側(cè)腦室注入網(wǎng)膜素對(duì)小鼠攝食量及其下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達(dá)的影響

宋娟，孫燕妮，秦熠，郭瑞敏，承解靜(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062)

側(cè)腦室注入網(wǎng)膜素對(duì)小鼠攝食量及其下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達(dá)的影響

宋娟，孫燕妮，秦熠，郭瑞敏，承解靜
(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院，上海200062)

摘要:目的觀察側(cè)腦室注入網(wǎng)膜素( omentin)對(duì)小鼠攝食量及其下丘腦組織神經(jīng)肽Y( NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白( AGRP)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素( CRH)、阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原( POMC) mRNA表達(dá)的影響。方法20只昆明小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，兩組側(cè)腦室置管并保留72 h后分別于側(cè)腦室注射omentin及生理鹽水( 1.2 μg/kg)，觀察注射后24 h小鼠攝食量有無(wú)變化，RT-PCR檢測(cè)兩組小鼠下丘腦組織AGRP、NPY、CRH及POMC mRNA。結(jié)果實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組攝食量分別為( 4.63±0.17)、( 4.51±0.12) g，兩組比較，P＞0.05。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組NPY mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.47±0.24、0.48±0.29，AGRP mRNA分別為24.31±6.21、22.01±7.14，POMC mRNA分別為0.92±0.48、0.83±0.16，CRH mRNA分別為0.93±0.45、0.69±0.12，兩組CRH mRNA表達(dá)量比較，P＜0.05。結(jié)論側(cè)腦室注入omentin對(duì)小鼠攝食量及下丘腦組織NPY、AGRP、POMC mRNA表達(dá)無(wú)影響，但CRH mRNA表達(dá)增加。

關(guān)鍵詞:網(wǎng)膜素;下丘腦食欲中樞;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素

脂肪組織是體內(nèi)最大的能量?jī)?chǔ)備器官和內(nèi)分泌器官，其分泌大量脂肪因子參與調(diào)節(jié)脂肪代謝、葡萄糖代謝及炎癥反應(yīng)。脂肪因子除作用于外周組織，還通過(guò)控制攝食、影響食欲對(duì)能量代謝產(chǎn)生重要中樞調(diào)節(jié)作用。參與下丘腦食欲調(diào)節(jié)的基因包括神經(jīng)肽Y( NPY)、刺鼠相關(guān)蛋白( AGRP)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素( CRH)、阿片-促黑素細(xì)胞皮質(zhì)素原( POMC)等。網(wǎng)膜素( omentin)是特異性表達(dá)于網(wǎng)膜脂肪組織的脂肪細(xì)胞因子，廣泛參與糖代謝、炎癥反應(yīng)、血管功能等過(guò)程，在肥胖患者中水平下降。本實(shí)驗(yàn)觀察了側(cè)腦室注入omentin對(duì)小鼠攝食量及下丘腦NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明omentin與肥胖的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑健康昆明小鼠20只，雌雄各半，體質(zhì)量25～30 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，置于室溫25℃左右，分籠喂養(yǎng)，12 h/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由飲水。人重組omentin購(gòu)自Sigma公司。

1.2 omentin小鼠側(cè)腦室注入方法將20只昆明小鼠飼養(yǎng)至7周齡后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。兩組小鼠固定于腦立體定位儀上(復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物研究所提供)，腹腔注射戊巴比妥麻醉，碘酒消毒頭頂皮膚后，縱向正中切開(kāi)顱頂皮膚，暴露顱骨，在前囟點(diǎn)后1 mm、中線(xiàn)旁開(kāi)2 mm處，用牙科鉆鉆一小孔，垂直插入一個(gè)PE210塑料管(內(nèi)徑0.128 mm，外徑0.161 mm)，深度為2 mm。縫合頭皮，將小管固定于頭顱。保留置管72 h，期間正常飲食。在第4天清晨7: 00至8: 00使用微量注射器于實(shí)驗(yàn)組小鼠置管中注入omentin( 1.2 μg/kg)，對(duì)照組注入生理鹽水( 1.2 μg/kg)，均于30 s內(nèi)完成。

1.3小鼠攝食量觀察及下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA檢測(cè)觀察注射后24 h兩組小鼠攝食量有無(wú)變化。24 h后用10%水合氯醛( 3 mL/kg)腹腔內(nèi)注射致死小鼠，于無(wú)菌冰塊上迅速取出兩組小鼠的下丘腦組織，置液氮冷凍，然后置于－80℃超低溫冰箱保存，以備RNA提取。采用RT-PCR檢測(cè)下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA。按TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取下丘腦的總RNA，測(cè)定RNA濃度后在20 μL的反應(yīng)體系中，以1 μL RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。自基因庫(kù)查得小鼠NPY、AGRP、CRH、POMC目的基因和β-actin的cDNA序列，設(shè)計(jì)PCR引物，擴(kuò)增條件: 94℃、15 s，60℃、60 s，80℃、2 s，44個(gè)循環(huán)。所有基因擴(kuò)增前95℃預(yù)變性10 min，擴(kuò)增后72℃延伸10 min。反

應(yīng)以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)2－ΔΔCt法測(cè)定NPY、AGRP、POMC及CRH mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以珋x±s表示，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組攝食量分別為( 4.63±0.17)、( 4.51±0.12) g，兩組比較，P＞0.05。兩組下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達(dá)比較見(jiàn)表1。

表1　兩組下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達(dá)比較(±s)

表1　兩組下丘腦組織NPY、AGRP、CRH、POMC mRNA表達(dá)比較(±s)

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別NPY mRNA AGRP mRNA POMC mRNA CRH mRNA實(shí)驗(yàn)組　0.47±0.24　 24.31±6.21　 0.92±0.48 0.93±0.45*對(duì)照組0.48±0.29　 22.01±7.14　 0.83±0.16 0.69±0.12

3　討論

下丘腦是哺乳動(dòng)物調(diào)控食欲的基本部位，其內(nèi)存在食欲調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞群，構(gòu)成弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、室旁核、視交叉上核等，合稱(chēng)為食欲中樞。由于弓狀核血腦屏障相對(duì)薄弱，故成為中樞與外周循環(huán)食欲因子交換信息的重要通路。弓狀核主要合成NPY、AGRP、POMC和α-促黑素。CRH主要由下丘腦室旁核的小細(xì)胞合成。其中NPY及AGRP為促食欲調(diào)節(jié)因子，而CRH及POMC為抑制食欲因子［1］。能量攝入與消耗的精細(xì)平衡是保持正常體質(zhì)量的關(guān)鍵。脂肪組織分泌脂肪因子與下丘腦“對(duì)話(huà)”，通過(guò)控制攝食、影響食欲對(duì)能量代謝產(chǎn)生重要中樞調(diào)節(jié)作用。外周食欲調(diào)節(jié)因素可通過(guò)多種途徑參與食欲中樞的調(diào)節(jié)［2］。小鼠腦室和外周靜脈注射生長(zhǎng)激素釋放肽( ghrelin)可強(qiáng)烈刺激小鼠食欲，減少能量消耗，且ghrelin增強(qiáng)食欲作用與增加AGRP的表達(dá)有關(guān)［3］。瘦素與受體結(jié)合作用于下丘腦飽食中樞，可抑制NPY的釋放，從而降低食欲;還可與POMC上的瘦素受體結(jié)合增加促黑激素的釋放，從而抑制進(jìn)食［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素缺乏小鼠出現(xiàn)弓狀核區(qū)的AMPK磷酸化減弱、食物攝取減少等現(xiàn)象。

omentin是特異性表達(dá)于網(wǎng)膜脂肪組織的脂肪細(xì)胞因子［6］。在人類(lèi)，omentin基因位于1q22-q23染色體區(qū)域，該區(qū)域與2型糖尿病有關(guān)。超重及肥胖者血漿omentin水平較正常體質(zhì)量者降低，且血漿omentin水平與BMI、腰圍、瘦素水平、HOMA-IR呈負(fù)相關(guān)，與脂聯(lián)素及HDL-C呈正相關(guān)，且血漿omentin水平在體質(zhì)量減輕后升高［7］。大鼠下丘腦注射omentin后其1 d的攝食量無(wú)顯著影響，同時(shí)AGRP、NPY、食欲素A、可卡因-安非他明調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽( CART)、CRH及POMC基因表達(dá)無(wú)變化［8］。腹腔內(nèi)注射omentin后10～14 d，大鼠的攝食量明顯增加，且自第12天開(kāi)始大鼠的體質(zhì)量顯著增加，CART及CRH基因表達(dá)下降［9］。

參考國(guó)外文獻(xiàn)，本研究中小鼠下丘腦注射劑量依據(jù)體表面積換算得出。本研究結(jié)果表明，向小鼠側(cè)腦室注射omentin后小鼠短期攝食量未發(fā)生改變，這可能與觀察時(shí)間較短有關(guān)。與既往研究［8，9］結(jié)果不同，本實(shí)驗(yàn)小鼠側(cè)腦室注入omentin后下丘腦24 h CRH mRNA表達(dá)水平增加。CRH為抑制食欲因子，omentin引起CRH基因表達(dá)發(fā)生變化，這與肥胖者omentin水平降低的研究結(jié)果相一致。提示omentin具有中樞抑制食欲作用。食欲調(diào)節(jié)是一個(gè)非常復(fù)雜且精細(xì)的過(guò)程，需要諸多因子共同參與，omentin在中樞有無(wú)受體，其如何作用于CRH，是否與其他核團(tuán)或神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生聯(lián)系，尚需進(jìn)一步研究。

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·臨床研究·

收稿日期:( 2015-06-18)

通信作者:承解靜

基金項(xiàng)目:上海市教委預(yù)算內(nèi)科研項(xiàng)目( 2012JW65)。

文章編號(hào):1002-266X( 2015)31-0037-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類(lèi)號(hào):R338.27

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.31.014