖細胞中過度表達，可以準確反映細胞的增殖活性，可作為細胞增殖標記物來標記細胞所處的狀態(tài)［2］。研究［3］表明，MCM2的細胞表達陽性率與細胞的增殖能力和進入細胞周期的細胞數(shù)成正相關(guān)，且與細胞發(fā)育異常的嚴重程度有關(guān)。增殖細胞核抗原( PCNA)是一種非組蛋白性的核蛋白，與細胞增殖和DNA合成有關(guān)，可反映細胞增殖程度和所處周期。本研究觀察了胃癌組織MCM2、PCNA mRNA的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2010年1月～2011年10月經(jīng)病理確診的48例胃癌患者，其中男31例、女17例，年齡26～81歲，中位年齡60歲。臨床分期中Ⅰ期3例，Ⅱ期13例，Ⅲ期31例，Ⅳ期(大網(wǎng)膜浸潤) 1 例;腫瘤直徑＞5 cm 23例，≤5 cm 25例;高分化腺癌12例，低分化腺癌25例，中分化腺癌11例; T分期中T1期6例，T2期16例，T3期21例，T4期5例。所有患者術(shù)前均未行放化療，手術(shù)切除胃癌組織作為觀察組，并選取其對應(yīng)的距胃癌邊緣3 cm的癌周組織及陰性切緣組織作為對照組。

1.2 MCM2、PCNA mRNA檢測方法采用實時定量PCR。兩組組織標本離體后立即置于液氮罐冷凍，后轉(zhuǎn)移至－80℃(冰箱)下保存待檢。采用TRIzol(康為世紀生物工程有限公司)一步法抽提組織總RNA。實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。紫外分光光度儀測定RNA的量，瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA的完整性。所提取RNA于－80℃冷凍保存。使用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(康為世紀生物工程有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取總RNA提取物2 μL，dNTP Mix 4 μL( 2.5 mmol/L Each)，Primer Mix 2 μL，5×RT Buffer 4 μL，SuperRT 酶1 μL( 200 U/μL)，RNase-Free Water 7 μL。反應(yīng)體系共20 μL，混勻，42℃35 min，85℃5 min，反應(yīng)產(chǎn)物置于－20℃長期保持。引物由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。MCM2基因引物序列:上游為5'-CACATCGAGTCCATGATCC-3'，下游為5'-CAAAAGTCTTGCGCATGCT-3'，基因片段長度為113 bp; PCNA基因引物序列:上游為5'-GGAAATGGAAACATTTTAAATTGTCAC-3'，下游為5'-GAGTGGCTTTTGTAAAGAAGTTCAG-3'，基因片段長度為133 bp; GAPDH引物序列:上游為5'-AGCCT-

CAAGATCATCAGCAATGCC-3'，下游為5'-TGTGGTCATGAGTCCTTCCACGAT-3'，基因片段長度為293 bp。樣品在ABI7500型熒光PCR儀上進行擴增。采用相對定量法，在測定目的基因的同時測定內(nèi)源性看家基因GAPDH，用以標準化標本。取cDNA 0.5 μL，依次加入2×Buffer 12.5 μL，Super Enzyme Mix 0.5 μL，上下引物各0.5 μL，反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件為45℃10 min; 95℃5 min; 95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，40個循環(huán);每一例樣本反應(yīng)結(jié)束后由計算機自動計算并讀出定量結(jié)果Ct值。以GAPDH為參照基因，檢測各模板的Ct值，陰性對照不加模板。溶解曲線為單峰表示基因特異性擴增。目的基因mRNA的相對表達量以2ΔCt表示。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗;兩變量間的相關(guān)性檢驗采用Spearman等級相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

觀察組、對照組MCM2 mRNA相對表達量分別為16.27±0.368、5.32±0.401，PCNA mRNA相對表達量分別為22.12±0.289、7.88±0.374，兩組比較，P均＜0.05。MCM2、PCNA mRNA表達與胃癌患者臨床病理因素的關(guān)系見表1。不同分化程度、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤組織中MCM2、PCNA mRNA表達比較，P均＜0.05。胃癌組織中MCM2 mRNA與PCNA mRNA的表達呈正相關(guān)( r = 0.531，P＜0.01)。

表1　 MCM2、PCNA mRNA表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(±s)

表1　 MCM2、PCNA mRNA表達與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(±s)

臨床病理參數(shù)MCM2 mRNA　PCNA mRNA分化程度高、中分化　11.26±0.223　 10.21±0.184低分化　15.84±0.365　 17.68±0.398臨床分期Ⅰ～Ⅱ期　5.68±0.136　6.42±0.273Ⅲ～Ⅳ期　26.84±0.431　 27.19±0.372 T分期T1～T2期　5.67±0.257　7.81±0.314 T3～T4期　20.82±0.412　 23.54±0.563腫瘤直徑＜5 cm　11.26±0.384　 10.99±0.267 ≥5 cm　19.44±0.352　 18.38±0.209淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無3.91±0.076　4.35±0.153 有18.47±0.238　 19.24±0.364

3　討論

MCM是1998年發(fā)現(xiàn)的微小染色體支持蛋白，由6個亞基構(gòu)成的六聚體環(huán)狀蛋白質(zhì)，即MCM2～7，由cdc基因編碼。目前一致認為，它們是一組在序列上高度同源，功能上密切相關(guān)的蛋白。MCM是真核生物DNA復(fù)制的必需因子，是DNA復(fù)制許可因子，在DNA復(fù)制起始與延伸中起關(guān)鍵作用，能確保DNA的復(fù)制在每個細胞周期中僅發(fā)生一次［4］。在G1期，MCM結(jié)合到DNA形成復(fù)制前復(fù)合體，MCM2是該復(fù)合體中的一種。MCM2在靜止期細胞中含量極少，在正常增殖細胞和轉(zhuǎn)化細胞中的含量在G1期開始增加，S期早期達到高峰，并與染色質(zhì)結(jié)合，在S期至有絲分裂期是游離的，在G2期與M期時降低。MCM2與細胞周期變化相一致，為細胞S期的標志物，是特異性增殖相關(guān)因子，被認為是癌前標記，廣泛應(yīng)用于腫瘤早期診斷［5］。

MCM2在多種腫瘤組織中均有不同表達，且MCM2高表達與腫瘤的分化、分期、預(yù)后相關(guān)。Wojnar等［6］發(fā)現(xiàn)MCM2表達與乳腺癌組織分化程度有關(guān)，腫瘤分化越差，MCM2陽性率越高。Saeb-Parsy等［7］對497例膀胱癌患者尿液脫落細胞進行了研究，認為免疫組化法檢測MCM2可作為診斷膀胱癌可重復(fù)使用的方法。Rosamilia等［8］研究發(fā)現(xiàn)，MCM2蛋白在正常宮頸上皮、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ中的陽性表達率逐漸增加。Negri等［9］用免疫組化法檢測15例宮頸腺癌及29例宮頸原位腺癌的MCM2蛋白，發(fā)現(xiàn)檢測MCM2有助于診斷宮頸腺癌。

本研究結(jié)果顯示，MCM2 mRNA在胃癌組織中的表達高于其對應(yīng)的癌旁組織，且MCM2 mRNA在不同腫瘤分化程度、臨床分期、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的表達具有差異性，提示MCM2 mRNA可作為胃癌早期診斷及預(yù)后判斷的重要指標。本實驗還同時檢測了相應(yīng)組織中PCNA mRNA的表達，結(jié)果顯示MCM2 mRNA與PCNA mRNA在胃癌組織中的表達呈正相關(guān)。提示兩者在細胞周期調(diào)控中共同參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，胃癌組織中MCM2、PCNA mRNA的表達增多，兩者可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，兩者聯(lián)合檢測可用于輔助胃癌早期診斷、病情評估及預(yù)后判斷。

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收稿日期:( 2015-05-13)

文章編號:1002-266X( 2015) 31-0069-03

文獻標志碼:B

中圖分類號:R735.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.028