亮氨酸或組氨酸通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路影響奶牛乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白的合成

高海娜1 胡 菡 王加啟1 鄭 楠*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070;3.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，北京 100193;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

乳蛋白是乳中重要的營(yíng)養(yǎng)組成成分，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是衡量乳品質(zhì)高低的重要指標(biāo)之一［1］。作為可以把吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為乳成分的“生物工廠”—乳腺上皮細(xì)胞，是唯一具有分泌功能的細(xì)胞，其數(shù)量和功能很大程度上決定著乳產(chǎn)量和乳蛋白的合成量［2］。奶牛乳腺上皮細(xì)胞主要合成2大類乳蛋白——酪蛋白(80%)和乳清蛋白［3］。

已有的研究表明，探究反芻動(dòng)物乳腺對(duì)氨基酸的吸收代謝模式以及關(guān)鍵基因的調(diào)控作用，為提高乳腺乳蛋白的產(chǎn)量，改善乳品質(zhì)提供有效途徑［4－6］。作為奶牛營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的氨基酸，不僅可作為蛋白質(zhì)合成的底物，而且通過刺激哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信號(hào)通路中mTOR復(fù)合物1影響其下游因子的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)乳蛋白的合成［7－10］。mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、降解和細(xì)胞能量代謝等重要的生理功能，在細(xì)胞增殖和分化等過程中起著中心調(diào)控點(diǎn)的作用［11－13］。其中，這種調(diào)節(jié)作用對(duì)支鏈氨基酸最為顯著［14－15］。

Mabjeesh等［16］發(fā)現(xiàn)，在奶山羊泌乳早期和晚期，進(jìn)入乳腺的游離亮氨酸的量大于其合成乳蛋白的量，由此可以推斷亮氨酸在乳腺內(nèi)除了合成蛋白質(zhì)之外，還參與了其他的生理過程。Kimball等［17］發(fā)現(xiàn)，亮氨酸對(duì)肌蛋白合成是通過mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)的mRNA翻譯起始而實(shí)現(xiàn)的。最近還有研究表明，在乳腺上皮細(xì)胞中添加適量的亮氨酸能夠促進(jìn)乳蛋白的合成［18－19］。但同時(shí)也有研究結(jié)果指出，組氨酸的添加抑制了mTOR和核糖體S6蛋白激酶(ribosomal protein S6 kinase，S6K1)的磷酸化，使乳蛋白合成減少至65%［19］。因此，推測(cè)亮氨酸或組氨酸通過對(duì)mTOR信號(hào)通路的不同調(diào)控作用，最終影響乳蛋白的合成。目前的工作還缺乏對(duì)mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵基因表達(dá)研究。

本研究以體外培養(yǎng)的永生化奶牛乳腺上皮細(xì)胞(CMECs-H)為模型，利用噻唑藍(lán)(MTT)比色法探討不同濃度梯度的亮氨酸或組氨酸添加水平以及培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CMECs-H增殖的影響;同時(shí)檢測(cè)酪蛋白和mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)。為進(jìn)一步探索亮氨酸或組氨酸通過mTOR信號(hào)通路影響酪蛋白合成機(jī)制的重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器

冷凍離心機(jī)(索福Legend，德國(guó))、恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))、倒置顯微鏡(Olympus，日本)、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Bio-Rad TC10，美國(guó))、RNA 濃度測(cè)定儀(Thermo，美國(guó))、凝膠成像系統(tǒng)(Thermo，美國(guó))、IQ5熒光定量PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))、酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))等。

1.1.2 主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco，貨號(hào):11995-065/11765-054)、厄爾平衡溶液(EBSS，北京雷根生物技術(shù)有限公司，貨號(hào):CC0043)、胎牛血清(FBS，Gibco，貨號(hào):10099-141)、青鏈霉素(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào):C0222)、胰酶(碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào):C0203)、L－亮氨酸(Sigma，貨號(hào):L8912-100G)、L －組氨酸(Sigma，貨號(hào):H-5659-25G)、RNA提取試劑盒(TIANGEN，貨號(hào):74106)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，貨號(hào):DRR037A)、熒光定量試劑盒(TaKaRa，貨號(hào):DRR820A)、噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，貨號(hào):0793-5G)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，貨號(hào):D4540)等。

CMECs-H:以實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞體系為基礎(chǔ)，采用攜帶SV40大T抗原基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)過傳代培養(yǎng)，獲得的一株細(xì)胞系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 奶牛乳腺上皮永生系細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)室前期已建立奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系［20］。將 CMECs-H 置于含有 10%FBS的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在38℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿(Corning，430165)的90%時(shí)，用胰酶溶液于38℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中消化，待細(xì)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大縮成圓形時(shí)，用培養(yǎng)基終止消化反應(yīng);反復(fù)吹打后，收集細(xì)胞懸液于離心管，900 r/min室溫離心5 min;棄上清液，加入新鮮的含有 10%FBS的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸浮液。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖試驗(yàn)處理

將細(xì)胞密度調(diào)整到大約1×105個(gè)/mL接種到96孔培養(yǎng)板(Corning，3599)，每孔 100 μL，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基貼壁處理24 h，用不含F(xiàn)BS的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)饑餓培養(yǎng)過夜，細(xì)胞處理時(shí)用EBSS(表1)代替正常培養(yǎng)基。陰性對(duì)照組是 EBSS，陽(yáng)性對(duì)照組是EBSS+10%FBS，試驗(yàn)組是在陰性對(duì)照組的基礎(chǔ)上分別補(bǔ)充 0.15、0.45、0.90、1.35、2.70、5.40、10.80、21.60、32.40 mmol/L 9 個(gè)濃度的亮氨酸和0.15、0.60、1.20、1.60、2.40、4.80、9.60、14.40、28.80 mmol/L 9個(gè)濃度的組氨酸，分別培養(yǎng)12和24 h后進(jìn)行MTT比色法檢測(cè)。最后用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD450)來(lái)判定細(xì)胞增殖狀況。細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative growth rate，RGE)計(jì)算公式:RGR=試驗(yàn)組OD450/對(duì)照組OD450。每種處理設(shè)6個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 厄爾平衡溶液組成Table 1 Composition of the Earle’s balanced salt solution medium

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)

1.2.3.1 試驗(yàn)處理

將CMECs-H接種到含有10%FBS的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(Thermo 172958)中貼壁處理 24 h，用不含 FBS的DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)過夜，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行6 h的以下處理:陰性對(duì)照組(EBSS)，陽(yáng)性對(duì)照組(EBSS+10%FBS)，試驗(yàn)組分別是在陰性對(duì)照組基礎(chǔ)上添加0.45、1.35、5.40、10.80 mmol/L 4 個(gè)濃度的亮氨酸和 0.15、1.20、4.80、9.60 mmol/L 4個(gè)濃度的組氨酸。每種處理3個(gè)重復(fù)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3.2 樣品 RNA 提取

處理結(jié)束后提取 CMECs-H總 RNA，采用NanoDrop1000檢測(cè)RNA純度及260和280 nm波長(zhǎng)下的吸光度值的比值(OD260/OD280，OD260/280)，樣品濃度保持在200 ng/μL左右，OD260/280測(cè)定值在1.8～2.0，可用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.2.3.3 反轉(zhuǎn)錄

采用500 ng RNA/10μL體系，參照TaKaRa的Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。取2μL 5×Prime Script Buffer 2(for Real Time)，0.5 μL Prime Script RT Enzyme Mix Ⅰ，0.5 μL Oligo dT Primer，配制成混合液并混勻后置于冰上，加入2μg模板RNA，再加入RNase-free水補(bǔ)足到10μL，最后將反應(yīng)體系置于PCR儀上，37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃保存。這樣就得到了cDNA第一鏈，樣品長(zhǎng)期保存可放－20℃。

1.2.3.4 qRT-PCR 反應(yīng)

以 cDNA為模板，參照 TaKaRa的 SYBR Green說(shuō)明書進(jìn)行qRT-PCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)，選用核糖體(RPS9)基因?yàn)閮?nèi)參。試驗(yàn)中所用的13個(gè)基因的引物均由上海生工基因有限公司合成(引物見表2)，其定量反應(yīng)體系為20μL:10μL SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(2 ×)，0.8 μL PCR primer primer，0.8 μL PCR reverse primer，2μL cDNA，6.4μL RNase-free水。反應(yīng)程序?yàn)榈?階段95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán);第2階段退火延伸95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)?5℃ 30 s，41個(gè)循環(huán)。合成的 cDNA貯存于－20℃冰箱中，備用。利用IQ5實(shí)時(shí)定量序列檢測(cè)軟件(Bio-Rad versa Doc，美國(guó))自動(dòng)讀取循環(huán)閾 值(Ct值)。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)分析熒光定量數(shù)據(jù)

采用2－ΔΔCt法分析奶牛乳腺上皮細(xì)胞中目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，所有結(jié)果用SAS 9.2軟件ANOVA程序進(jìn)行方差分析，平均值多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行，P＜0.05時(shí)表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。qRT-PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)參見Livak等［26］的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 亮氨酸或組氨酸對(duì)永生化乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

由表3和圖1所示，除了亮氨酸濃度為0.15 mmol/L時(shí)，在其他添加濃度的條件下，同一濃度不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)CMECs-H的增殖影響差異不顯著(P＞0.05);而同一時(shí)間不同濃度對(duì)CMECs-H的增殖有不同程度的影響。其中，當(dāng)在EBSS中添加0.15～5.40 mmol/L的亮氨酸，培養(yǎng)12 h時(shí)，對(duì)CMECs-H增殖有顯著促進(jìn)作用(P＜0.01);而隨著亮氨酸的濃度增大(10.80～32.40 mmol/L)抑制體外培養(yǎng)的 CMECs-H的增殖。

由表4和圖2所示，當(dāng)添加同一濃度不同培養(yǎng)時(shí)間的組氨酸對(duì)CMECs-H增殖影響差異不顯著(P＞0.05);而同一時(shí)間不同濃度對(duì)CMECs-H的增殖有不同程度的影響。其中，當(dāng)在EBSS溶液中添加0.15～4.80 mmol/L的組氨酸，培養(yǎng) 12和24 h，對(duì)CMECs-H有顯著增殖作用(P＜0.05);而隨著組氨酸濃度增大(14.40～28.80 mmol/L)抑制CMECs-H的增殖。培養(yǎng)時(shí)間的作用效果如圖2所示，在最適濃度范圍內(nèi)12 h的增殖作用略微弱于24 h。

表3 亮氨酸對(duì)CMECs-H的相對(duì)生長(zhǎng)率Table 3 Effects of Leu on CMECs-H relative growth rate(n=3)

圖1 亮氨酸對(duì)CMECs-H相對(duì)生長(zhǎng)率的影響Fig.1 Effect of Leu on CMECs-H relative growth rate

2.2 亮氨酸或組氨酸對(duì)CMECs-H中酪蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表5可見，以體外培養(yǎng)的CMECs-H為模型，在EBSS溶液中添加0.45～10.80 mmol/L范圍的的亮氨酸，與陰性對(duì)照組相比，αs1－酪蛋白(αs1-casein，CSN1S1)、αs2－ 酪蛋白(αs2-casein，CSN1S2)和 κ－酪蛋白(κ-casein，CSN3)基因表達(dá)均顯著上調(diào)(P ＜0.05);β －酪蛋白(β-casein，CSN2)基因表達(dá)上調(diào)(P=0.054)。這說(shuō)明亮氨酸能促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞中酪蛋白基因的表達(dá)。但是不同濃度水平的亮氨酸對(duì)相同酪蛋白的基因促進(jìn)效果不同。在試驗(yàn)組中，當(dāng)亮氨酸的添加濃度為5.40 mmol/L時(shí)，CSN1S1和CSN1S2基因表達(dá)量最高;而當(dāng)亮氨酸的添加濃度為1.35 mmol/L時(shí)，CSN2基因的表達(dá)量最高;而當(dāng)亮氨酸的添加濃度為0.45 mmol/L時(shí)，CSN3基因的表達(dá)量最高。

由表6可見，與陰性對(duì)照組相比，在EBSS溶液中添加組氨酸顯著影響酪蛋白基因表達(dá)量(P＜0.05)。但是隨著組氨酸濃度的升高其基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。不同濃度的組氨酸對(duì)相同酪蛋白的基因促進(jìn)效果不同，在試驗(yàn)組中，當(dāng)組氨酸的添加濃度為1.20 mmol/L時(shí)，CSN1S2和CSN3基因表達(dá)量最高;而當(dāng)組氨酸的添加濃度為0.15 mmol/L時(shí)，CSN1S1和 CSN2基因的表達(dá)量最高。

2.3 亮氨酸和組氨酸對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響

由表7可見，與陰性對(duì)照組相比，添加亮氨酸上調(diào)mTOR復(fù)合物1中的mTOR、mTOR復(fù)合物1中的綁定蛋白(binds to the kinase domain of mTOR，stabilizes protein of raptor，GβL)、mTOR 調(diào)控蛋白(regulatory-associated protein of mTOR，raptor)基因的表達(dá)。當(dāng)亮氨酸的添加濃度為0.45～5.40 mmol/L時(shí)，mTOR、raptor和 GβL 基因的表達(dá)量顯著升高(P＜0.05)，當(dāng)亮氨酸的濃度為1.35 mmol/L時(shí)，這3個(gè)基因的表達(dá)量在試驗(yàn)組中達(dá)到最高。但隨著亮氨酸濃度的增加，這3個(gè)基因的表達(dá)量降低。

表4 組氨酸對(duì)CMECs-H的相對(duì)生長(zhǎng)率Table 4 Effects of His on CMECs-H relative growth rate(n=3)

圖2 組氨酸對(duì)CMECs-H相對(duì)生長(zhǎng)率的影響Fig.2 Effects of His on CMECs-H relative growth rate

當(dāng)添加亮氨酸時(shí)，mTOR信號(hào)通路下游基因:S6K1、真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1)、真核細(xì)胞翻譯延伸因子2(eukaryotic elongation factor 2，eEF2)、核糖體蛋白 S6(ribosomal protein S6，rps6)和真核翻譯起始因子4E(eukaryotic translation initiation factor 4E，EIF4E)的表達(dá)也上調(diào)，但添加不同濃度的亮氨酸對(duì)mTOR通路中不同下游基因表達(dá)的促進(jìn)效果不同。S6K1基因的表達(dá)量隨著亮氨酸濃度的增加而減少;在試驗(yàn)組中，當(dāng)亮氨酸的添加濃度為0.45 mmol/L時(shí)，S6K1表達(dá)量最高;當(dāng)亮氨酸的添加濃度為1.35 mmol/L時(shí)，4EBP1和 eEF2表達(dá)量最高;而EIF4E和rps6表達(dá)量最高時(shí)，亮氨酸的添加濃度為 5.40 mmol/L。

由表8可見，當(dāng)添加組氨酸時(shí)，與陰性對(duì)照組相比，raptor、4EBP1、eEF2、EIF4E 和 rps6 基因的表達(dá)量隨著組氨酸濃度的增加而增加。在試驗(yàn)組中，當(dāng)組氨酸的濃度為4.80 mmol/L時(shí)，GβL的表達(dá)量達(dá)到最高;當(dāng)組氨酸的濃度為0.15 mmol/L時(shí)，mTOR基因的表達(dá)量最高;而S6K1基因的表達(dá)量最高時(shí)，組氨酸的添加濃度為1.20 mmol/L。

3 討論

3.1 亮氨酸或組氨酸對(duì)CMECs-H增殖的影響

激素、氨基酸、生長(zhǎng)因子等因素影響體外乳腺上皮細(xì)胞的增殖、分化、泌乳等功能［27］。本研究在不含F(xiàn)BS的EBSS溶液中單一添加不同濃度的亮氨酸或組氨酸，研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸或組氨酸可以促進(jìn)CMECs-H增殖，但是隨著濃度的增加細(xì)胞增殖率反而下降，這可能與氨基酸過量供應(yīng)導(dǎo)致利用效率降低有關(guān)［28］。龐學(xué)艷等［14］研究結(jié)果表明，亮氨酸作為外源添加的營(yíng)養(yǎng)素對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖具有一定的促進(jìn)作用。同時(shí)Mercier等［29］指出，乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量很大程度上決定乳蛋白的合成量。李喜艷［24］的研究結(jié)果表明，當(dāng)添加不同時(shí)間的賴氨酸或蛋氨酸會(huì)影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖。其添加48 h對(duì)細(xì)胞的增值效果最強(qiáng)，原因是奶牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)外源添加營(yíng)養(yǎng)素的適應(yīng)期需要24 h，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝使得培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)素濃度降低，對(duì)原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用減弱。這與我們的研究結(jié)果不一致，本研究結(jié)果表明添加時(shí)間的不同并不會(huì)顯著影響其增殖效果。

表5 亮氨酸氨酸對(duì)酪蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 5 Effects of Leu on expression amount of genes encoding casein(n=3)

表6 組氨酸氨酸對(duì)酪蛋白相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 6 Effects of His on expression amount of genes encoding casein(n=3)

表7 亮氨酸對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 7 Effects of Leu on expression amount of genes related to mTOR signaling pathway(n=3)

續(xù)表7

表8 組氨酸對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)量的影響Table 8 Effects of His on expression amount of genes encoding mTOR signaling pathway(n=3)

3.2 亮氨酸或組氨酸對(duì)mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)酪蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

龐學(xué)燕等［14］利用qRT-PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)乳腺組織中CSN3表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)，外源補(bǔ)充177.15 mg/L的亮氨酸能夠顯著促進(jìn)CSN3基因的表達(dá)且能夠顯著促進(jìn)CSN3的合成。有研究表明在乳腺上皮細(xì)胞中，必需氨基酸(EAA)通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路中mTOR、4EBP1、eEF2和rps6因子的磷酸化進(jìn)而影響乳蛋白合成［30－31］。Toerien等［7］通過對(duì)饑餓22 h的泌乳奶牛靜脈灌注氨基酸的研究，其結(jié)果表明，乳腺組織中灌注EAA增強(qiáng)了mTOR靶點(diǎn)S6K的磷酸化，同時(shí)也促進(jìn)了乳蛋白的合成，EAA提高或趨向于提高乳腺內(nèi)mTOR的活性，這表明mTOR信號(hào)通路能夠調(diào)控乳蛋白產(chǎn)量。這為進(jìn)一步研究EAA對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的機(jī)制提供了依據(jù)。

本試驗(yàn)采用qRT-PCR方法分別檢測(cè)單一添加不同濃度的亮氨酸或組氨酸對(duì)CMECs-H中乳蛋白相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果表明，在EBSS溶液中添加濃度范圍為0.45～10.80 mmol/L的亮氨酸，與陰性對(duì)照組相比，CSN1S1、CSN1S2和CSN3基因表達(dá)均顯著上調(diào);CSN2基因表達(dá)上調(diào)。在EBSS溶液中添加0.15～9.60 mmol/L濃度范圍的組氨酸，與陰性對(duì)照組相比，CSN1S1、CSN2和CSN3基因表達(dá)均顯著上調(diào)。但是不同濃度的亮氨酸和組氨酸對(duì)相同酪蛋白相關(guān)基因的促進(jìn)效果不同，當(dāng)亮氨酸濃度為5.40 mmol/L時(shí)，CSN1S1、CSN1S2基因表達(dá)量最高;當(dāng)亮氨酸濃度為1.35 mmol/L時(shí)，CSN2基因表達(dá)量最高。當(dāng)亮氨酸濃度為0.45 mmol/L時(shí)，CSN3基因表達(dá)量最高。這說(shuō)明當(dāng)EBSS中亮氨酸添加濃度為0.45～5.40 mmol/L時(shí)，酪蛋白相關(guān)基因的表達(dá)作用較強(qiáng)。這和其他研究者文章中所述的“適宜濃度的氨基酸能夠促進(jìn)泌乳相關(guān)基因的表達(dá)”的結(jié)果一致［14］。當(dāng)亮氨酸濃度為5.40 mmol/L時(shí)，CSN1S1和CSN1S2基因表達(dá)量最高;當(dāng)組氨酸濃度為0.15 mmol/L時(shí)，CSN1S1和CSN2基因表達(dá)量最高。這與前人報(bào)道的一致［19］。但從結(jié)果我們可以看出，無(wú)論添加多大濃度的亮氨酸或組氨酸，在影響乳蛋白或與mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因時(shí)，基本是EBSS+10%FBS這一組作用最強(qiáng)。這可能是因?yàn)镕BS中還有細(xì)胞生長(zhǎng)過程中所需的較全面的蛋白因子及其他一些生物活性物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，這也可以說(shuō)明氨基酸之間的互作作用或是氨基酸與其他營(yíng)養(yǎng)素之間的互作作用使與泌乳相關(guān)基因的表達(dá)強(qiáng)于單個(gè)氨基酸的作用。

4 結(jié)論

EBSS溶液中單一添加亮氨酸的濃度為0.15～5.40 mmol/L，組氨 酸 濃 度 為 0.15 ～9.60 mmol/L范圍時(shí)，促進(jìn) CMECs-H增殖。隨著濃度的增加，2種氨基酸對(duì)CMECs-H的增殖有抑制作用，說(shuō)明亮氨酸或組氨酸對(duì)CMECs-H增殖的影響具有劑量依賴性。同樣，亮氨酸或組氨酸對(duì)CMECs-H中酪蛋白的合成也具有劑量依賴性，當(dāng)亮氨酸或組氨酸在最佳添加范圍，可以調(diào)控酪蛋白和mTOR信號(hào)通路中與乳蛋白翻譯相關(guān)基因的表達(dá)，潛在影響乳蛋白的合成。

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