肝細胞癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs的監(jiān)測及其臨床意義①

易永祥　王　建　張　彤　王　翔　韓建波　趙　亮　張郁峰

(東南大學附屬南京市第二醫(yī)院普外科，南京210003)

[摘　要]　目的：通過檢測不同時期肝細胞癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs表達，分析其對肝細胞癌患者免疫功能的影響及臨床意義。方法：選擇肝細胞癌患者62例，并設(shè)置20名健康對照組，利用流式細胞學方法檢測外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的比例及Th1/Th2細胞免疫狀態(tài)，比較各組之間上述指標有無差異。結(jié)果：與健康對照組成人相比，肝細胞癌組患者外周血中MDSCs的比例顯著增高，且進展期肝癌組患者MDSC的比例明顯高于早期肝癌組患者；肝細胞癌患者Th細胞向Th2漂移，與正常健康組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論：肝細胞癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs含量升高，Th細胞向Th2漂移，免疫功能低下，CD33+HLA-DR-MDSCs可以作為監(jiān)測原發(fā)性患者的免疫功能和預(yù)后評估的有效指標。

[關(guān)鍵詞]　肝癌；免疫功能；髓源抑制性細胞

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.017

肝細胞癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs的監(jiān)測及其臨床意義①

易永祥王建張彤②王翔②韓建波趙亮張郁峰

(東南大學附屬南京市第二醫(yī)院普外科，南京210003)

[摘要]目的：通過檢測不同時期肝細胞癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs表達，分析其對肝細胞癌患者免疫功能的影響及臨床意義。方法：選擇肝細胞癌患者62例，并設(shè)置20名健康對照組，利用流式細胞學方法檢測外周血中CD33+HLA-DR-MDSCs的比例及Th1/Th2細胞免疫狀態(tài)，比較各組之間上述指標有無差異。結(jié)果：與健康對照組成人相比，肝細胞癌組患者外周血中MDSCs的比例顯著增高，且進展期肝癌組患者MDSC的比例明顯高于早期肝癌組患者；肝細胞癌患者Th細胞向Th2漂移，與正常健康組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。結(jié)論：肝細胞癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs含量升高，Th細胞向Th2漂移，免疫功能低下，CD33+HLA-DR-MDSCs可以作為監(jiān)測原發(fā)性患者的免疫功能和預(yù)后評估的有效指標。

[關(guān)鍵詞]肝癌；免疫功能；髓源抑制性細胞

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.017

中圖分類號①本文受“十二五”南京市醫(yī)學科技發(fā)展基金重點資助項目(ZDX12008)和江蘇省科技廳臨床醫(yī)學專項(BL2014005)資助。;②興化市人民醫(yī)院外科，興化225700。

作者簡介：易永祥(1966年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事肝膽胰腫瘤研究。

[Abstract]Objective:The purpose of this study is to evaluate the frequency of MDSCs in peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients and to investigate the clinical significance of change of MDSCs in the peripheral blood and provide new ways for evaluating immune state and prognosis of hepatocellular carcinoma patients.Methods: Blood samples were obtained from 62 patients with HCC and 20 healthy donors.The phenotype of CD3,CD4,CD33,HLA-DR and Th1，Th2 immune subsets in peripheral blood of each group were observed by FCM methods.Results: There were statically different frequencies in the peripheral blood between hepatocellular carcinoma and healthy control group,which the proportion of total CD3+T lymphocytes and CD3+CD4+T cells were lower and the proportion of CD33+HLA-DR-MDSCs was higher in hepatocellular carcinoma patients.(P<0.05).The increase of percentage of MDSCs was greater in patients at Stage C and D than in patients at stage A and B.Conclusion: The Th1/ Th2 ratio in the PBMC were of imbalance and MDSCs was significantly increased in peripheral blood of hepatocellular carcinoma patients.The increase of MDSCs was significantly correlated with clinical stage.CD33+HLA-DR-MDSCs may play an important role in prediction in prognosis and tumor immune status of hepatocellular carcinoma.

Study on detection and clinical significance of CD33+HLA-DR-MDSCs cells in hepatocellular carcinoma

YIYong-Xiang,WANGJian,ZHUANGTong,WANGXiang,HANJian-Bo,ZHAOLiang,ZHANGYu-Feng.DepartmentofGeneralSurgerytheSecondHospitalofNanjing,AffiliatedtoSoutheastUniversity,Nanjing210003,China

[Key words]Hepatocellular carcinoma;Immune function;Myeloid derived suppressor cells

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常見的惡性腫瘤，其臨床治療預(yù)后較差[1,2]。原發(fā)性肝癌在體內(nèi)的發(fā)生、發(fā)展與機體免疫功能受抑制和紊亂有關(guān)，同時腫瘤細胞也可以通過分泌細胞因子而引起機體免疫抑制[3]。MDSCs被證實是一類通過抑制機體免疫功能促進腫瘤生長的免疫抑制細胞，其在外周血中的水平與疾病的進展程度和腫瘤分期有關(guān)[4,5]。通過降低腫瘤患者體內(nèi)MDSCs的水平，改善腫瘤患者的免疫抑制狀態(tài)已被作為抗腫瘤藥物的開發(fā)靶點[6,7]。本研究通過檢測62例肝癌患者外周血Th細胞的漂移狀態(tài)評估機體的免疫功能，并追蹤其疾病惡化過程的關(guān)系，同時監(jiān)測外周血CD33+HLA-DR-MDSCs含量變化與肝癌患者免疫功能的關(guān)系，以期探討CD33+HLA-DR-MDSCs在肝癌免疫功能監(jiān)測的意義。

1資料與方法

1.1一般資料納入2012年5月～2014 年9月間在我院住院的HCC患者62例，其中男性48例，女性14例，年齡32~69歲，平均年齡(58.78±10.11)歲，診斷參照《原發(fā)性肝癌臨床診斷標準》；巴塞羅那臨床肝癌(BCLC)分期，A 期患者11例、B 期患者13例、C 期患者28例、D 期患者10例；本研究取血樣獲得本院倫理委員會批準，并簽署知情同意書。排除合并其他惡性腫瘤及免疫性疾病的患者；排除嚴重精神障礙患者；排除合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.2方法

1.2.1外周血Th1細胞和Th2細胞分析分離外周血單個核細胞，加入20 ng/ml PMA和500 ng/ml離子霉素刺激4 h后，收集細胞。將細胞分為兩份，稱為對照管和實驗管，分別加入CD3-APC，CD8-PercP 10 μl，混勻，室溫放置20 min，加入紅細胞裂解液1 ml，混勻，室溫放置10 min，2 789 r/min離心5 min，棄上清。加入Cytofix/Cytoperm液200 μl，4℃放置20 min，使細胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1 ml，3 416 r/min離心5 min，棄上清。實驗管加入IFN-γ-FITC、IL-4-PE各5 μl，對照管加入同型對照抗體，4℃避光孵育30 min。加入Perm/Wash液500 μl洗滌兩次。最后以300 μl洗滌液重懸細胞。采用EXPO32 ADC軟件及CD3-APC、CD4-PercP 、IFN-γ-FITC和IL4-PE抗體單雙標記的淋巴細胞調(diào)節(jié)儀器的補償，以前向角(FSC)和側(cè)向角(SSC)散射光散點圖設(shè)門區(qū)分淋巴細胞，以CD3和CD4散點圖設(shè)門區(qū)分Th細胞(CD3+CD4-)。最終以IFN-γ和IL-4的散點圖表示Th1細胞和Th2細胞。

1.2.2外周血CD33±HLA-DR-MDSCs檢測分離外周血單個核細胞， 加入APC-HLA-DR抗體和FITC-CD33抗體，4℃避光孵育30 min。加入PBS液500 μl洗滌兩次。最后以300 μl洗滌液重懸細胞。采用EXPO32 ADC軟件分析CD33+HLA-DR-MDSCs所占的比例，并分析其與臨床分期的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間的比較采用LSD-t檢驗，資料多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1外周血輔助Th細胞Th1/Th2分化檢測結(jié)果正常健康人群Th1細胞占輔助Th細胞的(18.24±5.26)%，Th2細胞占(5.35±2.26)%，其比值(3.40±1.25)；而HCC患者Th細胞向Th2漂移，Th1細胞為(9.65±4.12)%，Th2細胞為(7.49±2.18)%，Th1/ Th2其比值(1.28±0.86)，P<0.05，肝癌患者相比于健康人，外周循環(huán)中輔助性T 細胞中的Th1型細胞明顯減低，Th2 型細胞明顯增高；在HCC的BCLC分期中，各期Th1/Th2比值分別為A期(2.03±1.12)，B期(1.50±0.89)，C期(1.06±0.68) 和D期(0.88±0.54)，C和D期患者外周血Th細胞向Th2漂移更為顯著，隨著病情的進展，機體免疫功能狀態(tài)進一步惡化(見圖1、表1) 。

2.2CD33+HLA-DR-MDSCs在外周血中的比例肝癌患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs細胞在單個核細胞中所占的比例為(2.25±0.41)%，明顯高于健康志愿者(1.38±0.29)%，P=0.009<0.05；在HCC的BCLC分期中，C和D期患者外周血CD33+-HLA-DR-MDSCs細胞在單個核細胞中所占的比例分別為(2.43±0.39)%和(2.50±0.48)%，顯著高于A和B期患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs細胞在單個核細胞中所占的比例(1.82±0.21)%和(2.01±0.28)%，P=0.007<0.05。隨著病情的進展，CD33+HLA-DR-MDSCs在外周血的比例增高(見圖2、3) 。

圖1　流式細胞儀檢測肝癌患者外周血細胞Th1、Th2免疫表型Fig.1　Immunophenotype of Th1 and Th2 in peripheral blood of patients of hepatocellular carcinoma by flow cytometry

表1　不同BCLC分期肝癌患者的Th1和Th2亞群分布情況(±s)Tab.1　Th1 and Th2 subsets in patients with different BCLC stage in HCC patients(±s)

表1　不同BCLC分期肝癌患者的Th1和Th2亞群分布情況(±s)Tab.1　Th1 and Th2 subsets in patients with different BCLC stage in HCC patients(±s)

GroupsnCD3+(%)CD3+CD4+(%)Th1(%)Th2(%)Th1/Th2Healthyvolunteers2070.21±6.6946.56±5.6918.24±5.265.35±2.263.40±1.25P=0.001<0.5HCCpatients6256.15±6.2726.98±5.079.65±4.127.49±2.181.28±0.86BCLCstageAstage1159.61±5.2528.14±6.0212.24±4.536.02±1.862.03±1.12P=0.0117<0.5Bstage1358.15±5.2526.87±5.1410.29±4.376.84±1.951.50±0.89Cstage2855.25±4.8924.17±5.028.64±4.038.12±2.051.06±0.68Dstage852.16±4.6422.12±4.927.56±3.938.95±2.360.88±0.54

圖2　流式細胞儀檢測血液循環(huán)中MDSCs免疫表型Fig.2　 Immunophenotype of MDSCs in circulating blood measured by flow cytometry

圖3　肝癌患者血液系統(tǒng) CD33+HLA-DR-MDSCs細胞分布情況Fig.3　Circulating CD33+HLA-DR-MDSCs cells in HCC patients

3討論

世界癌癥報告顯示，全世界肝細胞癌(HCC)每年新發(fā)病例50萬～100萬，總體病死率95%，肝癌已經(jīng)成為當前社會主要的健康負擔[8]。腫瘤細胞可以通過形成多種不同的機制來逃避宿主的免疫系統(tǒng)對其免疫監(jiān)視和免疫攻擊，創(chuàng)造出一個免疫抑制性的微環(huán)境，從而促進腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和影響腫瘤治療的效果[9,10]。T 淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫在機體預(yù)防和排斥腫瘤方面起重要作用。本研究通過對肝細胞癌患者外周血免疫功能的分析發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌患者外周血總T細胞比例為(56.15±6.27)%，顯著低于正常健康組(70.21±6.69)%；CD3+CD4+T細胞在調(diào)控或“輔助”其他淋巴細胞發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，是調(diào)節(jié)CD8+T細胞殺傷能力的主要因素,而Th1、Th2平衡是其效應(yīng)之一，尤其是其向Th1和Th2的分化情況更能夠體現(xiàn)機體的免疫功能狀態(tài)[11,12]。我們通過檢測發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌患者Th細胞向Th2漂移，Th1細胞為(9.65±4.12)%，Th2細胞為(7.49±2.18)%，Th1/Th2比值為(1.28±0.86)，顯著低于正常健康人群P<0.05；進一步對HCC的BCLC分期中各期Th1/Th2比值分析發(fā)現(xiàn)，隨著病情的進展，Th細胞向Th2漂移更為顯著，C期和D期Th1/Th2比值分別為(1.06±0.68)和 (0.88±0.54)，顯著高于A期和B期。

MDSCs是來源于髓系祖細胞和未成熟髓細胞，是機體免疫反應(yīng)的一群獨特的細胞群體，腫瘤細胞自分泌的一些因子如IL-6和VEGF細胞因子等被認為是刺激MDSCs擴增和激活的重要因素，MDSCs可通過促進血管生成和抑制免疫應(yīng)答促進腫瘤生長[13,14]。研究發(fā)現(xiàn)，MDSCs通過生成的活性氧族和活性氮族成分影響T細胞功能，同時通過耗竭微環(huán)境中精氨酸和L-半胱氨酸抑制T細胞激活與增殖[15,16]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血CD33+-HLA-DR-MDSCs細胞在單個核細胞中所占的比例為(2.25±0.41)%，明顯高于健康志愿者(1.38±0.29)%，P<0.05；在腫瘤分期上，隨著分期級別的升高，MDSCs的比例與呈上升趨勢，尤其表現(xiàn)為C和D期患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs細胞在單個核細胞中所占的比例分別為(2.43±0.39)%和(2.50±0.48)%，顯著高于A和B期患者外周血CD33+HLA-DR-MDSCs細胞在單個核細胞中所占的比例(1.82±0.21)%和(2.01±0.28)%，P<0.05，表明隨著MDSCs的升高，免疫系統(tǒng)受抑制程度加重，這與文獻報道中MDSCs與腫瘤患者腫瘤負荷、有無轉(zhuǎn)移及臨床分期的有關(guān)結(jié)論相一致。結(jié)合我們對肝細胞癌患者T細胞和Th細胞的檢測我們發(fā)現(xiàn)，MDSCs比例變化趨勢與肝癌患者外周血總T細胞比例變化密切相關(guān)，說明MDSCs可能是影響肝癌患者T細胞免疫功能的重要原因，MDSCs還可以直接影響CD4+T細胞的功能狀態(tài)，這可能是導(dǎo)致肝細胞癌患者Th2細胞占優(yōu)勢的原因之一。

綜上所述，MDSC在HCC的外周血大量擴增，其通過各種途徑抑制免疫系統(tǒng)的活性，促進肝癌細胞的免疫逃逸。進一步探索和研究MDSCs生物學特性和免疫調(diào)控機制，將有助于通過監(jiān)測MDSCs的數(shù)量和功能來評價機體的免疫功能和逆轉(zhuǎn)MDSC的免疫抑制作用，增強腫瘤免疫治療療效。

參考文獻：

[1]Flecken T,Schmidt N,Hild S,etal.Immunodo minance and functional alterations of tumor-associated antigen-specific CD8+T-cell responses in hepatocellular carcinoma [J].Hepatology,2014,59(4): 1415-1426.

[2]Lee IC,Huang YH,Chau GY,etal.Serum interferon gamma level predicts recurrence in hepatocellular carcinoma patients after curative treatments [J].Int J Cancer,2013,133(12): 2895-2902.

[3]Wang Y,Deng B,Tang W,etal.TGF-β1 secreted by hepatocellular carcinoma induces the expression of the Foxp3 gene and suppresses antitumor immunity in the tumor microenvironment [J].Dig Dis Sci,2013,58(6): 1644-1652.

[4]Maenhout SK,Van Lint S,Emeagi PU.Enhanced suppressive capacity of tumor-infiltrating myeloid-derived suppressor cells compared with their peripheral counterparts[J].Int J Cancer,2014,134(5):1077-1090.

[5]Iwasaki H,Akashi K.Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell[J].Immunity，2007,26(6):726-40.

[6]Khan AN,Kolomeyevskaya N,Singel KL,Targeting myeloid cells in the tumor microenvironment enhances vaccine efficacy in murine epithelial ovarian cancer [J].Oncotarget,2015,6(13):11310-11326.

[7]Jeanbart L,Kourtis IC,van der Vlies AJ.6-Thioguanine-loaded polymeric micelles deplete myeloid-derived suppressor cells and enhance the efficacy of T cell immunotherapy in tumor-bearing mice[J].Cancer Immunol Immunother,2015，64(8):1033-1046.

[8]Parkin DM,Bray F,Feslay J,etal.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[9]Kitamura T,Qian BZ,Pollard JW.Immune cell promotion of metastasis[J].Nat Rev Immunol,2015,15(2):73-86.

[10]Schl?βer HA,Theurich S,Shimabukuro-Vornhagen A.Overco-ming tumor-mediated immunosuppression[J].Immunotherapy,2014，6(9):973-988.

[11]Lin ZW,Wu LX,Xie Y,The expression levels of transcription factors T-bet,GATA-3,RORγt and FOXP3 in peripheral blood lymphocyte (PBL) of patients with liver cancer and their significance[J].Int J Med Sci,2015,12(1):7-16.

[12]Ma J,Liu H,Wang X.Effect of ginseng polysaccharides and dendritic cells on the balance of Th1/Th2 T helper cells in patients with non-small cell lung cancer[J].J Tradit Chin Med,2014,34(6):641-645.

[13]Conda mine T,Gabrilovich D.Can the suppressive activity of myeloid-derived suppressor cells be “chop”ped? [J].Immunity,2014,41(3):341-342.

[14]Zhang L,Su XS,Ye JS,Bone marrow mesenchymal stem cells suppress metastatic tumor development in mouse by modulating immune system[J].Stem Cell Res Ther,2015,6:45 .

[15]Danelli L,Frossi B,Gri G,Mast cells boost myeloid-derived suppressor cell activity and contribute to the development of tumor-favoring microenvironment[J].Cancer Immunol Res,2015,3(1):85-95.

[16]Giallongo C,Parrinello N,Tibullo D.Myeloid derived suppressor cells (MDSCs) are increased and exert immunosuppressive activity together with polymorphonuclear leukocytes (PMNs) in chronic myeloid leukemia patients[J].PLoS One,2014，9(7):e101848.

[收稿2015-07-23修回2015-08-18]

(編輯張曉舟)