子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個核細胞Fas的表達及意義

劉洪正，　王玉亮

子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個核細胞Fas的表達及意義

劉洪正1，王玉亮2

(1. 天津市濱海新區(qū)漢沽中醫(yī)醫(yī)院檢驗科，天津 300480；

2. 天津市第一中心醫(yī)院檢驗科衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室，天津 300192)

摘要：目的探討子宮內(nèi)膜異位癥與Fas介導的腹腔液單個核細胞凋亡的關(guān)系。方法選取手術(shù)后病理證實為子宮內(nèi)膜異位癥的患者55例作為子宮內(nèi)膜異位癥組，以非子宮內(nèi)膜異位癥患者52例作為對照組，分離腹腔液單個核細胞，應用實時逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定Fas mRNA的表達水平，應用流式細胞術(shù)定量檢測Fas表達細胞百分率。結(jié)果子宮內(nèi)膜異位癥組腹腔液單個核細胞Fas mRNA及Fas表達細胞百分率明顯高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)as mRNA及Fas表達細胞百分率在子宮內(nèi)膜異位癥組Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期中表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個核細胞Fas表達異常，對子宮內(nèi)膜異位癥具有一定的作用。

關(guān)鍵詞：Fas；單個核細胞；腹腔液；子宮內(nèi)膜異位癥

Expression of Fas in peritoneal fluid mononuclear cells among endometriosis patients and its significanceLIUHongzheng1，WANGYuliang2

.(1.DepartmentofClinicalLaboratory,HanguChineseMedicineHospitalofTianjinBinhaiNewArea,Tianjin300480,China; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,TianjinFirstCentralHospital,KeyLaboratoryforCriticalCareMedicineoftheMinistryofHealth,Tianjin300192,China)

Abstract:Objective To investigate the relationship of Fas expression in peritoneal fluid mononuclear cells and endometriosis. MethodsA total of 55 patients with histopathologically diagnosed endometriosis after operation were enrolled as endometriosis group, and 52 patients without endometriosis were enrolled as control group. The peritoneal fluid mononuclear cells were isolated, the expression levels of Fas mRNA were determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction(RT-PCR), and the percentage of Fas expression cells were quantitatively detected by flow cytometry. ResultsFas mRNA and the percentage of Fas expression cells were significantly higher in endometriosis group than those in control group(P<0.05). There was no statistical significance between stage Ⅰ-Ⅱand stage Ⅲ-Ⅳ(P>0.05). ConclusionsThe abnormal Fas expression in peritoneal fluid mononuclear cells may play an important role in endometriosis.

Key words:Fas; Mononuclear cell; Peritoneal fluid; Endometriosis

細胞凋亡是機體清除感染、變異、衰老的細胞，維持自身正常生理平衡的一種調(diào)節(jié)方式。Fas/FasL是引起細胞凋亡的重要通路之一，也是殺傷性T淋巴細胞殺傷靶細胞的三大途徑之一[1]。Fas/FasL系統(tǒng)對于正常人體的發(fā)育、器官分化、免疫調(diào)節(jié)等一系列重要生理功能都是必不可少的，其異常與腫瘤、自身免疫疾病、移植排斥等發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[2-4]。子宮內(nèi)膜異位癥多發(fā)生于育齡期婦女，近年來發(fā)病有明顯上升趨勢[5]，其發(fā)病機制尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者與正常人內(nèi)膜細胞的凋亡率存在顯著差異，異位的子宮內(nèi)膜細胞表現(xiàn)過度增殖及凋亡異?？赡苁亲訉m內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展的重要原因之一[6]。我們通過檢測子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個核細胞Fas的表達水平，探討Fas介導的腹腔液單個核細胞凋亡在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用。

材料和方法

一、材料

1. 研究對象選取2010至2014年上半年在天津市濱海新區(qū)漢古中醫(yī)院、天津市第一中心醫(yī)院婦科行腹腔鏡或開腹手術(shù)并術(shù)后經(jīng)病理證實的子宮內(nèi)膜異位癥患者55例作為子宮內(nèi)膜異位癥組，平均年齡(36±6)歲；用修訂后的美國生育協(xié)會內(nèi)異癥分期評分法對子宮內(nèi)膜異位癥組患者進行分期，38例為Ⅰ～Ⅱ期(輕度內(nèi)異癥組)，17例為Ⅲ～Ⅳ期(重度內(nèi)異癥組)。選取同期住院行腹腔鏡手術(shù)的非子宮內(nèi)膜異位癥患者52例作為對照組，無盆腔炎癥，平均年齡(34±6)歲。兩組采樣前3個月均未接受激素類藥物治療，年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者進行知情告知并簽署知情同意書。

2. 標本收集子宮內(nèi)膜異位癥組與對照組于術(shù)中無菌吸取子宮直腸陷凹處的腹腔液，注意操作時避免血液流入腹腔，有血液污染則棄去不用，分別分離出腹腔液單個核細胞。

3. 試劑與儀器總RNA抽提試劑TRIzol(美國GIBCO-BRL公司)，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國Promega公司)，聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)，F(xiàn)as、β-actin引物序列(美國Applied Biosystems公司)，異氰酸熒光素(FITC)-小鼠抗人Fas單克隆抗體(美國Becton Dickinson公司)，ABI 7300 PCR擴增儀(美國ABI公司)，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

二、方法

1. 腹腔液單個核細胞表面Fas分子的定量檢測[7]將采集的腹腔液經(jīng)淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，加入熒光素異氰酸熒光素(FITC)-小鼠抗人Fas單克隆抗體，孵育30 min，用PBS洗滌2次后制成懸液，采用流式細胞術(shù)測定并計算Fas表達細胞的百分率。

2. 腹腔液單個核細胞FasmRNA的檢測采用實時逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR測定FasmRNA。采用TRIzol法提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄酶說明書操作合成cDNA。Fas上游引物序列：5′-AAGACTGTTACTACAGTTG-3′，下游引物序列：5′-GCTTATGGCAGAATTGGCCA-3′；β-actin上游引物序列：5′-GATGGCCACGGCTGCTT-3′，下游引物序列：5′-ACCGCTCATTGCCAATGGT-3′；實時熒光PCR擴增：反應體系為10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP 0.5 μL，20×SYBR Green Ⅰ液1 μL，Taq酶1 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL，加去離子水至25 μL。反應條件為93℃ 2 min，然后93℃ 60 s，50℃ 60 s，72℃ 60 s，40個循環(huán)；72℃延伸10 min。為消除標本處理、逆轉(zhuǎn)錄和PCR的差異，以2-ΔCt表示Fas mRNA的相對表達水平,其中ΔCt=CtFas-Ctβ-actin。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié)果

一、子宮內(nèi)膜異位癥組和對照組腹腔液單個核細胞FasmRNA及Fas表達細胞百分率的比較

子宮內(nèi)膜異位癥組腹腔液單個核細胞FasmRNA的表達水平及Fas表達細胞百分率均明顯高于對照組(P均<0.05)，見表1。

二、子宮內(nèi)膜異位癥Ⅰ～Ⅱ期與Ⅲ～Ⅳ期腹腔液單個核細胞FasmRNA表達水平及Fas表達細胞百分率的比較

Ⅰ～Ⅱ期子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個核細胞FasmRNA表達水平及Fas表達細胞百分率與Ⅲ～Ⅳ期患者比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　兩組腹腔液單個核細胞Fas mRNA

注：與對照組比較，*P<0.05

討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見良性卻有惡性行為的婦科疾病，近年來發(fā)病有明顯上升趨勢[8]。研究證實子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生與細胞免疫密切相關(guān)，主要表現(xiàn)在巨噬細胞、自然殺傷細胞、殺傷性T淋巴細胞對于異位內(nèi)膜細胞的殺傷活性降低，從而降低了機體對異位子宮內(nèi)膜的免疫監(jiān)視、識別和破壞，不能有效阻止異位內(nèi)膜細胞在腹腔中的種植及生長，促進了內(nèi)膜異位病灶的形成[9]。

Fas是一種相對分子質(zhì)量為48 000的 Ⅰ型跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，為介導細胞凋亡的重要膜表面死亡分子。FasL為Fas的配體。當免疫活性細胞表面的膜分子FasL與靶細胞上的Fas結(jié)合后，啟動凋亡信號的跨膜傳遞，F(xiàn)as分子胞漿段內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白結(jié)合，并激活天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)8，形成死亡誘導信號復合物，進而導致caspase3的激活和一系列的級聯(lián)反應，從而啟動表達Fas細胞的凋亡[10]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥患者內(nèi)膜細胞與正常人內(nèi)膜細胞凋亡率有明顯差異，常伴有異位內(nèi)膜細胞Fas表達缺失、異位內(nèi)膜細胞凋亡降低以及腹腔淋巴細胞凋亡升高[11]。本研究結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液單個核細胞FasmRNA及Fas表達細胞百分率明顯升高，但與臨床分期無關(guān)。當這些表達Fas的免疫細胞與表達FasL的異位內(nèi)膜細胞結(jié)合后，可能會激活Fas/FasL凋亡信號傳導途徑，進而使高表達Fas的免疫細胞發(fā)生凋亡，從而影響了微環(huán)境的免疫防御機制。因此，免疫細胞無法殺傷內(nèi)膜增生細胞，為異位內(nèi)膜細胞的種植和生長提供有利條件，使逆流至腹腔中的內(nèi)膜細胞逃避免疫殺傷而易于存活[12]。而表達FasL的腹腔液淋巴細胞也可通過旁分泌形式導致相鄰的Fas陽性淋巴細胞凋亡，也可通過自分泌形式自殺，使免疫監(jiān)視、免疫殺傷功能減弱而不能有效地清除異位內(nèi)膜細胞。因此，F(xiàn)as/FasL引起的腹腔液免疫細胞凋亡可能在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

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(本文編輯：儲怡星)

收稿日期：(2014-12-12)

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)05-0454-03R446.1

文獻標志碼：ADOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.05.011

通訊作者：王玉亮，聯(lián)系電話：022-23728992。

作者簡介：劉洪正，男，1966年生，主管技師，主要從事臨床免疫檢驗工作。