芎歸湯主要化學(xué)成分的HPLC-TOF-MS分析

·論著·

芎歸湯主要化學(xué)成分的HPLC-TOF-MS分析

呂亞男，譚光國(解放軍22醫(yī)院，青海 格爾木 816000)

[摘要]目的 通過高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜(HPLC-TOF-MS)聯(lián)用技術(shù)，對中藥復(fù)方芎歸湯中的主要化學(xué)成分進(jìn)行有效鑒定。方法 色譜分離采用資生堂 CAPCELL PAK C18反相柱(100 mm×3.0 mm，3 μm)，流動相組成分別為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫，流速為0.4 ml/min；質(zhì)譜定性采用飛行時間質(zhì)譜，正離子模式掃描。結(jié)果 在優(yōu)化的液質(zhì)聯(lián)用條件下，通過飛行時間質(zhì)譜鑒定了芎歸湯中47種主要成分，并對其藥材來源進(jìn)行了歸屬。結(jié)論 通過HPLC-TOF-MS聯(lián)用技術(shù)，為鑒定芎歸湯中的化學(xué)成分建立起了一種快速、高效的分析方法。

[關(guān)鍵詞]芎歸湯；高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜；化學(xué)成分

[基金項目]全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目(13QNT197)

[作者簡介]呂亞男，本科，護(hù)師.研究方向：中藥分析.E-mail：494084923@qq.com

[通訊作者]譚光國，博士，主管藥師.研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究.Tel:(0979)8401749；E-mail：guangguotan@gmail.com

[中圖分類號]R917[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2014.05.012

[收稿日期]2013-08-09[修回日期]2014-01-11

Analysis on chemical constituents of Xionggui Decotion by HPLC-TOF-MS

LU Yanan，TAN Guangguo(No.22 Hospital of PLA，Golmud 816000，China)

Abstract[]ObjectiveTo analyze chemical constituents of Xionggui Decotion by rapid-resolution (high performance) liquid chromatography-time of flight mass spectrometry (HPLC-TOF-MS).MethodsA Shelloseido column(100 mm×3.0 mm，3 μm)was used to separate.The mobile phase consisted of water containing 0.1% methane acid and acetonitrile was used as gradient elute.The flow rate was 0.4 ml/min.TOF-MS was applied for qualitative analysis under positive ion mode.ResultsUnder LC/MS condition，47 major constituents in Xionggui Decotion were identified by time of flight mass spectrometry and structure-relevant fragment ions.ConclusionA simple and reliable method using HPLC-TOF-MS was established to identify the chemical constituents of Xionggui Decotion.

[Key words]Xionggui Decotion；HPLC-TOF-MS；chemical constituents

芎歸湯出自宋·許叔微的《普濟(jì)方》卷三四五引《通真子秘方》，由當(dāng)歸和川芎兩味中藥組成，為臨床常用方劑，對于婦人產(chǎn)后乳懸，惡露不下，腹痛，或下血太多，眩暈不能支持；或妊娠胎動，腹痛下血療效顯著。陳立峰等[1]以芎歸湯加入一味開竅醒神中藥得到加味芎歸湯研究其對大鼠腦缺血模型的作用。王志琪等[2]進(jìn)一步研究了加味芎歸湯對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。但目前尚未見到有關(guān)芎歸湯主要化學(xué)成分分析的報道。而中藥復(fù)方中多成分的鑒定分析是中藥現(xiàn)代化研究的重要組成部分之一，對闡明中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、質(zhì)量控制、開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重要意義。傳統(tǒng)分析方法通常需要經(jīng)過復(fù)雜的分離和提取過程而得到單一化學(xué)成分，而后還要用核磁共振(NMR)、質(zhì)譜(MS)等其他分析技術(shù)進(jìn)行鑒定。這些方法費(fèi)時、費(fèi)力，并且只鑒定某一類化合物，難以完整、系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥復(fù)方中多種成分的復(fù)雜性[3]。而高分辨率飛行時間質(zhì)譜(HPLC-TOF-MS)作為新興且發(fā)展迅速的質(zhì)譜技術(shù)，不僅具有檢測靈敏度高，測定化合物質(zhì)荷比精確，離子掃描范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，同時動態(tài)調(diào)節(jié)碎片電壓，可獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，可用于中藥中同分異構(gòu)體的區(qū)分，現(xiàn)已越來越多地用于中藥分析中[4，5]。

本研究采用HPLC-TOF-MS技術(shù)對芎歸湯中多成分進(jìn)行鑒別，該法操作簡便、快速、準(zhǔn)確，為芎歸湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

1儀器和試藥

安捷倫1200型液相色譜儀，包括在線脫氣機(jī)、二元泵、高性能自動進(jìn)樣器；安捷倫G6220A飛行時間質(zhì)譜儀，配有標(biāo)準(zhǔn)電噴霧離子源(ESI)、MassHunter色譜工作站和Qualitative Analysis質(zhì)譜分析軟件；R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申勝生物技術(shù)有限公司)。

HPLC級乙腈(Merck，Germany)；HPLC級甲酸(Tedia，USA)；無水乙醇為分析醇(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；水為娃哈哈純凈水。

當(dāng)歸、川芎藥材購自上海雷允上北區(qū)中達(dá)大藥房。

2試驗

2.1　色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1色譜條件色譜柱：資生堂 CAPCELL PAK C18反相柱(100 mm×3.0 mm，3 μm)，流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫：0~5 min(10%~25%，B)，5~25 min(25%~75%，B)，42~50 min(95%，B)；柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積3 μl，流速0.4 ml/min。

2.1.2質(zhì)譜條件電噴霧正離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z110～1 000；毛細(xì)管電壓4 000 V；霧化氣壓力40 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碎片電壓120 V。選擇參比校準(zhǔn)液做實時質(zhì)量數(shù)校正。實驗數(shù)據(jù)采用Qualitative Analysis軟件處理。測定樣品之前，使用調(diào)諧液校準(zhǔn)質(zhì)量軸，以保證質(zhì)量精度誤差小于2/100萬。

2.2　供試品溶液制備

按芎歸湯處方比例稱取當(dāng)歸5 g、川芎5 g，加入80%乙醇100 ml，加熱回流2 h，取5 ml醇提液，10 800 r/min離心5 min，取上清液在“2.1”項下色譜條件下進(jìn)樣分析。單味藥材采用類似的方法進(jìn)行處理。

2.3　芎歸湯中化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的建立

根據(jù)芎歸湯各組方藥材的化學(xué)成分研究報道，收集了當(dāng)歸化學(xué)成分117個，川芎化學(xué)成分240個，并通過安捷倫“formula-database-generator”軟件建立芎歸湯各組方藥材中已知化學(xué)成分的數(shù)據(jù)庫。

3結(jié)果與討論

3.1　實驗條件優(yōu)化

首先考察了甲醇-水和乙腈-水兩種體系，結(jié)果顯示乙腈的洗脫效果要優(yōu)于甲醇，故選擇乙腈作為有機(jī)相。在流動相體系中加入甲酸可增加質(zhì)譜響應(yīng)，實驗考察了甲酸的添加量對分離的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲酸濃度在0.1%時大多數(shù)成分有不錯的質(zhì)譜響應(yīng)。因此，最終采用0.1%甲酸水溶液作為水相。

質(zhì)譜檢測分別比較了正、負(fù)離子兩種掃描模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正模式下峰容量更大、質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，故實驗最終選擇在正模式下進(jìn)行。

3.2　芎歸湯中主要化學(xué)成分的鑒別

在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下，芎歸湯提取液的HPLC-TOF-MS典型總離子流圖見圖1。同時，筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)，單味藥材中大多數(shù)高響應(yīng)的化合物都能在芎歸湯中被檢測到，這些化合物的濃度比類似于芎歸湯，因此，筆者認(rèn)為芎歸湯在混合提取的過程中沒有產(chǎn)生明顯的新成分，也沒有發(fā)生顯著的化學(xué)反應(yīng)。筆者對其中主要的47個峰進(jìn)行了鑒別，其中包括3對同分異構(gòu)體。3對異構(gòu)體皆為順反異構(gòu)體，即質(zhì)譜裂解所得碎片離子相同，僅存在豐度上的區(qū)別，故通過對比標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間和質(zhì)譜圖，判定峰23為黃樟醚，峰24為3-苯基甲基-2-丙烯酸。同樣的方法判斷另兩對同分異構(gòu)體，結(jié)果，推斷峰4為E-丁烯基苯酞，峰20為Z-丁烯基苯酞；峰15和峰27分別為洋川芎內(nèi)酯H和I。其他化合物按照以下方法鑒別：首先，根據(jù)TOF-MS上所得到的精確化合物分子量信息，通過Mass Hunter軟件在質(zhì)量偏差5/100萬范圍內(nèi)計算其可能的元素組成，并將其與所建的數(shù)據(jù)庫相匹配，對芎歸湯化學(xué)成分進(jìn)行初步鑒別。然后調(diào)節(jié)碎片電壓至360 V，獲得化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子，根據(jù)離子裂解情況，結(jié)合數(shù)據(jù)庫中各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，再結(jié)合有關(guān)文獻(xiàn)報道[6-9]，得到鑒別結(jié)果，見表1。同分異構(gòu)體鑒別結(jié)果見表2。

注：a.川芎中的成分;b.當(dāng)歸中的成分

表2　同分異構(gòu)體鑒別結(jié)果

以[M+H]+m/z為191.107的峰30和34為例來說明鑒別過程。在碎片電壓120 V條件下，峰30和峰34的分子離子峰均為191.107。由于TOF高質(zhì)量精度的測量特性能夠獲得準(zhǔn)確的元素組成，峰30和峰34的元素組成均為C12H14O2，有相同的準(zhǔn)分子離子峰m/z191[M+H]+，m/z213[M+Na]+。根據(jù)文獻(xiàn)[10-13]，可知這兩個化合物分別為順反異構(gòu)體E-ligustilide和Z-ligustilide。為進(jìn)一步鑒別這對順反異構(gòu)體，調(diào)節(jié)碎片電壓至360 V，得到此電壓條件下的質(zhì)譜圖。峰30和峰34的質(zhì)譜圖上有明顯的m/z163[M+H-CO]+，m/z155[M+H-2H2O]+等碎片峰。根據(jù)文獻(xiàn)[10，11，13]對兩個順反異構(gòu)體的色譜保留規(guī)律的報道，其碎片裂解規(guī)律相似，但保留時間有明顯的差異，使用反相C18色譜柱時，E-ligustilide出峰較早，Z-ligustilide出峰較晚。據(jù)此判斷，筆者能夠鑒定峰30為E-ligustilide，峰34為Z-ligustilide。E-ligustilide和Z-ligustilide有相同的裂解碎片離子峰，僅存在豐度上的差別，故它們有相同的裂解規(guī)律，以Z-ligustilide為例，推測其可能的裂解途徑(圖2)。與第一對同分異構(gòu)體相似，峰15和27的分子離子峰均為225，根據(jù)文獻(xiàn)[10-13]，分別為洋川芎內(nèi)酯H和洋川芎內(nèi)酯I，在360 V電壓下有相同的碎片離子峰，僅豐度上稍有差別，其質(zhì)譜裂解途徑也相同。峰4和峰20分子離子峰均為189，相同的文獻(xiàn)[10-13]為依據(jù)，可知應(yīng)為Z-丁烯基苯酞和 E-丁烯基苯酞，根據(jù)文獻(xiàn)[10，11，13]，使用反相C18色譜柱時，反式結(jié)構(gòu)的保留時間比順式的要少，可判斷4為E-丁烯基苯酞，20為Z-丁烯基苯酞。采用類似的方法，能夠?qū)ζ渌逡策M(jìn)行相應(yīng)的鑒別。

圖2　Z-ligustilide的 ESI-MS裂解途徑

4結(jié)論

本實驗采用HPLC-TOF-MS技術(shù)，實現(xiàn)了對芎歸湯中主要成分的快速定性分析?？偣茶b定出47個活性成分，并對其藥材來源進(jìn)行歸屬。該技術(shù)為中藥復(fù)方多成分分析提供了一種有效、可靠的方法，也同樣適用于其他復(fù)雜體系的分析。

【參考文獻(xiàn)】

[1]陳立峰，徐琳本，王曉洪，等.加味芎歸湯對大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用和血液流變學(xué)的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16(11):157-164.

[2]王志琪，王曉洪，陳立峰.加味芎歸湯對大鼠全腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(15):206-210.

[3]Zhan ZJ，F(xiàn)an CQ，Ding J，etal.Novel diterpenoids with potent inhibitory activity against endothelium cell HMEC and cytotoxic activities from a well-known TCM plant Daphne genkwa[J].Bioorg Med Chem，2005，13(31):645-655.

[4]Zhu Z，Zhang H，Zhao L，etal.Rapid separation and identification of phenolic and diterpenoid constituents from Radix Salvia miltiorrhizae by high-performance liquid chromatography diode-array detection，electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry and electrospray ionization quadrupole ion trap mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectr，2007，21(12):1855-1865.

[5]Zhao L，Lou ZY，Zhu ZY，etal.Characterization of constituents inStellerachamaejasmeL.by rapid-resolution liquid chromatography-diode array detection and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Biomed Chromatogr，2008，22(11):64-72.

[6]Li SL，Chan SK，Lin G，etal.Simultaneous analysis of seventeen chemical ingredients ofLigusticumchuanxiongby on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometry[J].Plant Med，2003，69(5)：445-451.

[7]Liang MJ，He LC，Yang GD.Screening，analysis andinvitrovasodilatation of effective components fromLigusticumchuanxiong[J].Life Sci，2005，78(2)：128-133.

[8]Peng Z，Bi ZM，Li P，etal.LC-DAD-MS determination of the major constituents in RadixAngelicaesinensis[J].Chromatographia， 2008，67：973-978.

[9]Yi L，Liang Y，Wu H，etal.The analysis of RadixAngelicaesinensis(Danggui)[J].J Chromatogr A，2009，1216(11)：1991-2001.

[10]Lin LZ，He XG，Lian LZ，etal.Liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric study of the phthalides ofAngelicasinensisand chemical changes of Z-ligustilide[J].J Chromatogr A，1998，810：71-79.

[11]Lu GH，Kelvin C，Liang YZ，etal.Development of high-performance liquid chromatographic fingerprints for distinguishing Chinese Angelica from related umbelliferae herbs[J].J Chromatogr A，2005，1073(1-2)：383-392.

[12]Li SL，Lin G，Chung HS，etal.Study on fingerprint ofRhizomechuanxiongby HPLC-DAD-MS[J].Acta Pharm Sin，2004，39(8)：621-626.

[13]Lao SC，Li SP，Kelvin K，etal.Identification and quantification of 13 components inAngelicasinensis(Danggui)by gas chromatography mass spectrometry coupled with pressurized liquid extraction[J].Anal Chim Acta，2004，526：131-137. L，Lou ZY，Zhu ZY，etal.Characterization of constituents inStellerachamaejasmeL.by rapid-resolution liquid chromatography-diode array detection and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry[J].Biomed Chromatogr，2008，22(11):64-72.

[6]Li SL，Chan SK，Lin G，etal.Simultaneous analysis of seventeen chemical ingredients ofLigusticumchuanxiongby on-line high performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrometry[J].Plant Med，2003，69(5)：445-451.

[7]Liang MJ，He LC，Yang GD.Screening，analysis andinvitrovasodilatation of effective components fromLigusticumchuanxiong[J].Life Sci，2005，78(2)：128-133.

[8]Peng Z，Bi ZM，Li P，etal.LC-DAD-MS determination of the major constituents in RadixAngelicaesinensis[J].Chromatographia， 2008，67：973-978.

[9]Yi L，Liang Y，Wu H，etal.The analysis of RadixAngelicaesinensis(Danggui)[J].J Chromatogr A，2009，1216(11)：1991-2001.

[10]Lin LZ，He XG，Lian LZ，etal.Liquid chromatographic-electrospray mass spectrometric study of the phthalides ofAngelicasinensisand chemical changes of Z-ligustilide[J].J Chromatogr A，1998，810：71-79.

[11]Lu GH，Kelvin C，Liang YZ，etal.Development of high-performance liquid chromatographic fingerprints for distinguishing Chinese Angelica from related umbelliferae herbs[J].J Chromatogr A，2005，1073(1-2)：383-392.

[12]Li SL，Lin G，Chung HS，etal.Study on fingerprint ofRhizomechuanxiongby HPLC-DAD-MS[J].Acta Pharm Sin，2004，39(8)：621-626.

[13]Lao SC，Li SP，Kelvin K，etal.Identification and quantification of 13 components inAngelicasinensis(Danggui)by gas chromatography mass spectrometry coupled with pressurized liquid extraction[J].Anal Chim Acta，2004，526：131-137.

[本文編輯]陳靜