人Smad 4基因在膠質瘤細胞中的作用研究

劉寶輝 田道鋒 王軍民 李明昌 董慧敏 張申起 蔡 強 陳謙學

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人Smad 4基因在膠質瘤細胞中的作用研究

劉寶輝 田道鋒 王軍民 李明昌 董慧敏 張申起 蔡 強 陳謙學

【摘要】目的 構建人Smad 4基因質粒體并檢測其在膠質瘤細胞系U251內的表達水平及作用。方法構建PEGFP－Smad4質粒體，應用FUGENE HD轉染質粒體進入U251，G418篩選，挑出單克隆擴增，建立穩(wěn)定細胞株N1－U251和Smad4－U251。將實驗分為空白組（U251細胞）、N1組（空質粒－U251）、Smad4組（Smad4－U251），檢測Smad4基因和蛋白表達水平；使用CCK8法檢測空白組、N1組、Smad4組細胞活性。使用流式細胞術檢測細胞凋亡率，使用免疫印跡技術檢測Caspase 3與p－Histone H3蛋白表達水平。結果PEGFP－Smad4質粒體構建成功，N1－U251，Smad4－U251穩(wěn)定細胞株構建成功，CCK8顯示空白組、N1組、Smad4組細胞活性分別是1±0．03、0．95±0．04、3．22±0．13，Smad4組與N1組比較，差異明顯（P＜0．05），免疫印跡顯示高表達Smad 4組pHistoneH 3表達水平明顯增高；空白組、N1組、Smad 4組在經替莫唑胺化療處理后細胞凋亡率分別為0．36±0．09、0．38±0．11、0．21±0．03，Smad 4組與N1組比較，差異明顯（P＜0．05）；免疫印跡顯示高表達Smad 4組Caspase 3表達水平明顯降低。結論 成功構建人Smad4質粒體并建立高表達Smad4的細胞系，高表達Smad4可以提高U251細胞活性，降低化療敏感性。

【關鍵詞】Smad4 U251細胞 質粒體 細胞活性 化療敏感性

【DOI】 10．3969／j．issn．1007－0478．2015．05．009

轉換生長因子β（transforming growth factorβ，TGF－β）控制細胞的生長、分化、凋亡以及胚胎的發(fā)育，激活細胞膜上的I型和Ⅱ型受體，其中主要是I型受體，I型受體進一步激活Smad家族蛋白，調節(jié)相關基因的表達。在Smad家族中Smad4與腫瘤的關系尤為密切［1］，Smad4又稱DPC4（deleted inpancreatic cancer 4）是通路中調節(jié)轉錄的核心分子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［2～4］，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，Smad4在膠質瘤中表達異常［5］，但迄今為止其在膠質瘤中的作用尚不明確，本實驗通過構建Smad4質粒，并構建穩(wěn)定細胞系，研究Smad4在膠質瘤中的作用，為Smad4在膠質瘤中的作用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 β－actin及羊抗小鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。Smad4單克隆抗體購自英國Abcam公司，DMSO購自武漢天源生物技術公司。胎牛血清購自杭州四季青生物材料公司，Trizol Reagent購自美國英杰生命技術公司，DMEM培養(yǎng)基及胰蛋白酶購自美國Gibico公司，逆轉錄試劑盒購自日本Toyobo公司。FGGENE HD購自Roche公司。G418購自Gibco公司。

1．2 質粒體的構建與鑒定 取對數期生長的U251細胞，提取RNA，逆轉錄并進行PCR。上游引物為：5’－ATCCTCGAGACCATGAAGTTATGGGATGTCG－3’，下游引物為：5’－ATCGTCGACATACATCCACACCTTTTAGC－3’下劃線表示酶切位點，將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用快速凝膠回收試劑盒回收純化PCR凝膠電泳產物，氯化鈣法制備新鮮的的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細菌50μL，取1μL連接反應產物，混勻，電轉儀電轉，過夜培養(yǎng)后，用銅針挑去陽性菌落擴增，質粒小量抽提試劑盒抽提質粒。具體操作按說明書。使用SalI 和XhoI雙酶切鑒定。配成酶切體系后，37℃水浴2h，取20μl行0．8%瓊脂糖電泳，同時，將質粒體送上海博亞生物技術有限公司測序。

1．3 細胞培養(yǎng) 人惡性腦膠質瘤株U251（引自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所）培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，另添加適量Hepes和3%谷氨酰胺。每3d以含EDTA的0．25%胰酶消化，1∶3傳代。

1．4 實驗分組 空白組又稱Ctrl組，僅給予轉染試劑，N1組：轉染PEGFP質粒，Smad4組：轉染PEGFP－Smad4質粒。

1．5 穩(wěn)定細胞株的構建 對數期生長的U251細胞經含EDTA的胰酶（0．25%）消化后計數2×105／孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)基，PBS洗3次，換成等體積OPTI－MEM培養(yǎng)基；將FUGENE HD加入空白OPTI－MEM培養(yǎng)基中，混勻，室溫放置5min，加入質粒體后，混勻，室溫放置10min，加入培養(yǎng)板中，以加空白FUGENE HD的U251細胞作為陰性對照；6h后將細胞培養(yǎng)基換成DMEM完全培養(yǎng)基；24h后加入G418篩選，濃度為預實驗確定的1 000μg／mL，3d換1次液體，15d后將G418濃度調整為500μg／mL，繼續(xù)加壓篩選；20d后細胞形成單克隆，用1mL注射器針頭挑取單克隆，接種于96孔板內，繼續(xù)加壓培養(yǎng)，6d，細胞鋪滿96孔板，將細胞消化后接種于6孔板內繼續(xù)培養(yǎng)。

1．6 熒光定量PCR

U251細胞按照RNA提取試劑盒說明書提取RNA。RT–PCR步驟按照Promega公司試劑盒及其說明書進行。熒光定量PCR在ABI Prism 7500（Applied Biosystems）系統(tǒng)上完成，應用SYBR Green（TOYOBO，Japan）作為雙鏈DNA特異熒光染料。Smad4上游引物5’－AACGGAGACATACAGCACCC－3’，下游引物為5’－GTAAGCGATGGAACACCAATAG－3’；GAPDH（internal control）上游引物5’－GAGTCAACGGATTGGTCGT－3’，下游引物為5’－TTGATTTTGGAGGGATCTCG－3’。

1．7 蛋白印記技術 含蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液（50 mmol／L tris－HCL、pH 7．4，0．5 mmol／L EDTA，0．5%NP40和150mmol／L NaCl）裂解細胞，裂解物12 000r／min離心10min棄沉淀，BCA試劑盒定量蛋白濃度；取蛋白20μg以10%SDSPAGE電泳分離，PVDF轉膜，Smad4、Caspase 3、p－Histone H3蛋白200mA 30min；5%脫脂牛奶室溫封閉1h；Smad 4、Caspase 3、p－Histone H3鼠抗人單克隆抗體（1∶1 000）羊抗鼠二抗（1∶5 000），βactin（1∶2 000）羊抗鼠二抗（1∶3 000）作為對照，一抗孵育4h后TBST洗膜6min×5次，二抗孵育1h 后TBST洗膜6min×5次，濾紙吸干水分，加入及ECL增強試劑盒顯色，根據條帶亮度調整柯達膠片曝光時間，曝光后將膠片分別放入顯影定影液5min。

1．8 細胞活性檢測 采用CCK－8法檢U251的細胞活性。在U251細胞種于96孔板，每個孔中加入10%的CCK－8，避光孵育2h后全自動酶標儀檢測其450nm的吸光度值（A值），分別計算計算細胞抑制率＝（1－處理組平均A值／空白組A值）×100%。實驗重復3次，取其均值。

1．9 細胞凋亡率的測定對數期細胞，5×105／孔接種于6孔板中，12h后加入化療藥物替莫唑胺（16 ug／mL），48h后使用流式細胞術檢測細胞凋亡率，具體實驗步驟按照試劑盒說明進行，實驗重復3次，取其均值。

1．10 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件，數據采用均數±標準差（珚x±s）表示，單向方差分析進行樣本均數間比較。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 PEGFP－Smad4質粒體構建成功

應用Sall和Xhol雙酶切后電泳（圖1），將Smad 4質粒體應用FUGENE HD瞬轉染入U251細胞，Smad 4組Smad 4蛋白表達水平明顯升高（圖2）。

圖1　質粒體PEGFP－Smad 4酶切圖及穩(wěn)定細胞系的建立

2．2 PEGFP－Smad4－U251穩(wěn)定細胞株構建成功

熒光圖片顯示N1（空質粒）組與PEGFP－Smad 4組發(fā)出綠色熒光（圖2），RT－PCR顯示空白組、N1組、Smad 4組的Smad 4基因表達水平為1±0．14、0．95±0．09、3．2±0．41，Smad 4組與空白組比較差異明顯（P＜0．05）（圖2）。Western blot顯示Smd 4組的Smad4蛋白表達水平明顯升高，與空白組比較差異明顯（P＜0．05）（圖2）。

2．3 Smad4可以提高U251細胞活性

CKK8顯示，對照組、N1組、Smad4組分別為1 ±0．03、0．95±0．04、3．22±0．13，Smad 4組與N1組比較，差異明顯（P＜0．05）（圖3），免疫印記顯示高表達Smad 4后反應細胞增殖能力的p－Histone H3表達水平明顯增加（圖3）。

圖2　穩(wěn)定細胞系中Smad4的表達

圖3　穩(wěn)定細胞系細胞活性改變

2．4 Smad4可以降低U251細胞化療敏感性

流式細胞術顯示，空白組、N1組、Smad4組在經過替莫唑胺（TMZ）處理后細胞凋亡率分別為0．36±0．09、0．38±0．11、0．21±0．03，Smad4組與N1組比較，差異明顯（P＜0．05）（圖4），免疫印記顯示高表達Smad 4后反應細胞凋亡的Caspase 3表達水平明顯降低（圖4）。

3 討 論

Smad 4是TGF－β／Smad信號通路下游的重要因子，在調節(jié)細胞的生長和分化方面起關鍵性的作用。有研究表明，當細胞內TGF－β／Smad信號通路異常時腫瘤細胞異常侵襲［6－7］。Smad 4與多種腫瘤相關［7－8］，與前列腺癌及肺癌患者的預后密切相關［2，4］。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)，Smad 4在膠質瘤中也表達異常［5］，提示Smad4可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。

圖4　穩(wěn)定細胞系細胞對化療藥的敏感性

本實驗結果顯示，Smad 4可以增加人腦膠質瘤細胞U251細胞活性，提示Smad 4在膠質瘤中可以調節(jié)細胞增殖，雖然目前尚無Smad 4可以調節(jié)人腦膠質瘤細胞增殖的報道，但之前報道在膠質瘤中發(fā)現(xiàn)Smad 4異常表達，且可以調節(jié)胃癌細胞增殖［9］，因此Smad 4可能是調節(jié)膠質瘤增殖的一個重要基因。

眾所周知，膠質瘤細胞的異常增殖是膠質瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制，調節(jié)膠質瘤細胞增殖，可以提高患者的生存時間，本實驗證實了Smad 4可以調節(jié)膠質瘤細胞增殖，其可能是膠質瘤治療的新靶點，為膠質瘤治療帶來新的思路。

本實驗發(fā)現(xiàn)，Smad 4可以降低TMZ化療引起的U251細胞的凋亡，說明Smad 4可能與替莫唑胺化療敏感性有關，雖然目前尚無Smad 4與TMZ化療敏感性的相關的報道，但已有文獻報道，Smad 4可以提高結腸直腸癌對洛莫司汀的化療敏感性［10］。說明Smd 4可能是一個與化療相關的蛋白。

Smad 4調節(jié)膠質瘤對替莫唑胺敏感性的機制尚不清楚。但最近研究發(fā)現(xiàn)，敲低Smad 4可以提高調節(jié)腫瘤細胞的凋亡［9，11］。眾所周知，凋亡對于化療敏感性非常關鍵［12］，Smad 4是一個與替TMZ化療敏感性有關的蛋白。但目前膠質瘤化療敏感性的機制尚不清楚，對化療敏感性機制的研究可以為解決這一難題提供線索。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Smad 4可以提高膠質瘤細胞的增殖，可以降低膠質瘤細胞對TMZ的化療敏感性，Smad4可能是一個與膠質瘤細胞增殖與化療敏感性相關的蛋白。

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（2015－02－16收稿）

作者單位：430060 武漢大學人民醫(yī)院神經外科［劉寶輝 田道鋒 王軍民 李明昌 董慧敏 張申起 蔡 強 陳謙學（通信作者）］

Construction of plasmid of Smad4 and its expression and function in glioma cellsLiu Baohui，Tian Daofeng，Wang Junmin，et al．Department of Neurosurgery，Renmin Hospital of Wuhan University，Wuhan 430060

【Abstract】Objective To construct the plasmid of Smad4and observe its expression and effect in U251 cells．Methods Plasmid of Smad4was constructed and transfected to U251cells by FUGENE HD．G418was used to kill the cells that transfected unsucessfully．Western blot and real time PCR（RT－PCR）were used to observe the expression of Smad4．Three groups were set，control group，N1group and Smad4group．CCK8assay was used to detect the proliferation of N1group and Smad4group and the proliferation of cells when TMZ was given．Results The plasmid PEGFP－Smad4and Smad4－U251cells were constructed．CCK8result showed that the relative proliferation of cells in Ctrl group，N1group and Smad4group was：1±0．03，0．95± 0．04，3．22±0．13respectively，and there was significant difference between Smad4group and N1group．The expression of pHistone H3was increased when Smad4was over expressed．Flow Cytometry result showed that the apoptosis of cells in Ctrl group，N1group and Smad4group was 0．36±0．09，0．38±0．11，0．21±0．03 respectively，when the cells was treated by TMZ，and the Casepase 3protein expression level decreased when Smad4was increased．Conclusions The plasmid PEGFP－Smad4is constructed successfully and the overexpression system is also established．Smad4can improve the proliferation of U251cells and decrease the chemosentivity

【Key words】Smad4 U251 Plasmid Proliferation Chemosentivity

基金項目：武漢大學人民醫(yī)院國家自然科學基金孵育項目（2013RMFH014）；國家自然科學基金項目（81372683）；武漢大學新教師基金項目（274222）

【文章編號】1007－0478（2015）05－0288－04

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】R739．4