補骨脂素和女貞子對小鼠B16黑素瘤細胞c-KIT表達的影響

霍 晶，宋新峰

白癜風是一種由于黑素細胞選擇性破壞引起的特征性色素脫失斑，治療棘手，患者遍布世界各地，約占世界人口的1%～2%。我國中藥治療白癜風歷史悠久，但中藥治療白癜風的作用機制不清。以往研究大多集中在中藥對黑素細胞增生和對黑素細胞酪氨酸酶的激活，促進黑素合成等方面[1,2]。但是白癜風病變部位的復色是黑素細胞激活-移行-增生-合成黑素的一系列過程，而移行能力的改變在白癜風發(fā)病和復色過程中尤為重要。本實驗研究了中藥補骨脂素和女貞子對黑素細胞c-KIT 表達的影響及意義，探討中藥補骨脂素和女貞子治療白癜風的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

小鼠B16 黑素瘤細胞株（中國科學院上海細胞研究所），RPMI1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司），10%胎牛血清（中國醫(yī)學科學院血液學研究所）；兔抗c-KIT 抗體、β-肌動蛋白抗體、二抗山羊抗兔抗體（Santa Cruz 公司）；女貞子（北京同仁堂藥店），補骨酯素單體（monomer）（成都瑞芬思生物科技有限公司）；Access RT-PCR system 試劑盒（美國Promega 公司），SDS-PAGE 膠（Invitrogen 公司），Bio-Rad 蛋白分析試劑盒，蛋白標準分子量（Bio-Rad 公司），96 孔培養(yǎng)板和Transwell 小室（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 中藥提取和B16黑素瘤細胞培養(yǎng) ①中藥制備：女貞子4 g，經(jīng)70%乙醇60 ml 浸泡1周，加熱回流提取3次，提取液過濾并濃縮濃度為 500 g/L，一次性濾器過濾除菌，4℃貯存?zhèn)溆谩Ｖ兴巻误w補骨脂素以二甲基亞砜溶解至50 mmo1/L貯存液，–20 ℃凍存。藥物用時以RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。②黑素瘤細胞培養(yǎng)：小鼠B16黑素瘤細胞， RPMI1640培養(yǎng)基＋10%胎牛血清，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天換液1次。取對數(shù)生長期細胞，以1×105/ml接種于6孔板，細胞達50%融合時處理組加入中藥。女貞子用無血清 RPMI1640培養(yǎng)基稀釋，設(shè)定最終濃度梯度為 0.01、0.1、1.0 g/L；補骨脂素貯液用RPMI1640培養(yǎng)基稀釋至終濃度梯度為1.0×10-7mmol/L，1.0×10-6mmol/L和 1.0×10-5mmol/L。以不加藥物單純加培養(yǎng)基組作為空白對照組。

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定c-KIT mRNA 表達 將B16 黑素瘤細胞以105個/ml 接種于培養(yǎng)板，24 h 后分別用含1.0×10-5mmol/L 的補骨脂素和1 g/L 女貞子的新鮮培養(yǎng)基換液1 次，72 h 后消化細胞（操作過程避光進行），按照Trizol 試劑盒提供的說明書提取細胞總RNA。然后采用一步法RT-PCR 試劑盒進行RT-PCR。引物（上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成），c-KITm-F：5'-GGA AAG AAG ACA ACG ACA CG 3' ；c-KITm-R ：5'-ACA GAC ACA ACA GGC ACA GC3'； 肌 動蛋 白m-F：5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3'；肌動蛋白m-R：5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'。

整個過程在DNA 擴增儀中自動完成。RT-PCR產(chǎn)物加入含溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠中電泳，電泳完畢后在凝膠掃描儀上觀察結(jié)果，拍照記錄并用Quantity One-4.3.0 軟件（Bio-Rad）對擴增產(chǎn)物進行光密度分析。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）測定c-KIT 蛋白表達 用1.0×10-5mmol/L 的補骨脂素和1 g/L 女貞子處理黑素瘤細胞，培養(yǎng)3 d 后冰上收集、裂解細胞（操作過程避光進行）。根據(jù)上清液中總蛋白的濃度，加蛋白上樣緩沖液，使樣品中總蛋白的濃度為20 μg/μl，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn) PVDF 膜，用5%牛奶封閉。加入（1∶1 000）兔抗c-KIT 抗體，（1∶10 000）兔抗肌動蛋白等抗體，4 ℃孵育過夜，繼而與1∶4 000的二抗羊抗兔抗體等室溫反應1 h，常規(guī)洗膜?；瘜W發(fā)光法顯色、顯影、定影，讀取結(jié)果。用Quantity One-4.3.0 軟件讀取蛋白條帶的灰度值。

1.2.4 B16 黑素瘤細胞遷移功能測定 Transwell 小室用8.0 μm 微孔聚碳酸酯膜分成上下2 室，實驗前1 d 取出上層小室，將小室底面的聚碳酸酯膜用FN包被，超凈臺室溫過夜晾干。將黑素瘤細胞接種于上層小室，嵌入Transwell 小室中，下層小室加入不同濃度藥物處理，培養(yǎng)20 h 后取出聚碳酸酯膜（操作過程避光進行）。甲醇固定，甲苯胺藍染色，膜上層的黑素瘤細胞用棉拭擦去，遷移至膜下層細胞在高倍鏡下隨機選取4 個視野計數(shù)，試驗重復3 次。

1.3 統(tǒng)計學方法

計量數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標準差表示， 應用SPSS15.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。兩樣本均數(shù)的比較采用成組t 檢驗（two-sample group t-test）。多樣本均數(shù)的組間差異采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多樣本均數(shù)的兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 補骨脂素和女貞子對B16黑素瘤細胞c-KIT的mRNA表達影響

1.0×10-5mmol/L 補骨脂素處理組和1.0 g/L 女貞子處理組黑素瘤細胞的c-KIT mRNA 表達結(jié)果分別為（1.704±0.001）（IOD/Area）、（1.598±0.001）（IOD/Area），比對照組（0.812±0.001）（IOD/Area）增加了85.36%和67.52%，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.36，P ＜0.05；t=2.78，P ＜0.05)。這表明補骨脂素和女貞子能促進小鼠B16 黑素瘤細胞c-KIT 的mRNA 表達（圖1）。

圖1 RT-PCR測定補骨脂素和女貞子對黑素細胞c-KIT mRNA表達電泳圖

2.2 補骨脂素和女貞子對B16黑素瘤細胞c-KIT蛋白表達的影響

1.0×10-5mmol/L 補骨脂素處理組和1.0 g/L 女貞子處理組黑素瘤細胞c-KIT 的蛋白表達分別比對照組增加了119.78%和45.67%，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.72，P ＜0.05；t=2.36，P ＜0.05)。這表明補骨脂素和女貞子能促進小鼠B16 黑素瘤細胞c-KIT蛋白的表達（圖2）。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法測定補骨脂素和女貞子對黑素瘤細胞c-KIT蛋白表達的電泳圖

2.3 補骨脂素和女貞子對B16黑素瘤細胞遷移功能的影響

補骨脂素1.0×10-7mmol/L 組，1.0×10-6mmol/L 組和 1.0×10-5mmol/L 組處理20 h 后，遷移到Transwell小室膜下層的B16 黑素瘤細胞個數(shù)每視野分別為（45.3±25.0）個，（48.9±26.0）個，（57.7±31.0）個，對照組為（17.3±7.0）個。對組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，結(jié)果顯示，組間差異顯著（F=10.562，P ＜0.05），與對照組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.16，P ＜0.05；t=4.38，P ＜0.05；t=4.87，P＜0.05），且與濃度增加呈劑量依賴性。

女貞子0.01 g /L 組，0.1 g /L 組和1.0 g /L 組處理20 h 后，遷移到Transwell 小室膜下層的黑素瘤細胞個數(shù)每視野分別為（46.6±24.0）個，（50.7±23.0）個，（56.7±36.0）個，未用藥組為（17.3±7.0）個。對組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，結(jié)果顯示，組間差異顯著（F=12.004，P ＜0.05），與對照組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=4.22，P ＜0.05； t=4.56，P<0.05；t=4.79，P ＜0.05），且與濃度增加呈劑量依賴性。

3 討論

白癜風是一種常見的色素性皮膚病，其對美容所造成的損害嚴重影響了患者的生活質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)[3]，窄譜中波紫外線（NB-UVB）對深膚色人種（主要是印度人）白癜風是有效而安全的。但是，某些白癜風患者單單依靠NB-UVB 治療是無效的，此種情況下，內(nèi)服或外用補骨脂素長波紫外線（PUVA）照射能使白癜風色素減退皮損復色，是較為理想的替代療法[4]。目前應用傳統(tǒng)中藥治療白癜風取得了明顯的療效，臨床上能觀察到白斑區(qū)復色、毛囊周圍出現(xiàn)色素島，提示與黑素細胞的遷移以及黑素合成有很大關(guān)聯(lián)[5]。

補骨脂素治療白癜風的作用機制還不清楚。有研究表明補骨脂素可以刺激酪氨酸酶mRNA 轉(zhuǎn)錄起始的一種關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子-Mitf 的表達[6]，并表明補骨脂素誘導黑素生成作用與蛋白激酶A(PKA)信號傳導途徑參與調(diào)節(jié)有關(guān)[7]。有研究發(fā)現(xiàn)中藥女貞子能激活酪氨酸酶，促進黑素合成[8]；進一步研究還發(fā)現(xiàn)女貞子能促進小鼠毛囊的生長。白癜風復色一方面是促使黑素細胞的活性增強，黑素合成能力增強；另一方面是促進黑素細胞的遷移功能。因此綜合研究中藥補骨脂素和女貞子對黑素細胞遷移的影響，對深入探討中藥治療白癜風的機制具有重要意義。

c-KIT 是一具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，對黑素細胞遷移和生長存活有重要作用。Noriss 等[9]發(fā)現(xiàn)正常人也有一定水平的c-KIT 基因表達，并指出可能與保持正常黑素細胞的分裂潛能有關(guān)，c-KIT表達減少很可能會導致黑素細胞生長存活缺陷，成為白癜風皮損中黑素細胞丟失的一個主要原因。研究發(fā)現(xiàn)，c-KIT 還能通過對酪氨酸酶蛋白磷酸化修飾，激活酪氨酸酶，促使黑素生成增加[10]。目前認為白癜風色素恢復的主要機制是毛囊外毛根鞘無黑素細胞激活合成黑素，并向表皮遷移所致。因此，c-KIT 在黑素細胞遷移，從而在白癜風復色中發(fā)揮重要作用。

本實驗結(jié)果顯示，不同濃度補骨脂素對B16 黑素瘤細胞遷移均有顯著促進作用，且與濃度增加呈劑量依賴性關(guān)系。補骨脂素10-5mmol/L 劑量組促進B16 黑素瘤細胞的c-KIT 蛋白表達增加119.78%。這提示臨床上補骨脂素治療白癜風的有效機制可能與促進c-KIT 表達，從而促進黑素細胞遷移有關(guān)。本研究還證實，女貞子處理后B16 黑素瘤細胞的遷移能力顯著增強，c-KIT 蛋白表達明顯增加，增幅達到45.67%，提示女貞子治療白癜風的有效機制可能與促進c-KIT 表達，從而促進黑素細胞遷移有關(guān)。

本研究闡明了補骨脂素和女貞子對B16 黑素瘤細胞遷移的具體分子作用機制，表明了補骨脂素和女貞子治療白癜風有效性的作用機制；這為臨床篩選中藥治療白癜風等色素性皮膚病的機制研究提供了新思路，為更加科學、合理、全面、有效地篩選針對色素性皮膚病的中藥奠定了基礎(chǔ)。

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