COMP特異性單抗15A11的表位特征研究①

王瑞玲　韓　冬　韓魏巍　鄧靈福　袁永澤　熊　麗　劉德立　耿　輝

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430079)

[摘　要]　目的：鑒定RA相關(guān)自身抗原COMP的一株特異性單克隆抗體15A11的表位特征。方法：選用隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)對(duì)mAb 15A11進(jìn)行三輪篩選，隨機(jī)挑取40個(gè)單噬菌斑，提取DNA，測(cè)序；ELISA檢測(cè)每個(gè)噬菌體克隆與mAb 15A11結(jié)合的特異性；通過(guò)ClustalW2對(duì)特異性結(jié)合的噬菌體展示的十二肽和COMP進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，PyMOL分析一致氨基酸所在肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)及表位氨基酸之間的距離，初步確定mAb 15A11的表位；變性和非變性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定表位序列。結(jié)果：得到的40個(gè)測(cè)序噬菌體中，共有5個(gè)噬菌體克隆，ELISA確定克隆1和克隆2與mAb 15A11特異性結(jié)合，其他克隆均為非特異性結(jié)合的噬菌體；氨基酸序列比對(duì)，在COMP上未發(fā)現(xiàn)與克隆1和克隆2噬菌體相同的連續(xù)氨基酸序列，提示mAb 15A11的抗原表位可能為非線性表位；PyMOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距離，顯示構(gòu)象表位的合理性；變性Western blot分析為陰性，而非變性Western blot條件下為陽(yáng)性；EDTA螯合Ca2+破壞COMP的構(gòu)象后不能與mAb 15A11結(jié)合，而未經(jīng)處理的與mAb 15A11結(jié)合，均說(shuō)明mAb 15A11表位是構(gòu)象表位；合成多肽與mAb 15A11的ELISA結(jié)果進(jìn)一步確定了mAb 15A11的構(gòu)象表位序列。結(jié)論：鑒定了mAb 15A11的表位是構(gòu)象表位序列，且確定了該構(gòu)象表位的氨基酸組成，為研究COMP抗體與抗原反應(yīng)機(jī)制具有重要理論價(jià)值，并對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)有重要應(yīng)用意義。

[關(guān)鍵詞]　COMP；單克隆抗體；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；噬菌體展示技術(shù)；表位

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.006

COMP特異性單抗15A11的表位特征研究①

王瑞玲韓冬韓魏巍鄧靈福袁永澤熊麗劉德立耿輝

(華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北省遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢430079)

[摘要]目的：鑒定RA相關(guān)自身抗原COMP的一株特異性單克隆抗體15A11的表位特征。方法：選用隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)對(duì)mAb 15A11進(jìn)行三輪篩選，隨機(jī)挑取40個(gè)單噬菌斑，提取DNA，測(cè)序；ELISA檢測(cè)每個(gè)噬菌體克隆與mAb 15A11結(jié)合的特異性；通過(guò)ClustalW2對(duì)特異性結(jié)合的噬菌體展示的十二肽和COMP進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，PyMOL分析一致氨基酸所在肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)及表位氨基酸之間的距離，初步確定mAb 15A11的表位；變性和非變性Western blot、EDTA螯合Ca2+后ELISA分析以及合成多肽的ELISA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定表位序列。結(jié)果：得到的40個(gè)測(cè)序噬菌體中，共有5個(gè)噬菌體克隆，ELISA確定克隆1和克隆2與mAb 15A11特異性結(jié)合，其他克隆均為非特異性結(jié)合的噬菌體；氨基酸序列比對(duì)，在COMP上未發(fā)現(xiàn)與克隆1和克隆2噬菌體相同的連續(xù)氨基酸序列，提示mAb 15A11的抗原表位可能為非線性表位；PyMOL分析表位氨基酸在COMP上的定位及距離，顯示構(gòu)象表位的合理性；變性Western blot分析為陰性，而非變性Western blot條件下為陽(yáng)性；EDTA螯合Ca2+破壞COMP的構(gòu)象后不能與mAb 15A11結(jié)合，而未經(jīng)處理的與mAb 15A11結(jié)合，均說(shuō)明mAb 15A11表位是構(gòu)象表位；合成多肽與mAb 15A11的ELISA結(jié)果進(jìn)一步確定了mAb 15A11的構(gòu)象表位序列。結(jié)論：鑒定了mAb 15A11的表位是構(gòu)象表位序列，且確定了該構(gòu)象表位的氨基酸組成，為研究COMP抗體與抗原反應(yīng)機(jī)制具有重要理論價(jià)值，并對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)有重要應(yīng)用意義。

[關(guān)鍵詞]COMP；單克隆抗體；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；噬菌體展示技術(shù)；表位

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.006

中圖分類號(hào)①本文受湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2014CFA079 ) 和國(guó)家自然科學(xué)基金(No.30972693，21473065)資助。

作者簡(jiǎn)介：王瑞玲(1990年-)，女,主要從事免疫耐受與耐受失調(diào)研究，E-mail:ruilingWangss@163.com。

通訊作者及指導(dǎo)教師：耿輝(1971年-)，女,博士后,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事免疫耐受與耐受失調(diào)研究，E-mail:genghui@mail.ccnu.edu.cn。

[Abstract]Objective:To identify the epitope of mAb15A11 which is specific against RA associated autoantigen cartilage oligomeric matrix protein(COMP).Methods: A filamentous phage library displaying random linear dodecapeptides was used to mapping the epitope of mAb15A11.After three rounds of screenings,40 phage clones were selected at random and sequenced.The specificity of phages was confirmed by enzyme immunoassays.Homology search by ClustalW2 and structure analysis by PyMol to identified the epitope amino acid sequence.Western blot analysis of COMP and ELISA analysis of COMP-derived peptides were used to confirm epitope′s characterization.Results: After repeated screenings using bio-panning method,2 clones were identified,which interacted specifically with mAb 15A11.Homology search did not find succession consensus sequence within COMP molecular,which indicated that the epitope was not linear.PyMol Structure analysis identified the rationality of conformational epitope.Western blot analysis and ELISA of EDTA-treated COMP further prove an conformational structure of the epitope recognized by mAb 15A11.ELISA analysis of COMP-derived peptides demonstrated both disulfide bonds between229C-243C and237C-253C and every epitope amino acid of232G,238H,240H,241A,244V,247R and251R were essential to the binding of mAb 15A11 with COMP.Conclusion: In this study,the potential B cell antigentic epitopes of mAb 15A11 was identified by phage display library.The epitope amino acids sequence and characterization were also recognized.It may have important theoretical value for the study of reaction mechanism of COMP antibody and antigen and may also show application significance in the detection of rheumatoid arthritis.

Identification of epitope recognized by mAb 15A11 sepecific against cartilage oligomeric matrix protein

WANGRui-Ling，HANDong，HANWei-Wei，DENGLing-Fu,YANGYong-Ze,XIONGLi,LIUDe-Li,GENGHui.CollegeofLifeScience,HuazhongNormalUniversity,HubeiKeyLaboratoryofGeneticRegulationandIntegrativeBiology,Wuhan430079,China

[Key words]Cartilage oligomeric matrix protein;Monoclonal antibody;Rheumatoid arthritis;Phage display;Antigenic epitope

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種自身免疫性疾病，具有慢性、多發(fā)性、進(jìn)行性、侵襲性特點(diǎn)，主要臨床表現(xiàn)為：關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)外病變。它由滑膜巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞的復(fù)合作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕性炎癥的發(fā)生[1]。與RA相關(guān)的蛋白質(zhì)包括軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(Cartilage oligomeric matric protein，COMP)、蛋白聚糖、Ⅱ/Ⅸ/Ⅺ型膠原蛋白、纖維蛋白原、α-烯醇化酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶及波形蛋白，而且這些RA相關(guān)自身抗原與HLA-DR4的結(jié)合有關(guān)[2，3]。

COMP是一種鈣結(jié)合糖蛋白，為主要在軟骨中表達(dá)的組織特異性非膠原蛋白，有研究表明它也在肌腱、半月板以及滑膜中表達(dá)[4]。它是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，在細(xì)胞的行為和軟骨形成中起到重要作用[5,6]。目前研究發(fā)現(xiàn)，COMP是RA相關(guān)的自身抗原[1，7]。COMP免疫引起的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)和人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相似?？笴OMP血清轉(zhuǎn)移及COMP特異性單抗過(guò)繼性輸注能夠?qū)е率荏w鼠發(fā)生急性關(guān)節(jié)炎癥。我們最近制備并鑒定了一株導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的單克隆抗體15A11,初步鑒定它識(shí)別COMP的EGF4-Like結(jié)構(gòu)域。

蛋白質(zhì)表位是蛋白質(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，深入研究抗原表位對(duì)于設(shè)計(jì)多肽和新型疫苗以及開(kāi)發(fā)診斷試劑具有重要意義。B細(xì)胞表位研究方法包括理論預(yù)測(cè)和實(shí)驗(yàn)鑒定。最經(jīng)典的表位預(yù)測(cè)參數(shù)為Hopp等[8]學(xué)者在20世紀(jì)80年代提出的親水性參數(shù)及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方案等[9]。它們單獨(dú)應(yīng)用時(shí)準(zhǔn)確率低，有一定的局限性?，F(xiàn)在廣泛使用的很多預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位的網(wǎng)站或者軟件都是基于綜合多種參數(shù)或方案的預(yù)測(cè)模式，如ABCpred、Bcepred、DiscoTope、EPSVR、Ellipro、BepiPred、CEP等[10-16]。雖然可以通過(guò)表位預(yù)測(cè)使表位研究過(guò)程有效的簡(jiǎn)化，但還需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其真實(shí)性。研究B細(xì)胞表位的實(shí)驗(yàn)方法有肽庫(kù)途徑、核磁共振光譜(NMR)、表面等離子共振(SPR)、化學(xué)裂解法或生物酶解法、雜交肽裂解法、肽序列掃描法、肽芯片高通量篩選法[17-23]。肽庫(kù)途徑包括噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)和有機(jī)合成肽庫(kù)法，與生物肽庫(kù)相比，有機(jī)合成肽庫(kù)法，包括氨基酸序列分析在內(nèi)，其成本很高而且不能擴(kuò)增以及重復(fù)使用。因此，噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)展示技術(shù)最廣泛應(yīng)用于肽庫(kù)途徑[24]。噬菌體展示技術(shù)被證明是確定酶、蛋白質(zhì)甚至非蛋白質(zhì)的配體，抗體表位的有力工具[25，26]。本文首先通過(guò)噬菌體展示技術(shù)確定了mAb 15A11的抗原表位以及在COMP中的構(gòu)象狀態(tài)，用PyMol分析一致氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)及表位氨基酸之間的距離，再經(jīng)變性、非變性Western blot以及合成多肽的ELISA實(shí)驗(yàn)法進(jìn)一步確定表位序列。本文為研究COMP抗體與抗原反應(yīng)機(jī)制具有重要理論價(jià)值，并對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)有重要應(yīng)用意義。

1材料與方法

1.1材料隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)購(gòu)自New England Biolabs。四環(huán)素購(gòu)自大連寶生物，Eag I-HF、Kpn I-HF購(gòu)自NEB(北京)、抗-M13抗體購(gòu)自GE Healthcare。羊抗鼠 IgG-HRP 酶標(biāo)二抗購(gòu)自 Sigma。預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自Fermentas。PVDF膜購(gòu)自Amersham。Taq-mix、DNA Marker及蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker購(gòu)自東盛生物。回收試劑盒購(gòu)自博大泰克。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。COMP蛋白的晶體結(jié)構(gòu)來(lái)自于PDB 數(shù)據(jù)庫(kù),登錄號(hào):3FBY。

1.2方法

1.2.1mAb 15A11的純化及重組COMP蛋白的制備實(shí)驗(yàn)室早期制備的抗-COMP mAb 15A11的雜交瘤細(xì)胞并得以鑒定[27]，復(fù)蘇冰凍細(xì)胞，并在加入10%低-IgG胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37℃，5% CO2)。上清用蛋白G柱層析分離并純化mAb 15A11。ELISA測(cè)定其效價(jià)，并用Nano drop 測(cè)定抗體的濃度。按照先前的方法制備重組COMP蛋白[27，28]。

1.2.2噬菌體滴度測(cè)定在微量離心管中加入對(duì)數(shù)期宿主菌ER2738 200 μl，分別加入10 μl不同稀釋度的噬菌體，快速震蕩混勻，室溫下溫育1~5 min；將感染細(xì)胞迅速加入預(yù)溫的頂層瓊脂培養(yǎng)管中，快速搖勻，立即注倒于37 ℃預(yù)溫的LB/IPTG/Xgal平板上。倒置于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；對(duì)平板上生長(zhǎng)出的噬菌斑計(jì)數(shù)，乘以稀釋因子，得到每10 μl噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度，計(jì)算得出噬菌體的滴度。

1.2.3隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)的篩選用10 μg/ml mAb 15A11包被96孔板，4℃孵育過(guò)夜，挑取ER 2738單克隆于10 ml LB+Tet 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床中過(guò)夜培養(yǎng)；倒掉包被液，用力拍甩除去殘余的溶液；加封阻緩沖液[(0.1 mol/L NaHCO3,5 g/L 牛血清白蛋白(BSA),0.2 g/L NaN3,pH8.6]，4℃封閉2 h；除去封阻液，用0.1 % TBST[TBS+0.1 %(v/v)Tween-20]緩沖液快速洗板6次；加入100倍稀釋的原始噬菌體文庫(kù)(1.5 ×1013pfu/ml)100 μl，溫和搖動(dòng)60 min；吸去未結(jié)合噬菌體，TBST緩沖液洗板10次；加入100 μl非特異性緩沖液[0.2 mol/L Glycine-HCl(pH2.2),1 mg/ml BSA]96孔板，溫和搖動(dòng)10~20 min，收集洗脫液加入15 μl 1 mol/L HCl(pH9.1)中和。取2 μl洗脫液用于滴度測(cè)定，其余噬菌體加入處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的宿主菌ER2738中，37℃劇烈搖動(dòng)(250 r/min)培養(yǎng)4.5~5 h進(jìn)行擴(kuò)增；擴(kuò)增噬菌體轉(zhuǎn)入滅菌大離心管中，于冷凍離心機(jī)4℃ 12 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)入另一滅菌的離心管，再次離心以除去殘留的沉淀，80%上清液轉(zhuǎn)入新鮮無(wú)菌的大離心管，加入體積為上清液1/6體積的20% PEG/2.5 mol/L NaCl，4 ℃沉淀過(guò)夜；4℃12 000 r/min離心15 min，棄上清，得到噬菌體沉淀。TBS溶液重懸噬菌體沉淀，轉(zhuǎn)入微量離心管4℃，14 000 r/min離心5 min，除去殘留細(xì)胞沉淀；上清液轉(zhuǎn)入新微量離心管，加入1/6體積的20%PEG/2.5 mol/L NaCl，冰上孵育60 min；4℃,14 000 r/min離心10 min，棄上清，200 μl TBS重懸噬菌體，離心除去所有殘余的不溶物沉淀，上清即為擴(kuò)增的洗脫物。10 μg/ml mAb 15A11重新包被96孔板，進(jìn)行噬菌體的第二輪和第三輪篩選。第二輪洗脫液為T(mén)BST+0.3% Tween，第三輪洗脫液為T(mén)BST+0.5% Tween，其余方法步驟均與第一輪篩選相同。第三輪噬菌體洗脫物的滴度測(cè)定時(shí)得到的LB/IPTG/Xgal平板的噬菌斑，4℃貯存，用于測(cè)序。

1.2.4噬菌斑測(cè)序模板的快速純化收集1 000 μl含噬菌體的上清液，加入400 μl 20% PEG/2.5 mol/L NaCl，顛倒混勻，室溫靜置10~20 min；14 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清；噬菌體沉淀用100 μl碘化物緩沖液徹底重懸，加入250 μl乙醇，顛倒混勻，室溫溫育10 min，14 000 r/min 4 ℃離心10 min，棄上清，沉淀中含有單鏈?zhǔn)删wDNA。用0.5 ml冰育的70% 乙醇洗沉淀，重新離心，除上清，室溫干燥。沉淀的DNA用30 μl滅菌ddH2O重懸，取1 μl DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)噬菌體DNA是否提取成功，片段大小及純度，以便測(cè)序。

1.2.5噬菌斑DNA序列測(cè)定選用New England Biolabs試劑盒中提供的-96 gIII測(cè)序引物：5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′,送至金斯瑞生物公司進(jìn)行自動(dòng)測(cè)序。

1.2.6噬菌體ELISA擴(kuò)增噬菌體克隆，對(duì)每個(gè)克隆進(jìn)行滴度測(cè)定。100 μg/ml 的mAb 15A11包被96孔板，4℃過(guò)夜。除去多余靶分子，加封阻液，置于室溫1~2 h；甩出封阻液，TBS/Tween洗板6次，Tween濃度與淘選清洗步驟中所用濃度相同；分別將稀釋好的100 μl含有1011、109、107個(gè)病毒粒子的TBS 以及空M13噬菌體分別加入包被孔，及未包被有靶分子的孔中，室溫震蕩作用1-2 hrs。TBST洗板6次；以1∶5 000的比例用封阻液稀釋HRP標(biāo)記的抗-M13抗體，每孔加入200 μl稀釋抗體，4 ℃孵育1 h；1×TBS/Tween洗板6次；每孔加入200 μl堿性磷酸酶和四甲基聯(lián)苯胺為底物，室溫避光孵育15 min，每孔加入25 μl 2 mol/L H2SO4，用酶標(biāo)儀讀取450 nm處的吸光值。

1.2.7噬菌體插入十二肽序列在COMP上的定位及結(jié)構(gòu)分析篩選的噬菌體克隆通過(guò)測(cè)序找出一致序列，并將一致序列通過(guò)噬菌體ELISA確定其結(jié)合的特異性，對(duì)于特異性結(jié)合的噬菌體，用在線生物軟件ClustalW2對(duì)篩選噬菌體的插入十二肽與COMP進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，PyMol對(duì)可能的表位氨基酸進(jìn)行COMP定位，并分析氨基酸所在肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)及氨基酸之間的距離。

1.2.8Western blot分析(1)變性Western blot：分別制備12%的分離膠和5%的濃縮膠；取重組COMP蛋白5 μl，加入蛋白質(zhì)變性緩沖液混合，沸水浴10 min，再冰浴2 min；取10 μl樣品及5 μl預(yù)染蛋白Marker 分別點(diǎn)樣，用80 V電壓電泳30 min，至指示帶到達(dá)分離膠，調(diào)節(jié)電壓至120 V，繼續(xù)電泳90 min，待指示帶到達(dá)分離膠底部而且預(yù)染蛋白Marker中的條帶分離后停止電泳；轉(zhuǎn)膜；封閉1 h，用TBST洗3次，每次5 min，與1∶200比例稀釋的COMP的單克隆抗體 mAb 15A11孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，與1∶200比例稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗孵育1 h，TBST洗3次，加入底物DAB孵育15 min指示條帶的位置。

(2)非變性Western blot制備8 %的分離膠和5 %的濃縮膠；取COMP蛋白5 μl(在檢測(cè)Ca2+對(duì)COMP構(gòu)象的影響時(shí)，COMP一組經(jīng)EDTA處理，一組未經(jīng)處理)，加入蛋白質(zhì)非變性緩沖液(4×)，電泳除了加入的電泳緩沖液為未加SDS的非變形電泳緩沖液，轉(zhuǎn)膜時(shí)用未加SDS的轉(zhuǎn)膜緩沖液轉(zhuǎn)膜2.5 h，其余條件和方法與變性Western blot相同。

1.2.9合成多肽氨基酸序列比對(duì)初步確定的一致序列，在強(qiáng)耀生物公司通過(guò)SYMPHONY 12-通道肽合成儀(Protein Technologies Inc，Tucson,USA)用基于fluorenylmethoxycarbonyl的化學(xué)方法來(lái)合成，末端氨基酸通過(guò)Gly-Gly-Gly與生物素連接。粗產(chǎn)品在C18柱子(30*250 mm;Venusi MRC-ODS C18)上用反向高壓液相色譜純化，用含有0.1%三氟乙酸的乙腈-水洗脫，最終成分經(jīng)過(guò)質(zhì)譜分析和氨基酸分析。

1.2.10多肽ELISA 1.5 μg/ml的生物素化的合成多肽加入5 μg/ml鏈霉親和素包被的96孔板，4 ℃包被過(guò)夜，封阻緩沖液封閉2 h；TBST洗板6次；加入1∶200的比例稀釋mAb 15A11，結(jié)合的mAb 15A11通過(guò)羊抗鼠HRP-酶連IgG多克隆抗體檢測(cè)，方法與噬菌體ELISA相同。

2結(jié)果

2.1mAb 15A11的合成及純化復(fù)蘇抗-COMP mAb 15A11的雜交瘤細(xì)胞，置于10%低-IgG胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集上清液經(jīng)蛋白G柱層析分離并純化得到mAb 15A11，免疫印跡檢測(cè)其與COMP結(jié)合的特異性(結(jié)果未顯示)。并測(cè)定抗體的濃度約為1 mg/ml。

2.2隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)的篩選結(jié)果用mAb 15A11對(duì)隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)進(jìn)行連續(xù)三輪篩選，每一輪篩選后均測(cè)定洗脫噬菌體的滴度，并測(cè)定第一輪和第二輪洗脫噬菌體擴(kuò)增后的滴度，即為第二輪和第三輪噬菌體篩選時(shí)加入噬菌體的滴度，表1顯示隨著噬菌體篩選輪數(shù)的增加，富集度逐漸增加，說(shuō)明特異性結(jié)合的噬菌體得到很好的富集。

2.3mAb 15A11篩選噬菌體展示的十二肽先找出測(cè)序噬菌體DNA的KpnⅠ以及EagⅠ的酶切位點(diǎn)，再?gòu)幕パa(bǔ)鏈的5′-3′方向，找到GGCCGA核苷酸序列，其隨后的3′方向的序列即為包括間隙中三個(gè)Gly以及插入十二肽在內(nèi)的十五肽序列，用EditSeq將序列反轉(zhuǎn)，并翻譯成氨基酸序列，通過(guò)三輪噬菌體的親和篩選，得到五個(gè)克隆，獲得十二肽的氨基酸序列如表2所示。結(jié)果顯示，測(cè)序的40個(gè)噬菌體克隆中，GLHTSATNLYLH出現(xiàn)了28次，HLFNHNKNLP KR出現(xiàn)了8次，其他噬菌體克隆的氨基酸序列僅出現(xiàn)1~2次。

2.4篩選噬菌體與mAb 15A11結(jié)合特異性通過(guò)ELISA鑒定篩選得到的5個(gè)噬菌體克隆與mAb15A11的結(jié)合特異性，用不包被任何抗體的孔作為對(duì)照組。圖1顯示，展示GLHTSATNLYLH氨基酸序列的G1噬菌體(圖1A)、展示HLFNHNKNLPKR氨基酸序列的G2噬菌體(圖1B)與mAb 15A11相對(duì)結(jié)合能力明顯高于沒(méi)有插入任何肽的空M13噬菌體，以及未包被任何抗體的陰性對(duì)照組，且此兩個(gè)噬菌體克隆均為濃度依賴型，隨著噬菌體濃度的增加，與mAb 15A11結(jié)合力增強(qiáng)，說(shuō)明G1和G2與mAb 15A11是特異性結(jié)合的，并且雖然G2克隆較少，但是其與 mAb 15A11的結(jié)合能力更強(qiáng)。而G3、G4、G5噬菌體克隆的結(jié)合能力和空M13噬菌體以及陰性對(duì)照均較弱，說(shuō)明G3、G4、G5均為非特異性結(jié)合噬菌體。結(jié)果初步表明，G1和G2展示的十二肽是mAb 15A11結(jié)合的表位序列。

表1　mAb 15A11篩選噬菌體的投入/產(chǎn)出率Tab.1　Ratio of input/output of biopanning with mAb 15A11

表2　mAb 15A11篩選噬菌體展示的十二肽Tab.2　mAb 15A11-binding peptides selected from random phage-displayed library

圖1　篩選噬菌體與mAb 15A11結(jié)合的特異性Fig.1　Binding specificity of selected phages with mAb 15A11 in ELISA

2.5mAb 15A11結(jié)合表位在COMP上的定位我們?cè)缙诘难芯勘砻?，mAb 15A11的結(jié)合表位在COMP的EGF-Like4結(jié)構(gòu)域[28]，從UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)獲得該結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，并與P1和P2進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，圖2A表明，P1和P2與COMP的EGF-Like4結(jié)構(gòu)域雖有相同氨基酸(紅色表示)以及性質(zhì)相同的氨基酸(綠色表示)，但未發(fā)現(xiàn)連續(xù)的一致氨基酸序列，提示mAb 15A11的表位是非線性表位。從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到COMP蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(登錄號(hào):3FBY)，用PyMol將相同或性質(zhì)相似的氨基酸定位到COMP分子上，圖2B和2C顯示該七個(gè)氨基酸從不同角度觀察的結(jié)果，綠色表示232G、藍(lán)綠色表示238H、藍(lán)色表示240H、紅色表示241A、淡藍(lán)色表示244V、洋紅色表示247R、橘紅色表示251R?？梢钥闯觯@七個(gè)氨基酸均處于蛋白質(zhì)COMP的表面，可以構(gòu)成構(gòu)象表位。

2.6表位結(jié)構(gòu)分析mAb 15A11結(jié)合表位相應(yīng)肽鏈在COMP分子EGF-Like4結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)如圖3A表示，229C-243C和237C-253C 均有一個(gè)二硫鍵(黃色表示)，232G、238H、240H均處于無(wú)規(guī)卷曲；241A處于β轉(zhuǎn)角；244V、247R和251R處于β折疊(顏色表示與表位在COMP上的定位一致)，與先前報(bào)道的表位特征吻合：β轉(zhuǎn)角為凸出結(jié)構(gòu)，多出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，有利于與抗體結(jié)合，較可能成為抗原表位。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這七個(gè)氨基酸均不處于α螺旋，且六個(gè)氨基酸與中間251R的距離均小于15 ?(如圖3B)，可以形成構(gòu)象表位。這與α螺旋則不易變形、較難結(jié)合抗體、一般不作為抗原表位的研究報(bào)道結(jié)果一致。

2.7表位性質(zhì)鑒定為了進(jìn)一步鑒定表位的性質(zhì)，用變性Western blot和非變性Western blot方法檢測(cè)COMP結(jié)構(gòu)改變對(duì)于mAb 15A11與COMP結(jié)合的影響。在變性SDS-PAGE膠試驗(yàn)中，由于SDS、加熱等條件下，使得COMP的結(jié)構(gòu)完全破壞而呈線性狀態(tài)。而在非變性PAGE膠中COMP保持構(gòu)象結(jié)構(gòu)。圖4B顯示，在非變性PAGE膠實(shí)驗(yàn)中，免疫反應(yīng)為陽(yáng)性(圖4A)，而在變性SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)中，免疫反應(yīng)為陰性，即COMP構(gòu)象破壞后與mAb 15A11的結(jié)合能力喪失。這些結(jié)果進(jìn)一步表明，mAb 15A11的表位為構(gòu)象表位。

研究表明，COMP構(gòu)象的維持必須有Ca2+參與[4，30]，COMP經(jīng)EDTA處理螯合Ca2+后，Native PAGE結(jié)果表明，和未經(jīng)EDTA螯合Ca2+的對(duì)照組相比，COMP電泳速度慢(結(jié)果未顯示)。說(shuō)明，EDTA螯合Ca2+后導(dǎo)致COMP的構(gòu)象破壞。圖4C說(shuō)明，結(jié)構(gòu)破壞的COMP和mAb 15A11的結(jié)合能力明顯降低，與多克隆抗體作為一抗的對(duì)照組結(jié)果一致。

2.8合成多肽及ELISA為了進(jìn)一步驗(yàn)證構(gòu)象表位的正確性，采用化學(xué)方法合成225A-255C的一系列多肽(表3)，末端氨基酸通過(guò)Gly-Gly-Gly與生物素連接。

合成多肽與mAb 15A11的結(jié)合能力通過(guò)ELISA進(jìn)行鑒定。圖5表明，合成三十肽226Q-C255的結(jié)合能力最強(qiáng)，說(shuō)明表位位于該段多肽內(nèi)；缺少229C和235的序列C232G-R251結(jié)合能力明顯降低，表明229C-243C和237C-253C 之間的二硫鍵對(duì)于構(gòu)象維持起關(guān)鍵作用；缺少232G的237C-R251和235S-V244結(jié)合能力更低，表明232G對(duì)于mAb 15A11和COMP的結(jié)合起重要作用，240H-R251、241A-R251、241A-S250、242D-R251、241A-S250和238H-R247沒(méi)有結(jié)合能力，說(shuō)明241A、244V、247R和251R對(duì)于結(jié)合也很重要。235SECHEHADCV244進(jìn)一步說(shuō)明238H、240H、241A和244V對(duì)于mAb 15A11和COMP結(jié)合的作用。以上結(jié)果均表明，232G、238H、240H、241A、244V、247R和251R是抗原表位，229C-243C和237C-253C 之間的二硫鍵對(duì)于構(gòu)象維持以及mAb 15A11與COMP的結(jié)合具有關(guān)鍵作用。

圖2　mAb 15A11結(jié)合表位在COMP上的定位Fig.2　Localization of mAb 15A11 binding epitope on COMP

圖3　表位結(jié)構(gòu)分析Fig.3　Structure analysis of epitope

表3　合成多肽的COMP氨基酸序列Tab.3　Amino acid sequences of synthetic peptides deprived from COMP molecule

圖4　表位性質(zhì)鑒定Fig.4　Characterization identification of epitope

圖5　合成多肽ELISAFig.5　ELISA analysis of COMP-derived peptides

3討論

軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)是一種類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的自身抗原，mAb 15A11特異性識(shí)別COMP的一種單克隆抗體。為了鑒定mAb 15A11的COMP抗原表位，本研究首先采用隨機(jī)十二肽噬菌體庫(kù)進(jìn)行三輪篩選，隨著篩選次數(shù)的增加，噬菌體的投入產(chǎn)出率逐漸增加，說(shuō)明特異性結(jié)合的噬菌體得到很好的富集。對(duì)第三輪篩選的噬菌體進(jìn)行滴度測(cè)定，并隨機(jī)挑取40個(gè)噬菌斑克隆，對(duì)其DNA進(jìn)行測(cè)序，共得到五個(gè)噬菌體克隆，其中克隆1和克隆2為mAb 15A11特異性的。我們之前已經(jīng)證實(shí)mAb 15A11結(jié)合COMP的EGF4-like結(jié)構(gòu)域[27]，翻譯該兩個(gè)克隆的插入十二肽氨基酸序列并與EGF4-like結(jié)構(gòu)域氨基酸序列比對(duì)未發(fā)現(xiàn)連續(xù)一致氨基酸序列，表明該表位為構(gòu)象表位。比對(duì)結(jié)果有七個(gè)不連續(xù)的相同或性質(zhì)相同的氨基酸：232G、238H、240H、241A、244V、247R和251R。PyMol分析，該七個(gè)氨基酸均位于蛋白質(zhì)的表面，且距離中間的251R均小于15?，證明該七個(gè)氨基酸形成構(gòu)象表位的可能性。Western blot以及EDTA處理COMP后的ELISA試驗(yàn)進(jìn)一步證明該表位是構(gòu)象表位。合成多肽與mAb 15A11的ELISA結(jié)果確定了mAb 15A11的構(gòu)象表位序列。 本研究利用隨機(jī)十二肽噬菌體展示技術(shù)篩初步確定表位序列及表位性質(zhì)，再結(jié)合生物信息學(xué)進(jìn)行分析，最后又回歸試驗(yàn)，不僅進(jìn)一步確定mAb 15A11的表位是構(gòu)象表位，而且確定了表位序列的正確性。在炎癥反應(yīng)中，胞外基質(zhì)發(fā)生改變，很多軟骨成分作為酶裂解片段釋放。其中，COMP更加容易裂解成50~70 kD的片段。除此之外，COMP片段還在軟骨發(fā)生改變時(shí)釋放到滑膜液和血清中[29-31]。在軟骨中，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-1,-3,-9,-13和蛋白聚糖酶(ADAMTS)家族的成員如ADAMTS-4,-7 和 -12 與COMP的降解有關(guān)[32，33]。因此，這個(gè)抗體適合診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人滑膜液和血清中的COMP片段，從而可以監(jiān)視關(guān)節(jié)的損壞以及治療的效果。不僅對(duì)研究COMP抗體與抗原反應(yīng)機(jī)制具有重要理論價(jià)值，并對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的檢測(cè)有重要應(yīng)用意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Souto-Carneiro MM,Burkhardt H,Müller EC,etal.Human monoclonal rheumatoid synovial B lymphocyte hybridoma with a new disease-related specificity for cartilage oligomeric matrix protein [J].J Immunol,2001,166(6):4202-4208.

[2]Trentham DE,Townes AS,Kang AH.Autoimmunity to type II collagen an experimental model of arthritis [J].J Exp Med,1977,146(3):857-868.

[3]Carlsen S,Lu S,Holmdahl R.Arthritis induced with minor cartilage proteins [J].Methods Mol Med,2007,136(2):225-242.

[4]Hedbom E,Antonsson P,Hjerpe A,etal.Cartilage matrix proteins.An acidic oligomeric protein(COMP)detected only in cartilage [J].J Biol Chem,1992,267(9):6132-6136.

[5]Chen FH,Thomas AO,Hecht JT,etal.Cartilage oligomeric matrix protein/thrombospondin 5 supports chondrocyte attachment through interaction with integrins [J].J Biol Chem,2005,280(38):32655-32661.

[6]Kipnes J,Carlberg AL,Loredo GA,etal.Effect of cartilage oligomeric matrix protein on mesenchymal chondrogenesis in vitro [J].Osteoarthritis Cartilage,2003,11(6):442-454.

[7]Carlsen S,Nandakumar KS,Backlund J,etal.Cartilage oligomeric matrix protein induction of chronic arthritis in mice [J].Arthritis Rheum,2008,58(7):2000-2011.

[8]Hopp TP,Woods KR.Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences [J].Proc Natl Acad Sci USA,1981,78(6):3824-3828.

[9]來(lái)魯花.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和分子設(shè)計(jì)[M].北京大學(xué)出版社,1993:49.

[10]Saha S,Raghava G.Prediction of continuous B-cell epitope in an antigen using recurrent neural network [J].Protein,2006,65(1):40-48.

[11]Saha S,Raghava GPS.BcePred:Prediction of continuous B-cell epitopes in antigenic sequences using physico-chemical properties.In:Artificial immune systems [J].Springer Berlin Heidelberg,2004,3239(16):197-204.

[12]Jens Vindahl Kringelum1,Claus Lundegaard1,Ole Lund,etal.Reliable B cell epitope predictions:impacts of method development and improved benchmarking [J].PLoS Comput Biol,2012,8(12):e1002829.

[13]Liang S,Zheng D,Standley DM,etal.EPSVR and EPMeta:prediction of antigenic epitopes using support vector regression and multiple server results [J].BMC Bioinformatics,2010,11:381.

[14]Ponomarenko J,Bui H-H,Li W,etal.ElliPro:a new structure-based tool for the prediction of antibody epitopes[J].BMC Bioinformatics,2008,9:514.

[15]Larsen J,Lund O,Nielsen M.Improved method for predicting linear B-cell epitopes [J].Immunome Research,2006,2:2.

[16]Kulkarni-Kale U,Bhosle S,Kolaskar AS.CEP:a conforma-tional epitope prediction server [J].Nucleic Acids Res,2005,33(Web Server issue):W168-W171.

[17]Rosen O,Anglister J.Epitope mapping of antibody-antigen complexes by nuclear magnetic resonance spectroscopy [J].Methods Mol Biol,2009,524:37-57.

[18]P?r S?fsten.Epitope mapping by surface plasmon resonance [J].Methods Mol Biol,2009,524:67-76.

[19]Morris GE.Epitope mapping by chemical fragment [J].Methods Mol Biol,1996,66:121-127.

[20]Mazzoni MR,Porchia F,Hamm HE.Proteolytic fragmentation for epitope mapping [J].Methods Mol Biol,2009,524:77-86.

[21]Dhungana S,Williams JG,Fessler MB,etal.Epitope mapping by proteolysis of antigen-antibody complexes [J].Methods Mol Biol,1996,66:97-108.

[23]Maier RH,Maier CJ,?nder K,etal.Epitope mapping of antibodies using a cell array-based polypeptide library [J].J Biomol Screen,2010,15(4):418-426.

[24]Su qp,Huai yy,Wang yc,etal.The use of hybrid phage displaying antigen epitope and recombinant protein in the diagnosis of systemic Candida albicans infection in rabbits and cancer patients [J].Diagn Microbiol Infect Dis,2010,68(4):382-389.

[25]Smith GP,Petrenko VA.Phage display [J].Chem Rev,1997,97(2):391- 410.

[26]楊喬欣,馬文煜,余穎.單純皰疹病毒糖蛋白模擬表位的研究[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2002,18(2):146-148.

[27]Geng H,Nandakumar KS,Pramhed A,etal.Cartilage oligomeric matrix protein specific antibodies are pathogenic [J].Arthritis Res Ther,2012,14(4):1478-6362.

[28]董佳慧,揭瑞,余金輝,等.抗人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白單克隆抗體的研制及表位鑒定[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2013,29(4):370-376.

[29] Brun J.Proteasome inhibition as a novel therapy in treating rheu-matoid arthritis [J].Med Hypotheses,2008,71(1):65-72.

[30] Mansson B,Carey D,Alini M,etal.Cartilage and bone metaboli-sm in rheumatoid arthritis.Differences between rapid and slow progression of disease identified by serum markers of cartilage metabolism [J].J Clin Invest,1995,95(3):1071-1077.

[31] Dickinson SC,Vankemmelbeke MN,Buttle DJ,etal.Cleavage of cartilage oligomeric matrix protein(thrombospondin-5)by matrix metalloproteinases and a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs [J].Matrix Biol,2003,22(3):267-278.

[32] Luan Y,Kong L,Howell DR,etal.Inhibition of ADAMTS-7 and ADAMTS-12 degradation of cartilage oligomeric matrix protein by alpha-2-macroglobulin [J].Osteoarthritis Cartilage,2008,16(11):1413-1420.

[33] Kashiwagi M,Enghild JJ,Gendron C,etal.Altered proteolytic activities of ADAMTS-4 expressed by C-terminal processing [J].J Biol Chem,2004,279(11):10109-10119.

[收稿2015-02-11修回2015-04-17]

(編輯張曉舟)