菟絲子提取物對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老作用

菟絲子提取物對(duì)D-半乳糖所致衰老小鼠的抗衰老作用

何志堅(jiān)施旻1劉海云

(江西省腫瘤醫(yī)院放療科，江西南昌330029)

摘要〔〕目的探討菟絲子提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性衰老小鼠的抗衰老作用及機(jī)制。方法以D-半乳糖致亞急性衰老小鼠為模型,同時(shí)給予灌胃不同濃度的菟絲子提取物, 6 w后, 觀察各組小鼠的行為學(xué)及學(xué)習(xí)記憶改變，分別測(cè)定小鼠脾臟和胸腺指數(shù),采用比色法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性。結(jié)果菟絲子提取物能明顯改善衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,提高胸腺及脾指數(shù),顯著增加SOD和GSH-Px活性, 降低血清MDA含量。結(jié)論菟絲子提取物抗衰老作用可能通過(guò)提高抗氧化酶SOD、GSH-Px活力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物MDA含量而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞〔〕菟絲子提取物；D-半乳糖；衰老；超氧化物歧化酶；丙二醛；谷脫甘肽過(guò)氧化物酶

中圖分類號(hào)〔〕R285.5〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：江西省教育廳青年科學(xué)

通訊作者：劉海云(1979-)，女，講師，碩士，主要從事中醫(yī)藥抗衰老研究。

1江西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

第一作者：何志堅(jiān)(1974-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤學(xué)研究。

衰老雖不可避免, 但延緩衰老卻是可能的〔1〕。目前衰老的病理機(jī)制尚不完全清楚,存在多種學(xué)術(shù)觀點(diǎn),自由基學(xué)說(shuō)是其中較重要的一種觀點(diǎn)。菟絲子為旋花科一年生寄生性蔓草菟絲子或大菟絲子的成熟種子。具有補(bǔ)肝腎、益精明目、固精縮尿、止瀉安胎的功效〔2〕。菟絲子作為一種常用的補(bǔ)陽(yáng)藥物，在生殖內(nèi)分泌方面的研究較多，但在抗衰老方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)從衰老的氧化損傷入手，采用D-gal衰老模型小鼠〔3〕，通過(guò)觀察菟絲子提取物對(duì)小鼠行為學(xué)及學(xué)習(xí)記憶的影響研究其抗衰老作用,并通過(guò)測(cè)定菟絲子提取物對(duì)小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性以及對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響,初步探討其抗氧化、抗衰老作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物昆明種5周齡小鼠50只, 體重20～25 g,雌雄各半，購(gòu)自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(生產(chǎn)合格證號(hào)：2012A005)。各組小鼠同室分籠飼養(yǎng),顆粒飼料喂養(yǎng),自由飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2 試劑D-半乳糖(批號(hào)：274512)購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。SOD測(cè)定試劑盒(批號(hào)20120121)、MDA測(cè)定試劑盒(批號(hào)20120217)、GSH-Px活力測(cè)定試劑盒(批號(hào)20120214)均購(gòu)于南京建成生物公司，菟絲子購(gòu)自南昌新圣愛(ài)國(guó)藥館,其他常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)，723型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠), YLs-3T型跳臺(tái)記錄儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站),微量進(jìn)樣器(德國(guó)eppendorf公司),AdventurerTM電子天平(奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司)，TGL16G型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)，TECAN酶標(biāo)儀Sunrise(奧地利TECAN公司)

1.4方法

1.4.1 菟絲子提取物的制備〔4〕菟絲子藥材500 g，加4 000 ml水浸泡2 h，至微脹，文火煎2次，每次煎煮0.5 h,過(guò)濾。合并2次提取液，濃縮至生藥濃度為0.4 g/ml，置4℃冰箱貯藏，備用。

1.4.2 動(dòng)物分組與給藥小鼠隨機(jī)分為五組:正常對(duì)照組、模型組、菟絲子提取物100、200、300 mg/kg劑量組，每組10只。除正常對(duì)照組外,其他各組按文獻(xiàn)〔5〕方法造模。將D-gal溶于注射用水,體積分?jǐn)?shù)10%,注射劑量為10 ml/kg,頸背部皮下注射,每日1次,連續(xù)6 w,正常對(duì)照組注射同體積的0.9%生理鹽水。在造模的同時(shí), 按低、中、高劑量菟絲子組,每日1次,灌胃給藥,正常對(duì)照組和衰老模型組給同體積的0.9%生理鹽水，連續(xù)6 w。

1.4.3 小鼠一般行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠一般行為改變,包括進(jìn)食、活動(dòng)、毛色改變等情況,每7天稱小鼠體重,觀察各組小鼠體重變化情況。

1.4.4 胸腺和脾臟指數(shù)的測(cè)定準(zhǔn)確稱取小鼠胸腺、脾臟濕重后,計(jì)算各臟器指數(shù)。

1.4.5 學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試(小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)) 實(shí)驗(yàn)裝置為一長(zhǎng)方形反射箱,大小為32 cm×22.5 cm×33 cm,用黑色塑料板分隔成6間。底面鋪以銅柵,間距為0.5 cm,每間左角置一高度和直徑均為4.5 cm的橡膠平臺(tái)。將小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min,然后立即通以32 V交流電,其正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。如此訓(xùn)練5 min, 24 h后重做測(cè)試,記錄動(dòng)物第1次跳下平臺(tái)的潛伏期和5 min之內(nèi)跳下平臺(tái)受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))〔6〕。

1.4.6 血清和腦組織的制備末次給藥后30 min眼眶取血，3 000 r/min離心10 min取血清。取血后迅速在冰上取腦組織,用冰冷的生理鹽水(4℃)沖洗2次，濾紙拭干后,立即稱重,剪碎組織塊后，置于勻漿瓶中用9倍冰冷生理鹽水勻漿10 min(勻漿器的末端置于冰水中)，分別制成10%腦組織勻漿,然后以3 000 r/min離心15 min,取上清液待用，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.7 血清中MDA水平、SOD活性和GSH-Px測(cè)定按測(cè)試盒說(shuō)明書方法測(cè)定血清中SOD活性、MDA和GSH-Px含量,重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0軟件行方差分析及t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1 菟絲子提取物對(duì)小鼠一般行為學(xué)指標(biāo)的影響造模前各組動(dòng)物反應(yīng)良好,毛發(fā)光滑,飲食正常,行動(dòng)敏捷。實(shí)驗(yàn)期間, 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)一死亡。與正常對(duì)照組相比,造模后2 w起衰老模型組小鼠進(jìn)食減少,體重減輕,活動(dòng)減少,行動(dòng)緩慢,反應(yīng)遲鈍,嗜睡,毛發(fā)干枯發(fā)黃缺乏光澤,尾部出現(xiàn)色素斑點(diǎn)沉著并逐漸加重。菟絲子提取物不同劑量實(shí)驗(yàn)組小鼠的靈敏度和皮毛光澤較正常對(duì)照組雖有所下降,但比衰老模型組更靈活,皮毛更光澤。

2.2 菟絲子對(duì)衰老小鼠跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)的影響在第1天的學(xué)習(xí)測(cè)試中,衰老模型組小鼠5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)較正常對(duì)照組明顯增多,菟絲子中、高劑量組小鼠5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)較衰老模型組明顯減少(P<0.01)。在第2天的記憶測(cè)試中,衰老模型組小鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期較正常對(duì)照組顯著縮短, 5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P<0.01),菟絲子低、中、高劑量組小鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期明顯延長(zhǎng), 5 min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少(P<0.05，P<0.01),并呈劑量依賴性。見表1。

2.3 菟絲子提取物對(duì)衰老小鼠臟器指數(shù)的影響與正常對(duì)照組比較,衰老模型組小鼠胸腺、脾指數(shù)均顯著減小(P<0.05,P<0.01)；菟絲子低、中、高劑量組小鼠胸腺、脾指數(shù)明顯增大,并呈劑量依賴性(P均<0.05)。見表2。

2.4 菟絲子提取物對(duì)衰老小鼠血清SOD、MDA和GSH-Px活性的影響與正常對(duì)照組比較,衰老模型組小鼠血清中MDA含量顯著提高(P<0.05), SOD和GSH-Px活性明顯降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，菟絲子中、高劑量組MDA含量

表1　菟絲子提取物對(duì)衰老小鼠記憶

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

表2　菟絲子提取物對(duì)衰老小鼠臟器指

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與衰老模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同

顯著降低(P<0.05), SOD和GSH-Px活性明顯升高(P<0.05，P<0.01),并呈劑量依賴性。見表3。

表3　菟絲子提取物對(duì)衰老小鼠血清SOD、MDA和

3討論

衰老是指生物體在正常環(huán)境條件下發(fā)生的功能減退, 逐漸趨向死亡的現(xiàn)象, 是機(jī)體在成年以后隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸產(chǎn)生的一系列生理功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)方面的變化。眾所周知, 由于衰老原因紛繁復(fù)雜,但眾多的學(xué)說(shuō)之中, 最為中外學(xué)者所認(rèn)同的是自由基學(xué)說(shuō)。隨著年齡的增長(zhǎng),自由基產(chǎn)生增多,而清除自由基的相關(guān)酶活性下降以及機(jī)體免疫功能下降等多種因素均是機(jī)體發(fā)生衰老的重要機(jī)制〔7〕。D-半乳糖致衰老小鼠模型，D-半乳糖在半乳糖氧化酶作用下，參與氧化反應(yīng)，生成糖和過(guò)氧化氫反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生超氧陰離子自由基，其過(guò)量損傷可產(chǎn)生衰老反應(yīng)〔8〕。本實(shí)驗(yàn)表明菟絲子提取物具有抗氧化的作用,這可能與其直接或間接清除自由基對(duì)機(jī)體的損害作用,消除D-半乳糖引起的自由基產(chǎn)生增多,避免了因抗氧化性物質(zhì)消耗而導(dǎo)致組織損傷有關(guān),從而達(dá)到延緩衰老的作用。

本研究采用D-半乳糖小鼠頸背部皮下注射6 w,造成亞急性衰老小鼠模型,其一般狀態(tài)欠佳,跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力顯著減退,而菟絲子各劑量組小鼠毛色光澤、精神狀態(tài)良好,學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。

組織器官的重量,特別是腦、胸腺、脾、肝、腎等重要器官的重量變化是反映生物體衰老程度的重要指標(biāo)〔9〕。免疫器官衰變最明顯的是胸腺和脾,胸腺和脾重量的降低、萎縮、功能衰退可使免疫功能降低,導(dǎo)致老年動(dòng)物(人)惡性疾病發(fā)生率增高,加速老化進(jìn)程〔10〕。本研究結(jié)果說(shuō)明菟絲子提取物能夠有效對(duì)抗小鼠免疫器官的衰老,保持機(jī)體的免疫功能,提高抗病能力,從而對(duì)延緩衰老具有積極的意義。

SOD 和 GSH-Px 是機(jī)體清除自由基的主要抗氧化酶，其含量可間接反映機(jī)體清除自由基的能力。脂質(zhì)過(guò)氧化是氧自由基損傷組織的重要方式。MDA生成的多少可間接反映組織細(xì)胞損傷的程度〔11〕。本實(shí)驗(yàn)表明兩者可提高體內(nèi)抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)生，增強(qiáng)體內(nèi)自身抗氧化能力，對(duì)延緩衰老能起到一定的積極作用。

4參考文獻(xiàn)

1劉煥蘭, 武夏林, 曲衛(wèi)玲，等. 瓊玉口服液對(duì)衰老小鼠腦組織SOD活性及血清中SOD 和MDA含量的影響〔J〕.吉林中醫(yī)藥，2013;33(3):278-80.

2李建平，王靜，張躍文，等.菟絲子的研究進(jìn)展〔J〕. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009;6(23):5-6.

3郭紅艷,張鵬霞,歐芹，等.山茱萸對(duì)衰老大鼠蛋白質(zhì)非酶糖化及DNA損傷的影響〔J〕.中國(guó)臨床康復(fù), 2010;14(19):136-7.

4蘭鴻，杜士明. 菟絲子提取物對(duì)自然衰老小鼠的抗衰老作用研究〔J〕.中國(guó)藥房，2010;39(21):3667-9.

5戴士勇.人類的衰老與抗衰老〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥, 2006;1(12): 764-5.

6張丹,王亞芳,張建軍.藏藥旺拉提取物CE對(duì)亞急性衰老小鼠學(xué)習(xí)記憶及抗氧化能力的影響〔J〕.中國(guó)新藥雜志, 2005;14 (11):1301-3.

7張延英,李廣遠(yuǎn),吳紅彥，等. 鎖陽(yáng)蜜對(duì)小鼠抗應(yīng)激及抗衰老的影響〔J〕. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010;16(2):33-4.

8金英子，張紅英，孫曉宇.馬齒莧不同提取物對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠空間學(xué)習(xí)能力的影響〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011;17(12):178-81.

9劉濤,王燦暉,楊進(jìn)，等. 改良三甲散抗腦衰老的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志,2006;26(7): 208-9.

10王春梅,李香艷,崔新穎. 酸櫻桃汁對(duì)衰老模型小鼠的抗衰老作用及其機(jī)制〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011;31(2):455-7.

11王嵐，梁日欣，楊濱，等. 黃芩及紅花水提物對(duì)快速老化模型小鼠的抗衰老作用研究〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010;16(13):159-61.

〔2014-03-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)