百蕊草提取物對(duì)免疫球蛋白A腎病模型大鼠的治療作用

·論著·

百蕊草提取物對(duì)免疫球蛋白A腎病模型大鼠的治療作用

閆俊1，2，唐大海1，宣偉東1，范正平1，胡水根1(1.解放軍411醫(yī)院藥學(xué)科，上海 200081；2.江西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 南昌 333004)

[摘要]目的考察百蕊草提取物對(duì)免疫球蛋白A腎病(IgAN)模型大鼠的治療效果，以明確有效部位。方法采用水煎提取百蕊草，AB-8大孔樹脂吸附，乙醇梯度洗脫制備各部位。給予大鼠口服牛血清蛋白(400 mg/kg)，皮下注射蓖麻油、CCl4聯(lián)合尾靜脈注射脂多糖造模。從第8周起，對(duì)陽性組[雷公藤多苷(LGT)，10 mg/kg]、水提取物組(TT，1.0 g/kg)、水溶性部位組(TTW，0.4 g/kg)、極性部位組(TT20，0.4 g/kg)和中等極性部位組大鼠(TT50，0.4 g/kg)每天灌胃給藥，空白組和模型組給予生理鹽水(n=8)，連續(xù)5周。觀察各組大鼠24 h尿量、24 h尿蛋白、尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行血液生化指標(biāo)檢測(cè)、免疫熒光檢測(cè)、腎組織的病理學(xué)檢查。結(jié)果與空白組相比，模型組大鼠的24 h尿蛋白、尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量、血清中肌酐、尿素氮水平均顯著升高。與模型組相比，TT組和TT50組的24 h尿蛋白(P<0.05)、尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)、血清肌酐和尿素氮水平(P<0.05)降低。各給藥組腎組織系膜區(qū)的免疫復(fù)合物沉積減少、腎小球增大、系膜基質(zhì)增生、腎小管的損傷狀況改善。結(jié)論百蕊草水提物及其中等極性部位對(duì)IgA腎病大鼠具有良好的治療作用，其效果優(yōu)于陽性對(duì)照雷公藤多苷。

[關(guān)鍵詞]百蕊草；免疫球蛋白A腎病；SD大鼠；中藥治療

[基金項(xiàng)目]上海市衛(wèi)生局局級(jí)科研課題(2012085)

[作者簡介]閆俊，碩士研究生.E-mail:yanjun0828@126.com

[通訊作者]宣偉東，博士，副主任藥師.研究方向：中藥與天然藥物，醫(yī)院制劑.E-mail:wdxuan2010@126.com

[中圖分類號(hào)]R965[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI[]10.3969/j.issn.1006-0111.2015.01.007

[收稿日期]2013-12-04[修回日期]2014-07-03

Therapeutic effects ofThesiumchinensisextracts on IgAN rats

YAN Jun1，2，TANG Dahai1，XUAN Weidong1，F(xiàn)AN Zhengping1，HU Shuigen1(1.No.411 Hospital of PLA，Shanghai 200434，China；2.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 333004，China)

Abstract[]ObjectiveTo evaluate the therapeutic effects of Thesium chinensis Turcz extracts on IgA nephropathy (IgAN) rats.MethodsThe hot water extracted solution of Thesium chinensis Turcz flow through the AB-8 macroreticular resin column repeatedly，then being eluted with different contents of ethanol to get four part of extract.The IgAN model of SD rats were established by oral intake of bovine serum albumin(BSA，400 mg/kg) together with injection of lipopolysaccharide(LPS) and CCl4.Beginning with 8th week，the positive group(LGT，10 mg/kg)，water extract group(TT，1.0 g/kg)，water soluble group(TTW，0.4 g/kg)，high polarity group(TT20，0.4 g/kg) and medium polarity group(TT50，0.4 g/kg) rats were intragastric administrated drug daily，the normal group control and model control group rats were given with saline(n=8).During the next 5 weeks treatment process，the 24 h urine volume，24 h urine protein concentration，and quantity of erythrocyte in urine were observed.The levels of TP，ALP，ALT，AST，Scr and BUN in serum were determined.The expression of IgA deposition was measured by immunofluorescence staining，and the pathological changes of kidney tissue were assayed after the therapy process.ResultsAfter 5 weeks therapy，the 24 h urine protein concentration，the quantity of erythrocyte in urine，and the level of Scr and BUN of TT and TT50 groups were significantly lower than model control.The fluorescence intensities in the mesangial area were weaker than model control.Also，the degrees of renal capsule expansion and mesangial matrix proliferations，and the kidney tubules damage of TT and TT50 groups were weaker than those of model control.ConclusionThe water extract and its medium polarity fraction of Thesium chinensis Turcz show good therapeutic effects on IgAN rats.

[Key words]ThesiumchinensisTurcz；IgAN；SD rats；TCD therapy

免疫球蛋白A腎病(IgA nephropathy，IgAN)是一種以IgA為主的免疫球蛋白伴補(bǔ)體C3，伴或不伴有其他免疫復(fù)合物沉積，呈顆粒狀沉積于腎小球系膜區(qū)的病理綜合征，臨床上以血尿或血尿伴蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)，是最常見的一種腎小球腎炎[1]。百蕊草ThesiumchinensisTurcz為檀香科百蕊草屬多年生寄生草本，有清熱解毒、補(bǔ)腎固精之功效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，百蕊草具有利尿、消除水腫、降低尿蛋白、降血脂、提高血清蛋白等作用，對(duì)腎病綜合征大鼠具有良好的治療效果[2]。本研究采用改進(jìn)的口服牛血清蛋白，皮下注射蓖麻油、四氯化碳，聯(lián)合尾靜脈注射脂多糖的方法建立IgAN大鼠模型[3]，考察百蕊草水提取物及其經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附，不同濃度乙醇洗脫后得到的各組分對(duì)IgAN大鼠的治療作用，以此評(píng)價(jià)百蕊草對(duì)IgAN的治療效果，明確有效部位，探討其可能的作用機(jī)制。

1材料

1.1　動(dòng)物

SD大鼠56只，CL級(jí)，雄性，體重(180±10)g，由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(滬)2010-0019。

1.2　藥物

百蕊草，采集自湖北荊州，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室黃寶康教授鑒定為檀香科百蕊草屬百蕊草ThesiumchinensisTurcz。雷公藤多苷片(LGT，上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號(hào)：100503)，臨用前用生理鹽水配制成混懸液。

1.3　試劑與儀器

AB-8大孔吸附樹脂(天津歐瑞生物科技有限公司，批號(hào)：20100215)；牛血清蛋白(BSA，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20080603)；脂多糖(LPS，SIGMA-ALDRICH，批號(hào)：118K4052)；蓖麻油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20091217)；四氯化碳(CCl4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20091216)；考馬斯亮藍(lán)(G250，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：WF20080715)。電子分析天平(AB104-N，梅特勒-托利多)；紫外分光光度儀(UV-2550，島津)；光學(xué)顯微鏡(CHA-B2，奧林巴斯)；熒光顯微鏡(奧林巴斯)，全自動(dòng)生化分析儀(HITACH7060，日立)，代謝籠(由海軍醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

2方法

2.1　百蕊草提取物及其各部位的制備

百蕊草全草洗凈后加水煎煮2次，每次2 h，合并煎液，過濾，減壓濃縮，制成每毫升含有1 g生藥的濃浸膏，即得百蕊草水提取物(TT)。另取百蕊草適量，按上述方法制備水煎液，過濾，濾液經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附2次，純化水洗滌。經(jīng)吸附、洗滌后的水煎液合并，減壓回收溶劑，得到百蕊草水溶性部位干浸膏(TTW)。AB-8大孔樹脂柱依次用20%、50%乙醇梯度洗脫，減壓回收洗脫液中的乙醇后分別得到百蕊草大極性部位(TT20)和中等極性部位(TT50)的干浸膏。上述百蕊草提取物及各部位干浸膏臨用前用生理鹽水配制成懸浮液。

2.2　分組及造模 [3]

SD大鼠56只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為7組，每組8只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(LGT 10 mg/kg)、TT組(1.0 g/kg)、TTW組(0.4 g/kg)、TT20組(0.4 g/kg)和TT50組(0.4 g/kg)?？瞻讓?duì)照組隔日生理鹽水灌胃，持續(xù)12周，其余各組均采用牛血清蛋白(BSA)、四氯化碳(CCl4)、脂多糖(LPS)聯(lián)合用藥的方法建立實(shí)驗(yàn)性IgAN模型。具體方法為：第1周開始，隔天以生理鹽水配制的BSA灌胃，劑量為400 mg/kg，持續(xù)6周；同時(shí)皮下注射蓖麻油0.5 ml+CCl40.1 ml，每周1次，持續(xù)9周。各造模動(dòng)物分別在第6、8周尾靜脈注射LPS 0.05 mg。

2.3　給藥

從第8周起，各組大鼠每天灌胃給藥1.0 ml，連續(xù)5周?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組給予生理鹽水。

2.4　一般狀態(tài)及尿液測(cè)定

各組每周稱重1次，觀察精神狀態(tài)、體毛、浮腫、飲食狀況以及活動(dòng)情況等。各組每周1次置于代謝籠，收集24 h尿液，記錄尿量。取10 ml尿液，加入防腐劑甲苯，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定尿蛋白濃度，計(jì)算24 h尿蛋白。第5周開始，取0.5 ml尿液離心，取沉渣涂片，隨機(jī)觀察10個(gè)視野，進(jìn)行紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算平均數(shù)。

2.5　血液生化指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，腹主動(dòng)脈取血10 ml，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清總蛋白(TP)、血清清蛋白(ALB)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等各項(xiàng)指標(biāo)。

2.6　腎組織熒光觀察

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取腎臟。采取直接法染色，取部分新鮮組織冰凍切片，丙酮固定，PBS液洗滌后加FITC標(biāo)記的兔抗大鼠IgA抗體，37 ℃孵育40 min，PBS洗滌后甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。以鏡下黃綠色熒光顯示強(qiáng)度為評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：無熒光或極弱記為(-)，有熒光記為(+)，較強(qiáng)熒光記為(++)，極強(qiáng)甚至刺眼熒光記為(+++)。

2.7　腎組織光學(xué)顯微觀察

取余下腎臟組織，用10%甲醛(福爾馬林)液固定，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察。

2.8　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3結(jié)果

3.1　一般狀態(tài)

空白組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中飲食活動(dòng)正常，精神狀態(tài)良好，毛色有光澤。其余各組大鼠均出現(xiàn)體毛干枯、食欲不振、精神萎靡、怠倦少動(dòng)等現(xiàn)象，第6周尾靜脈注射LPS后，上述現(xiàn)象更加明顯。藥物干預(yù)后，除模型組外，其余各組在體毛、精神、攝食等方面均有好轉(zhuǎn)。各組動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開始前5周體重增加較快，第6周開始體重增加緩慢，但各組大鼠平均體重均無顯著性差異。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組均無水腫、爛尾現(xiàn)象，無動(dòng)物死亡。

3.2　24 h尿量

與空白組相比，模型組、TT組和TT20組出現(xiàn)尿量減少。與模型組相比，給藥后，LGT組、TT20組尿量減少，TT組、TT50組和TTW組尿量增加，但無顯著性差異。

3.3　24 h尿蛋白

與空白組相比，各組大鼠在造模第2周開始24 h尿蛋白即開始明顯升高，至第8周顯著升高。藥物干預(yù)后，各給藥組24 h尿蛋白總體為下降趨勢(shì)。與模型組相比，LGT組、TT組和TT50組在給藥1周后尿蛋白下降(P<0.05)，TT組持續(xù)作用2周，TT50組和LGT組持續(xù)作用4周，兩組無顯著性差異；TT20組和TTW組作用不明顯(表1)。結(jié)果表明，百蕊草水提取物及其中等極性部位能降低IgAN大鼠尿蛋白，其效果與雷公藤多苷相當(dāng)。

3.4　尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量

與空白組相比，各組大鼠在第5周開始尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，給藥2周以后，各給藥組大鼠尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量明顯下降(P<0.01)，至第12周，TT組、TTW組、TT20組、TT50組尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量與空白組無顯著性差異(表2)。提示百蕊草水提取物及其各部位能有效改善IgAN大鼠血尿癥狀，其療效優(yōu)于雷公藤多苷。

表1　各組大鼠尿蛋白變化情況

表2　各組大鼠尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量變化情況 ± s， n=8)

3.5　血液生化指標(biāo)

各組血清總蛋白(TP)、血清清蛋白(ALB)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與空白組相比，模型組和LGT組的ALT、AST水平升高(P<0.05)，提示CCl4對(duì)造模的大鼠肝臟產(chǎn)生了影響。各給藥組的ALT、AST水平低于模型組，TT50組的ALT水平、TT組的AST水平降低明顯，表明百蕊草水提取物及其中等極性部位對(duì)造模引起的IgAN大鼠肝損傷有一定的保護(hù)作用。與空白組相比，模型組、LGT組、TT20組、TTW組的Scr、BUN水平升高(P<0.05)，而TT組、TT50組則無顯著性差異；與模型組相比，TT組、TT50組的Scr、BUN水平降低(P<0.05)，提示百蕊草水提取物及其中等極性部位對(duì)IgAN大鼠的腎臟具有保護(hù)作用，雷公藤多苷則作用不明顯(表3)。

表3　大鼠血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

3.6　腎組織免疫熒光檢測(cè)

空白組腎組織鏡下除1只大鼠顯示黃綠色熒光，其他大鼠均不出現(xiàn)熒光，系膜區(qū)無IgA沉積。模型組大鼠腎小球系膜區(qū)均出現(xiàn)線狀中等熒光或團(tuán)塊狀較強(qiáng)熒光，提示系膜區(qū)有IgA沉積。各給藥組鏡下熒光強(qiáng)度減弱，其中TT組和TT50組只有少數(shù)腎小球系膜區(qū)顯示線狀或顆粒狀I(lǐng)gA沉積，較模型組明顯減弱，表明百蕊草水提取物及其中等極性部位能有效改善免疫復(fù)合物在系膜區(qū)的沉積(表4)。

表4　大鼠腎組織免疫熒光檢測(cè)結(jié)果( n=8)

3.7　腎組織光鏡觀察

各組大鼠腎臟肉眼觀察均

無明顯異常。空白組腎小球、腎小管形態(tài)與結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)除個(gè)別有局灶性慢性炎細(xì)胞浸潤外，均未見明顯病理變化。模型組全部大鼠腎小球毛細(xì)血管基底膜不同程度增生，系膜增寬，腎小球囊腔擴(kuò)大，有的可見腎小球內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加，腎小囊變窄；全部大鼠腎近端小管存在不同程度的上皮細(xì)胞水樣變性、胞核腫大呈淡染，有的腎小管萎縮，近曲小管管腔閉塞，上皮細(xì)胞排列不規(guī)則，相互靠攏；所有動(dòng)物的腎間質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)灶性增生。各治療組與模型組比較，腎小球囊腔擴(kuò)大、系膜基質(zhì)增生和腎小管的損傷狀況明顯減輕。LGT組、TT組和TT50組均表現(xiàn)為腎小球基底膜輕度增生，腎小囊輕度擴(kuò)大；近端小管上皮細(xì)胞水樣變性、胞核腫脹。TT20及TTW組顯示腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張，基底膜變厚，腎小囊擴(kuò)大，囊壁變厚；腎小管萎縮，近曲小管管腔閉塞，腎小管周圍出現(xiàn)少量基質(zhì)細(xì)胞增生(圖1)。

圖1　各組大鼠病理組織檢查結(jié)果(HE染色，×200) A.空白組；B.模型組；C.LGT組；D.TT組；E.TTW組；F.TT20組；G.TT50組

4討論

腎組織系膜區(qū)免疫復(fù)合物沉積所致的IgAN是全世界最常見的腎小球疾病。本研究采用改進(jìn)后的大鼠IgAN模型[3]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型動(dòng)物的24 h尿蛋白、尿沉渣中紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清中肌酐、尿素氮水平均顯著升高，符合IgAN動(dòng)物模型[4，5]的特點(diǎn)。在病理變化方面，由于在免疫原(BSA)的刺激下，機(jī)體產(chǎn)生的IgA沉淀物沉積在腎小球毛細(xì)血管基底膜上，使基底膜出現(xiàn)不同程度的增厚，腎組織系膜區(qū)免疫熒光顯著增強(qiáng)?；啄さ脑龊袷沟媚I小球球后毛細(xì)血管的血流量減少，引起腎小管上皮缺血、缺氧，從而發(fā)生腎小管的變性，并誘發(fā)間質(zhì)細(xì)胞的增生，導(dǎo)致腎小管狹窄、萎縮、閉塞。腎小管重吸收能力下降，反過來導(dǎo)致腎小球囊腔內(nèi)壓力增大，球囊擴(kuò)大。上述病理變化均符合IgAN臨床分類的特征[6]，提示本次實(shí)驗(yàn)造模成功。與文獻(xiàn)報(bào)道[3]不同的是，模型動(dòng)物的ALT、AST水平升高，提示造模過程中CCl4對(duì)大鼠肝臟產(chǎn)生了一定程度的損害，而百蕊草對(duì)造模

引起的動(dòng)物肝損傷具有較好的治療作用。

IgAN目前尚無有效的治療方法，臨床一般采用免疫抑制劑、抗血小板聚集、控制誘發(fā)因素等方式治療。中醫(yī)學(xué)把IgAN歸屬于“尿血、腰痛、虛勞”等范疇，其病機(jī)為風(fēng)濕郁熱、痹阻腎絡(luò)之“腎痹癥”，在治療上以清熱祛濕、宣痹通絡(luò)立法。百蕊草具有清熱解毒、消炎利濕的功效，在1 g/kg劑量下對(duì)阿霉素腎病大鼠展現(xiàn)出良好的抗炎、利尿、降低尿蛋白濃度作用[2]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同等劑量下，百蕊草水提取物(TT組)和大孔樹脂50%乙醇洗脫部位(TT50組)不僅能夠有效降低IgAN大鼠的尿蛋白、尿沉渣中紅細(xì)胞數(shù)量、血清肌酐和尿素氮水平，而且可以減少腎組織系膜區(qū)的免疫復(fù)合物沉積，改善腎小球、腎小管的損傷狀況，對(duì)IgAN大鼠具有良好的治療作用，其效果優(yōu)于陽性對(duì)照雷公藤多苷，而其他部位則效果不明顯。上述結(jié)果表明，以大孔樹脂吸附，不同濃度乙醇梯度洗脫作為活性部位分離和富集的方法較為合理，中等極性的大孔樹脂50%乙醇洗脫組分為其有效成分富集部位。

百蕊草的主要化學(xué)成分為以山奈酚為母核的黃酮苷類化合物，其中含量較高的是紫云英苷和百蕊草素I[7，8]。研究發(fā)現(xiàn)百蕊草的乙酸乙酯部位為其抗炎、止痛作用的有效部位，其主要有效成分是山奈酚和紫云英苷[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，山奈酚及其黃酮苷類化合物具有良好的抗腫瘤、抗感染、抗病毒和抗炎作用。山奈酚的抗炎作用可能與其作為誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶抑制劑(iNOS)有關(guān)，能夠抑制上皮細(xì)胞內(nèi)NO的釋放和iNOS的表達(dá)。山奈酚還是一種天然的免疫抑制劑，能非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin，CN)的活性，且不依賴中介蛋白[10]。山奈酚能直接作用于T淋巴細(xì)胞并抑制Thl型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制CD8+淋巴細(xì)胞在體外的形成，因此可用于治療急性移植抗宿主性疾病[11]。實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附后以40%乙醇洗脫部位可獲得含量較高的紫云英苷[12]，由此可推斷本實(shí)驗(yàn)中，百蕊草提取物及TT50中，對(duì)IgAN具有良好療效的活性成分可能是以紫云英苷為代表的黃酮苷類化合物。此類黃酮苷水溶性更好，更易被胃腸道吸收，可能作為前藥，在進(jìn)入體內(nèi)后C-3位葡萄糖水解，代謝為山奈酚而發(fā)揮作用，但其確切的作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

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