谷子遺傳轉(zhuǎn)化體系研究進(jìn)展

李臻+劉煒+管延安+王慶國(guó)+潘教文

摘要：谷子（Setariaitalica）是原產(chǎn)于我國(guó)的特色雜糧作物，具有抗旱、耐瘠、耐鹽堿、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，但其生物技術(shù)研究相對(duì)滯后。本文綜述了近年來(lái)谷子組織培養(yǎng)、再生體系、遺傳轉(zhuǎn)化方法的研究進(jìn)展，著重介紹了利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化及再生體系，并對(duì)可能影響轉(zhuǎn)化過(guò)程及效果的相關(guān)因素進(jìn)行了闡述。

關(guān)鍵詞：谷子；組織培養(yǎng)；農(nóng)桿菌介導(dǎo)；再生；遺傳轉(zhuǎn)化體系

中圖分類(lèi)號(hào)：S515.03.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2015）04-0134-05

谷子（Setariaitalica）被譽(yù)為“五谷之首”，在我國(guó)有8000年的栽培歷史，是我國(guó)傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)保健食品。據(jù)《本草綱目》記載，谷子具有“祛熱、除煩、消食宿”的功效[1]，小米粥在民間更有“代參湯”的美譽(yù)。谷子營(yíng)養(yǎng)價(jià)值在谷類(lèi)作物中最高，且相對(duì)均衡，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及多種微量元素，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值指標(biāo)均高于FAO/WHO聯(lián)合推薦的必須氨基酸模式，是一種不可多得的天然保健食材[2，3]。

谷子具有耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿的生理特性，在貧瘠土壤和干旱地區(qū)生長(zhǎng)良好、適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量穩(wěn)定[4]。而且，谷子是二倍體自花授粉作物，其基因組較?。s470Mb），生長(zhǎng)周期短（50～80d），植株較小[5]，具備作為模式作物的特點(diǎn)。但是，谷子作為一種區(qū)域性小雜糧作物，主要在亞洲種植，且以我國(guó)為主產(chǎn)國(guó)，一直以來(lái)存在產(chǎn)量較低，經(jīng)濟(jì)效益相對(duì)較差的問(wèn)題，因此圍繞谷子開(kāi)展的相關(guān)研究，與玉米、水稻等主要農(nóng)作物相比起步晚，分子生物學(xué)研究相對(duì)滯后。2012年，我國(guó)科學(xué)家率先完成了谷子基因組測(cè)序工作，為通過(guò)基因工程手段進(jìn)行谷子種質(zhì)資源改良、提高產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。目前，建立一套高效的谷子遺傳轉(zhuǎn)化和再生體系已成為谷子研究的重中之重。結(jié)合以往研究基礎(chǔ)，本文對(duì)近年來(lái)谷子組織培養(yǎng)再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化方法的進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)，并探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)谷子轉(zhuǎn)化中的主要影響因素，為通過(guò)分子育種進(jìn)行谷子品種改良提供一定的依據(jù)和借鑒。

收稿日期：2015-01-28

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2014CQ024）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2014QNM37）

1谷子組織培養(yǎng)及再生

20世紀(jì)70年代，日本學(xué)者B3en等[6]最早開(kāi)始谷子的組培研究，他們將處于四分體到單核小孢子期的谷子花藥置于含有2，4-D和KT的Blaydes培養(yǎng)基上，成功誘導(dǎo)出4塊胚性愈傷組織并獲得了再生植株。Rangan[7]將萌發(fā)5天種子的中胚軸區(qū)切下誘導(dǎo)出結(jié)構(gòu)緊致的愈傷組織，并可再生植株。在我國(guó)，許智宏[等]最早用谷子與狗尾草的幼穗作為外植體進(jìn)行愈傷的誘導(dǎo)，結(jié)果顯示，對(duì)長(zhǎng)度在2cm左右的幼穗進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)效果最好，同時(shí)也適宜通過(guò)不定芽途徑形成再生植株。Rao等[9]以不同谷子品種的成熟胚為外植體，證明谷子不同品種間再生能力存在差異、之后許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者以谷子葉片、莖尖、成熟種子、幼胚等多種材料為外植體進(jìn)行研究，均獲得了再生植株。本課題組在總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以谷子成熟胚為外植體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的探索，主要選用的為目前已經(jīng)測(cè)序的谷子品種“豫谷1號(hào)”，也取得了一定的進(jìn)展。

大量研究表明，谷子的組織培養(yǎng)與品種、外植體類(lèi)型、培養(yǎng)基的組成（添加物）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子等因素密切相關(guān)[10～19]。袁進(jìn)成等[20]選用“冀谷11”等4個(gè)谷子品種，研究不同條件下谷子成熟胚的再生能力及其影響因素，結(jié)果表明谷子的再生能力受基因型影響較大，“冀谷11”的再生能力最好；LS培養(yǎng)基適合谷子的愈傷組織誘導(dǎo)；MSB5培養(yǎng)基適合谷子的分化；在碳源的選擇上麥芽糖比蔗糖更易誘導(dǎo)形成優(yōu)質(zhì)的愈傷組織，添加山梨醇可以提高愈傷的分化效率；在激素配組上，2，4-D和ZT組合誘導(dǎo)愈傷較好，而NAA和6-BA的組合愈傷分化率較高[20]。根和側(cè)芽的頂端分生組織誘導(dǎo)愈傷效率都非常低[21，22]，不適合作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)的研究。王節(jié)之等[23]進(jìn)一步研究了常用激素在谷子組織培養(yǎng)中的應(yīng)用效果，認(rèn)為2，4-D和KT配合使用能夠有效誘導(dǎo)愈傷組織；6-BA對(duì)谷子分化成苗起主導(dǎo)作用；IAA與NAA對(duì)谷子幼苗生根無(wú)明顯作用。目前，谷子的組織培養(yǎng)多選取不同品種穗分化期的幼穗、成熟胚為外植體材料，結(jié)合銨含量較低的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)分化，但要形成高效的再生體系仍需進(jìn)一步優(yōu)化。

2谷子遺傳轉(zhuǎn)化方法

谷子遺傳轉(zhuǎn)化方法包括基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEC介導(dǎo)法、超聲波介導(dǎo)法、花粉管通道法、子房注射法等。目前，應(yīng)用較多且較為成熟的方法是基因槍轉(zhuǎn)化法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[5]。

2.1基因槍轉(zhuǎn)化法

基因槍法的主要優(yōu)點(diǎn)是沒(méi)有明顯宿主限制，可將外源基因直接轉(zhuǎn)入可再生細(xì)胞中，可轉(zhuǎn)化多種組織和器官。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)化率較低，導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)較多。

Taylor等[24]最早利用基因槍法進(jìn)行谷子遺傳轉(zhuǎn)化，并在愈傷組織中檢測(cè)到GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)。O'Kennedy等[25]將將磷酸甘露醇異構(gòu)酶基因manA轉(zhuǎn)化到珍珠粟中，并對(duì)轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化。刁現(xiàn)民等[26]以谷子幼穗作為外植體，將pAHC25和pB1121質(zhì)粒利用基因槍法分別轉(zhuǎn)化到谷子愈傷中，通過(guò)檢測(cè)質(zhì)粒中GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)情況，分析了影響谷子愈傷組織轉(zhuǎn)化的因素，建立了JQ-700基因槍轉(zhuǎn)化的最佳方法：即鎢粉3μg/mg、CaCl21.5mol/L、亞精胺40mmol/L，基因槍轉(zhuǎn)化室高度7cm，轟擊速度400～450m/s，轉(zhuǎn)化愈傷組織用量為1～2g。在此條件下，刁現(xiàn)民等[27]以豫谷1號(hào)為材料，獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)抗除草劑基因Bar的轉(zhuǎn)基因植株。

研究表明，基因槍法轉(zhuǎn)化效率主要受啟動(dòng)子類(lèi)型和選擇標(biāo)記的影響。Taylor等[10]通過(guò)研究谷子懸浮培養(yǎng)細(xì)胞和未成熟胚中CaMV35S啟動(dòng)子和玉米Ubiquitin啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)GUS基因的效率，比較了這兩種啟動(dòng)子在谷子中表達(dá)活性的差異，結(jié)果顯示，玉米Ubi啟動(dòng)子的活性在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中比35S啟動(dòng)子高5倍多，在未成熟胚中高2倍多，表明玉米Ubi啟動(dòng)子相對(duì)于35S啟動(dòng)子更適合谷子的遺傳轉(zhuǎn)化。這與刁現(xiàn)民等[28]的研究結(jié)果相同。新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NeomycinPhosphotransferseⅡ，NPTⅡ）基因是轉(zhuǎn)化中常用的選擇標(biāo)記基因，該基因的編碼產(chǎn)物可以使卡那霉素失活，因此在培養(yǎng)基中添加卡那霉素可以用于篩選陽(yáng)性再生植株，但是長(zhǎng)期在卡那霉素的壓力下會(huì)導(dǎo)致愈傷組織胚狀體分化效率降低甚至使后代不育。董云洲等[29，30]用基因槍法轉(zhuǎn)化谷子花粉和未成熟幼穗，在進(jìn)行卡那霉素篩選過(guò)程中發(fā)現(xiàn)植株分化受到嚴(yán)重影響。潮霉素B和除草劑Basta是水稻遺傳轉(zhuǎn)化中常用的篩選劑，Lambé等[31]的研究顯示，利用潮酶素B篩選轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)愈傷分化的影響較小，可獲得可育植株。Girgi等[13]利用基因槍法將含有Bar基因和GUS基因的載體轉(zhuǎn)化到4個(gè)谷子品系（842B、7042、MangaNara、BongoNara）中，成功篩選到轉(zhuǎn)基因株系5株。endprint