mTOR在運動干預高脂膳食大鼠胰島素抵抗形成中的作用及機制研究

劉霞　孫青　陳志軍

摘 要：目的：探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）在高脂膳食誘導胰島素抵抗（IR）的形成及運動干預中的作用。方法：選用清潔級的雄性SD大鼠40只，隨機分為4組：正常對照組（C組，n=10）；高脂膳食組（H，n=10）；游泳運動組（E，n=10）；高脂膳食+游泳運動組（HE，n=10）。按實驗要求分別給予普通飼料和高脂飼料，E、HE組每天無負重游泳運動1小時。11周后檢測各組大鼠空腹血糖（FBG）、血清胰島素（FBG）、骨骼肌AMPK、PI3K、Akt、mTOR、S6K1的表達量。結果：1）與C組相比，H組FBG、FINS、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）均顯著性升高（P<001）（P<0.05），E組FINS極顯著性下降（P<0.01）；與H組相比，HE組FINS顯著性下降（P<0.05）。2）與C組比較，H組骨骼肌mTOR含量和mRNA都有顯著性增加（P<0.05），S6K1mRNA極顯著性升高（P<0.01）；與H組比較，HE組骨骼肌mTOR、S6K1mRNA顯著性減少（P<0.05）。3）與C組比較， E組骨骼肌Akt和AMPK含量顯著性增加（P<0.01）；與H組比較，HE組骨骼肌PI3K、Akt、AMPK含量有增加，但均無顯著性（P>0.05）。結論：1）長期的高脂膳食可激活mTOR/S6K1信號通路，導致胰島素抵抗的發(fā)生。2）有氧運動激活AMPK，抑制mTOR的作用，AMPK/mTOR/S6K1可能在運動干預高脂膳食誘導IR形成中起著重要的作用。

關鍵詞：高脂；胰島素抵抗；運動干預； mTOR；AMPK

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2015）05-0057-05

Abstract：Objective：Explore the effect of mTOR on the generation of insulin resistance of high-fat diet and exercise induced.Methods：40 Sprague-Dawley（SD）male rats were randomly divided into control group（C，n=10），High-Fat Diet Rats（H，n=10），Swimming Exercise Rats（E，n=10） and High-Fat Diet+Swimming Exercise Rats（HE，n=10）.According to the acquirement， they should be fed separately normal diet and high-fat diet.Rats in group E and group HE were both asked to swim for one hour with non-weight bearing everyday.After 11weeks，measuring the content of FBG，F(xiàn)INS，the expression of AMPK，PI3K，Akt，mTOR，S6K1 in skeletal muscles.Results：1）Compared with group C，

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是胰島素經(jīng)典PI3K/AKT信號通路的下游靶蛋白，受營養(yǎng)物質、能量變化以及生長因子的激活，可調控蛋白質合成、細胞生長和增殖[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)，mTOR與胰島素抵抗（IR）的關系密切，外界信號刺激導致mTOR持續(xù)高度活化時，mTOR可通過負反饋途徑引起胰島素受體底物-1（IRS-1）絲氨酸磷酸化是IR形成的主要原因[2]。而NiuYM[3]等研究發(fā)現(xiàn)，mTOR/S6K1信號通路與高脂飲食誘導IR的發(fā)生有著密切的關系，有氧運動可能是通過抑制mTOR/S6K1信號通路，使IR得到改善，但其調控機制尚不清楚，為此本研究將通過高脂膳食誘導IR形成的同時進行運動干預，來進一步探討mTOR與IR的關系以及運動對mTOR的調控機制。

1 研究對象與方法

1.1 實驗動物與分組

選用清潔級6周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重160～180 g，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，環(huán)境溫度（25±1）℃，自然光照，每天更換一次墊料，保持籠內干燥。隨機分成4組：正常對照組（C，n=10）；運動訓練組（E，n=10）；高脂對照組（H，n=10）；高脂+運動訓練組（HE，n=10）。高脂飼料的配方為78.8%基礎飼料、10%蛋黃粉、10%豬油、1%膽固醇和0.2%膽鹽[4]，由南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場配制。

1.2 運動訓練方案

運動組（E、HE）大鼠每天進行無負重的游泳訓練，每周訓練6天，第1周進行適應性訓練，游泳時間在1周之內過渡到60 min，正式運動訓練11周。游泳池為100 cm×70 cm×60 cm長方體水桶，水深50 cm、水溫（33±1）℃。在訓練過程中時刻觀察大鼠游泳狀態(tài)防止溺水死亡或偷懶休息，并及時撈出老鼠糞便，確保泳池水質清潔。

1.3 實驗取材

大鼠在末次運動后，禁食12 h，次日晨分別按50 mg/kg的劑量腹腔注射2%的戊巴比妥鈉麻醉，然后腹主動脈取血3 mL，放入無菌試管中，在室溫靜置30 min后，4℃、3 500 rpm離心15 min，在2 h內測定空腹血糖（FBG），其余血清在-80℃冰箱中保存，以備測定空腹血清胰島素（FINS）；取大鼠腓腸肌，立刻放入液氮中，再轉入-80℃保存。然后稱量約300 mg的腓腸肌淺層組織，剪碎后移入玻璃勻漿器中，加入預冷的生理鹽水3 mL，在冰浴下仔細研磨制備10%的組織勻漿，并以3 000 rpm低溫離心10 min，取上清液-40℃保存，以備測定骨骼肌中磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶（Akt）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）和 mTOR含量；稱量80～100 mg的淺層腓腸肌，用Trizol （購自Life technologies）法從骨骼肌組織中提取總RNA后，采用NanoDrop ND-3300微量分光光度計檢測260/ 280吸光度比值，判斷RNA純度。按照cDNA合成試劑盒（購自上海東洋紡生物科技有限公司）中說明書上的操作步驟，使用2720 Thermal Cycler梯度PCR儀（美國）進行cDNA合成，反應結束后，在-20℃條件下保存。

1.4 指標測試

FBG采用葡萄糖氧化酶法測定，測定儀器為日立全自動生化分析儀；FINS、骨骼肌PI3K、Akt、AMPK和 mTOR采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定，試劑盒購于上海博古生物科技有限公司，測定儀器為美國產的ELX800型酶標儀；胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）=FBG×FINS/22.5。腓腸肌勻漿液中蛋白定量采用BCA法，試劑購于碧云天生物技術研究所，測試儀器為全波長酶標儀；骨骼肌mTOR、S6K1mRNA采用RT-PCR法測定。使用SYBR Green Master（ROX）試劑盒（購自Roche Diagnostics），以cDNA為模板，β-actin為內參，在ABI 7500 RT-PCR儀進行基因擴增。擴增程序為：50℃預處理2 min，95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s共進行40個循環(huán)。程序運行結束后，將目的基因的Ct值與內參GAPDH進行標準化，計算出目的基因的相對表達量。mTOR、S6K1和GAPDH的引物由均由上海生物工程有限公司設計并合成，引物序列見表1。

表1 mTOR、S6K1和β-actin的引物序列

1.5 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行處理，結果用均數(shù)±標準差（M±SD）表示，H組、E組與C組之間和HE組與H組之間分別采用獨立樣本t檢驗進行比較，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異。

2 研究結果與分析

2.1 實驗大鼠FBG、FINS和HOMA-IR的變化

從表2可見，與C組相比，H組FBG極顯著性升高（P<0.01），F(xiàn)INS和HOMA-IR均顯著性升高（P<0.05）；E組FBG降低，但無顯著性差異（P>0.05），F(xiàn)INS極顯著性降低（P<0.01），HOMA-IR顯著性降低（P<0.05）。與H組相比，HE組FINS有顯著性下降（P<0.05），F(xiàn)BG和HOMA-IR有下降趨勢，但沒有顯著性（P>0.05）。

表2 實驗大鼠FBG、FINS和HOMA-IR的變化

注：H組、E組與C組相比，*，P<0.05，**，P<0.01；HE組與H組相比，#，P<0.05，##，P<0.01。

2.2 實驗大鼠骨骼肌mTOR和S6K1含量的變化

從表3可見，與C組比較，H組骨骼肌mTOR含量和mRNA都有顯著性增加（P<0.05），S6K1mRNA極顯著性升高（P<0.01），E組骨骼肌mTOR含量無顯著性差異，mTOR和S6K1mRNA顯著性下降（P<005）。與H組比較，HE組骨骼肌mTOR含量有所減少，但無顯著性差異（P>0.05），mTOR、S6K1mRNA顯著性減少（P<0.05）

表3 實驗大鼠骨骼肌mTOR蛋白、mTOR和S6K1 mRNA的變化

注：H組、E組與C組相比，*，P<0.05，**，P<0.01；HE組與H組相比，#，P<0.05，##，P<0.01。

2.3 實驗大鼠骨骼肌PI3K、Akt、AMPK含量的變化

從表4可見，與C組比較，H組骨骼肌PI3K和Akt含量無顯著性差異（P>0.05），E組骨骼肌PI3K含量有所增加，但無顯著性差異（P>0.05），Akt含量顯著性增加（P<0.01）；與H組比較，HE組骨骼肌PI3K、Akt含量有增加，但均無顯著性（P>0.05）。與C組比較，E組骨骼肌AMPK含量極顯著性增加（P<0.01），H組骨骼肌AMPK含量下降，但無顯著性差異（P>0.05）；與H組比較，HE組骨骼肌AMPK含量有增加趨勢，但無顯著性（P>0.05）。

表4 實驗大鼠骨骼肌PI3K、AKT、AMPK的變化

注：*與C組相比；**為P<0.01。

3 討論

3.1 mTOR在高脂膳食大鼠骨骼肌IR形成與運動干預中的作用

與C組相比，11周高脂膳食組大鼠體重、FBG和FIns顯著性升高，且HOMA-IR也顯著性升高，說明高脂膳食組產生了IR。與此同時，與H組相比，HE組空腹胰島素有顯著性下降（P<0.05），空腹血糖和HOMA-IR有所下降，但沒有顯著性（P>0.05），說明長期的運動對高脂誘導的IR有一定的干預作用，但不足以完全改善高脂誘導的IR。

不少研究發(fā)現(xiàn)，mTOR/S6K1信號通路與高脂飲食誘導IR的發(fā)生有著密切的關系[3，5-6]。在正常情況下，mTOR參與機體蛋白質合成、細胞增殖、能量代謝等生理活動，但當外界信號如氨基酸過度刺激導致mTOR持續(xù)高度活化時，mTOR通過反饋性途徑產生IR[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，H組骨骼肌mTOR含量和mRNA量都有顯著性增加（P<0.05），S6K1mRNA極顯著性升高（P<0.01），說明高脂膳食引起的血糖和胰島素含量的升高激活了骨骼肌mTOR/S6K1信號通路，使IRS絲氨酸過度磷酸化，從而導致胰島素的反應性下降，誘發(fā)IR的出現(xiàn)。實驗表明，8W的高糖高脂膳食可使大鼠產生肥胖、高FFA及炎癥反應，從而成功誘導大鼠產生IR，并使脂肪組織 PI3K表達降低，P70S6K升高[6]。如將db/db小鼠肝臟S6K1基因沉默后，IR有明顯的改善，特別是在空腹狀態(tài)時，增強了胰島素的信號傳導，糖異生水平下降[7] 。探討其機制，炎癥及高脂等狀態(tài)可使mTOR及其下游靶點S6K1活化加強有可能導致IRS-1絲氨酸磷酸化，從而抑制胰島素的作用，引發(fā)機體產生IR[8-10]。RSK（P90核糖體S6K）能有效抑制IRS-1絲氨酸磷酸化，可能是一個新的調節(jié)IR和糖代謝的因子[11]

研究證實，有氧運動能下調mTOR/S6K1信號通路，增加骨骼肌對胰島素的敏感性，從而改善IR[12]。WangT[13]研究認為，吳茱萸堿可能通過抑制脂肪組織mTOR-S6K信號和IRS1絲氨酸磷酸化，改善葡萄糖耐量，阻止IR的發(fā)生。但是Medeiros C[14]研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練能夠上調飲食性肥胖大鼠心肌中mTOR/p70S6k信號途徑，促進蛋白質合成。本研究進一步研究了長期有氧運動對高脂膳食大鼠骨骼肌mTOR/p70S6k信號途徑的影響，結果發(fā)現(xiàn)，與H組比較，HE組骨骼肌mTOR和S6K1mRNA顯著性下降（P<005），說明長期的有氧運動在一定程度上可下調高脂膳食大鼠骨骼肌mTOR/S6K1mRNA的表達，有效防止IR的形成。

3.2 在IR形成與運動干預中的mTOR變化的可能機制

mTOR主要受到PI3K/AKT/mTOR和LKB1/AMPK/mTOR信號通路的調控[15]。PI3K/Akt/mTOR信號通路是胰島素重要的作用途徑，胰島素、生長因子和細胞因子等可激活PI3K，在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶（PDK）的協(xié)同作用下，導致Akt從胞漿轉位到質膜，并促進Akt的磷酸化，通過mTOR、糖原合成酶激酶-3（GSK-3）等下游底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學效應[16]。但當營養(yǎng)水平過剩時，生長因子等通過mTOR和S6K1可反饋調節(jié)PI3K的激活，導致IR。孟艷[17]實驗證實，PI3K-mTOR信號通路持續(xù)激活時，可以通過下調PDGFR-IRS導致細胞胰島素信號通路的傳遞阻滯，發(fā)生IR現(xiàn)象，這與肥胖伴發(fā)的IR和2型糖尿病有著相似的生物學基礎。但本研究發(fā)現(xiàn)，與C組比較，11周高脂喂養(yǎng)的大鼠（H組）骨骼肌PI3K和Akt含量無顯著性差異（P>0.05），這可能與實驗方法的選擇以及指標測試的方法不同有關。而長期的有氧運動對IR骨骼肌PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響，目前結果并不一致。高晶[18]實驗發(fā)現(xiàn)，與糖尿病組比較，8周有氧運動可使骨骼肌PI3K、Akt、mTOR磷酸化水平均顯著性增加。但Christ-Roberts等研究發(fā)現(xiàn)，8周的有氧運動訓練并不能增加超重非糖尿病與2型糖尿病患者骨骼肌中PI3K的活性[19]。在本實驗中，與C組比較，E組骨骼肌PI3K含量有所增加，但無顯著性差異（P>0.05），Akt含量顯著性增加（P<0.01）；與H組比較，HE組骨骼肌PI3K、Akt含量有增加，但均無顯著性（P>0.05）。從而進一步說明長期的有氧運動并不能有效地提高高脂膳食大鼠骨骼肌中PI3K、Akt含量。

AMPK能夠參與細胞和組織的糖脂代謝，調節(jié)機體的能量攝入和消耗。長期高脂飲食可減少肝臟組織AMPKα蛋白的磷酸化和AMPK的活性，影響體內能量代謝[20]。有研究表明，AMPK也是mTOR重要的上游調節(jié)因子。在SD大鼠血管平滑肌細胞中，AICAR激活AMPK可以顯著抑制細胞內mTOR的mRNA表達，并顯著抑制p-mTOR的活性[21]。Saha AK[22]在調節(jié)葡萄糖和亮氨酸誘導的IR實驗中發(fā)現(xiàn)，AMPK可下調mTOR/p70S6K活性。電刺激引起的肌肉收縮可激活AMPK，從而減弱Akt/mTOR、S6K1、4E-BP1和eEF2的信號作用，并認為AMPK對PI3K信號通路可發(fā)揮雙重作用，即激活PI3K/Akt和抑制mTOR/p70S6K[23]。AMPK激活后一方面能夠直接磷酸化mTORThr2446位點而抑制其活性[24]，另一方面通過激活TSC2而間接抑制mTOR的活性[25]。運動時細胞內AMP/ADP明顯升高，可激活AMPK進而抑制mTOR的活性[26]。而長期的運動訓練可以使骨骼肌細胞AMPK表達水平及其活性顯著升高，從而抑制mTOR的活性[27]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，與C組相比，H組大鼠骨骼肌AMPK含量降低，mTOR含量和S6K1mRNA顯著性升高，運動組骨骼肌AMPK含量顯著性增加，高脂運動組骨骼肌mTOR和S6K1mRNA顯著性下降，從而說明AMPK途徑可能參與了運動對mTOR/S6K1信號通路的調節(jié)。由此推斷運動刺激或能量限制引起AMPK的激活，可直接磷酸化mTOR而抑制其活性，從而減輕高脂膳食引起mTOR過度激活而形成的IR。因此，長期的高脂膳食激活mTOR可能引起胰島素受體底物的作用減弱，從而導致IR的發(fā)生；而長期的有氧運動可激活AMPK，導致mTOR的下降，從而改善IR。

4 結論

4.1 長期的高脂膳食可激活mTOR/S6K1信號通路，導致胰島素抵抗的發(fā)生。

4.2 有氧運動可激活AMPK，抑制mTOR的作用，AMPK/mTOR/S6K1可能在運動干預高脂膳食誘導IR形成中起著重要的作用。

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