飼糧添加精氨酸對娩后Wistar大鼠乳腺組織發(fā)育及酪蛋白合成的影響

胡良宇 吳佳誠 王夢芝 李鵬飛 馮 丹 張 軍

(揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009)

乳腺是具有合成和泌乳功能的特殊器官，它通過各種機制從血液中吸收營養(yǎng)物質(zhì)為其發(fā)育以及泌乳提供支持［1］。激素、營養(yǎng)、遺傳、飼養(yǎng)管理等因素都不同程度地影響乳腺組織的發(fā)育［2］。乳腺對氨基酸的攝取、利用對乳蛋白的合成和乳產(chǎn)量的保證極為重要［3］。哺乳動物母乳中90%以上的乳蛋白是乳腺上皮細胞以血液中的氨基酸為原料合成的，其中酪蛋白的含量最高，占了總蛋白含量的近80%。氨基酸作為主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，與乳腺的生長發(fā)育及泌乳密切相關，就精氨酸(Arg)來說，作為一種新生哺乳動物的必需氨基酸，成年哺乳動物的條件性必需氨基酸，不僅是乳蛋白合成的底物，還是調(diào)控乳蛋白合成的信號分子，調(diào)節(jié)乳蛋白合成的轉錄、翻譯［1］，在動物體內(nèi)具有重要的生理、代謝調(diào)控和營養(yǎng)作用。

Arg是目前發(fā)現(xiàn)的功能最多的一種氨基酸［4］。前人對乳腺限制性氨基酸攝取、利用的研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加適宜水平的Arg能夠有效提高平均日增重，改善動物的生長性能［5－6］;而且乳腺攝入的Arg顯著超過其分泌量，同時Arg代謝水平隨著細胞外 Arg 濃度的升高而升高［7－10］;Doepel等［11］試驗發(fā)現(xiàn)奶牛乳腺灌注Arg的試驗組與對照組相比，乳蛋白的產(chǎn)量顯著提高。以上研究結果提示過量保留于乳腺中的Arg除了用于乳蛋白的合成外，還有其他的代謝途徑或代謝調(diào)節(jié)功能;本課題組Chen等［12］對體外培養(yǎng)乳腺上皮細胞的研究表明，體外培養(yǎng)添加Arg對奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白的合成有一定的調(diào)節(jié)作用;Wang等［13］研究發(fā)現(xiàn)Arg通過哺乳動物類帕霉素(mTOR)途經(jīng)調(diào)控酪蛋白的表達;徐柏林［1］在Arg影響乳腺上皮細胞內(nèi)酪蛋白合成的試驗中發(fā)現(xiàn)，將Arg含量比對照組提高1倍時乳腺上皮細胞αs－酪蛋白和β－酪蛋白的含量達到最大，且促乳腺上皮細胞增殖效果最佳。以上研究都表明了Arg對體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞增殖和其酪蛋白表達有一定的促進作用，但對于Arg是否影響體內(nèi)乳腺組織的發(fā)育和其酪蛋白的表達尚不得而知。為此，本研究在前期研究的基礎上，通過向模式動物——Wistar大鼠的基礎飼糧中添加Arg，研究Arg對其乳腺組織發(fā)育以及對乳腺酪蛋白合成的影響，以期為進一步研究Arg影響奶牛乳腺泌乳及其代謝機制提供一些試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

采用同窩對照的方法，選擇同窩、健康、雌性受孕Wistar大鼠12只(揚州大學比較醫(yī)學研究中心提供)，體重(260±10)g，各大鼠的生理狀況基本一致，隨機分成2組。試驗大鼠單籠飼養(yǎng)，常規(guī)一致飼養(yǎng)管理和免疫程序，自然采光、通風，自由采食、飲水。

試驗大鼠基礎飼糧中粗蛋白質(zhì)、消化能等營養(yǎng)物質(zhì)需要量參照 Reeves等［14］文獻，采用 AIN-93G大鼠純化飼糧標準，交由南通特羅菲公司配制。Arg組在基礎飼糧中添加與其等量的Arg(飼糧Arg含量1.280%，均以L-Arg計)，對照組飼糧用谷氨酸替代精氨酸組中的精氨酸以平衡飼糧氮水平。試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

試驗分預試期4 d(分娩前4天)，正試期為17 d(分娩后17天)。試驗中有1只大鼠部分數(shù)據(jù)不全。

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis)［14］

1.2 大鼠乳腺組織的采集及保存

正試期結束，采集12只大鼠的乳腺組織，后用生理鹽水沖洗，30 s內(nèi)投入液氮保存。

1.3 指標測定

1.3.1 大鼠體重、仔鼠窩重的測定

待大鼠產(chǎn)仔泌乳后，每日固定時間(16:00)用電子稱依次稱取大鼠體重、仔鼠窩重，記錄數(shù)據(jù)。稱重結束后將大鼠、仔鼠放置原處。連續(xù)稱重17 d。

1.3.2 乳腺腺泡面積的測定

通過明美數(shù)碼成像系統(tǒng)軟件(MC30)進行測量。

1.3.3 乳腺總蛋白含量的測定

將乳腺組織樣本切割、裂解、離心提取，收集上清液。

乳腺總蛋白含量通過二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(增強型)(P0010S，碧云天生物技術研究所)自行測定，具體測定步驟參見試劑盒說明書。

1.3.4 乳腺α－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白含量的測定

將乳腺組織樣本切割、裂解、離心提取，收集上清液。

通過大鼠酪蛋白酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)自行測定大鼠乳腺α－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白含量。具體測定步驟參見試劑盒說明書。試驗所得的各種蛋白標準曲線的相關系數(shù)都高于0.99，可用于乳腺總蛋白以及各類酪蛋白含量的測定。

1.4 統(tǒng)計分析

用Excel對試驗數(shù)據(jù)進行整理，采用 SPSS 16.0軟件中 compare mean模塊的 independentsamples t-test過程進行2個獨立樣本t檢驗。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 大鼠體重、仔鼠窩重

由表2可知，試驗期末的大鼠體重和仔鼠窩重在組間雖然都沒有顯著性的差異(P＞0.05)，但Arg組的大鼠體重和新生仔鼠窩重在數(shù)值上都高于對照組。

由圖1可見，對照組和Arg組仔鼠窩重的增長S曲線變化趨勢基本一致。1～8 d對照組與Arg組的仔鼠窩重增長曲線接近重合，幾乎沒有差異;9～17 d Arg組的仔鼠窩重增長速度略高于對照組，但沒有明顯的差異。

表2 試驗結束時大鼠體重和新生仔鼠窩重Table 2 Body weight rats and litter weight of newborn rats at the end of the experiment g

圖1 新生仔鼠窩重增長曲線Fig.1 The growth curve of litter weight of newborn rats

2.2 乳腺組織發(fā)育

圖2 為分娩后大鼠的乳腺組織切片。由圖可見，相對于對照組，Arg組乳腺腺泡較為規(guī)則、一致，而且腺泡切面面積相對更大;對照組乳腺的腺泡則大小不一，部分發(fā)育不完全，腺泡切面面積也相對較小。

并且通過測量和計算2組腺泡切面面積可知(表3)，Arg組腺泡切面面積極顯著大于對照組(P＜0.01)，腺泡面積的增大為乳腺蛋白質(zhì)含量的提高提供了必要條件，進一步說明了Arg對大鼠乳腺蛋白質(zhì)合成的促進作用。

2.3 乳腺蛋白質(zhì)含量

由表3可知，Arg組和試驗組乳腺總蛋白含量差異不顯著(P＞0.05)。整體看來酪蛋白的合成水平都有增加的趨勢。其中Arg組β－酪蛋白含量顯著高于對照組(P＜0.05)，而α－酪蛋白、κ－酪蛋白含量則未見顯著增加(P＞0.05)。

3 討論

為了達到試驗飼糧為酪蛋白模式的設計，本試驗采用了半純合技術進行飼糧配制，基礎飼糧中采用酪蛋白為蛋白質(zhì)源，因此，其Arg和谷氨酸含量比例即是酪蛋白模式中的比例，也是泌乳動物的理想模式。試驗組增加其模式下的Arg含量，以突出在酪蛋白模式基礎上2倍量的Arg(徐柏林［1］前期乳腺上皮細胞體外試驗所獲得的結果)是否在大鼠上有同樣的促進作用;對照組則在酪蛋白的模式下，選擇添加了在體內(nèi)大量存在，可由其他氨基酸轉變而來的非限制性氨基酸谷氨酸以配制等氮飼糧。本試驗中粗蛋白質(zhì)水平和能氮比在組間都基本一致，試驗結果的差異應主要來自于處理的差異。另有研究認為，谷氨酸和Arg在體內(nèi)有一定的代謝相關，但基本與改變含量和比例有關。如陳明洪等［15］在飼糧中添加Arg或谷氨酸，改變2者含量和比例未能有效提高育肥豬生長性能;黃新球等［16］對于Arg及N－氨甲酰谷氨酸(NCG)對斷奶小鼠生長性能的研究表明，NCG引起機體內(nèi)Arg合成量的變化并不與NCG的添加量成正比:飼糧中添加0.05%NCG的比添加0.1%的血清游離Arg含量更高。以上試驗表明了超過一定量或含有充足量的Arg和谷氨酸時并不能體現(xiàn)其代謝相關或促進效應。本試驗飼糧中谷氨酸的含量分別為3.630%、5.550%，Arg的含量分別為1.280%、0.640%，遠超過前人研究中體現(xiàn)促進效應的水平。綜上表明，在本試驗供給基礎飼糧為泌乳動物理想模式的條件下，谷氨酸主要作用是對照組的氮配平氨基酸。

圖2 大鼠乳腺腺泡組織切片F(xiàn)ig.2 The histological section of rat mammary gland

表3 精氨酸對大鼠乳腺蛋白質(zhì)含量及腺泡切面面積的影響Table 3 Effects of Arg on protein contents and acinar area of mammary gland in rats

Arg是組織蛋白質(zhì)最多的氮攜帶者［4］。飼糧中添加Arg后，可促進氮沉積，母鼠可通過胎盤傳遞給胎兒更多營養(yǎng)物質(zhì)(氨基酸、氧氣等)，促進胎盤和胎兒生長發(fā)育［17－18］;在應激、疾病和感染的情況下，Arg能促進多種內(nèi)分泌激素(如生長激素、胰島素、胰高血糖素等)的釋放，促進蛋白質(zhì)的合成和抑制蛋白質(zhì)的分解，從而間接促進動物生長［19－20］。Yao 等［21］在 7 日 齡 仔 豬 飼 糧 中 添 加0.6%的Arg，顯著提高了平均日增重，促進了肌肉蛋白質(zhì)的合成;Corzo等［22］研究雄性肉雞Arg的需要時發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加Arg能夠顯著提高42～56日齡雄性肉仔雞的平均日采食量和平均日增重。本試驗中，飼糧添加Arg大鼠體重雖然與對照組的差異不顯著但在數(shù)值上有所增加，仔鼠窩重也有增加的趨勢。這與上述研究結果有一定的一致性。

乳蛋白的合成量受乳腺組織發(fā)育狀況和基因調(diào)控及外在條件的影響。首先，乳腺組織需要發(fā)育完全，才可為合成、泌乳提供充分的生理基礎。乳腺組織在動物體內(nèi)的增殖和分化受許多因素的影響，如激素、維生素、氨基酸、微量元素、生長因子等［23］。Arg作為一種氨基酸營養(yǎng)素，對乳腺細胞發(fā)育也有一定程度的促進作用。何晉等［24］研究發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)液中Arg濃度的增加，Arg對內(nèi)皮祖細胞的增殖起到了促進作用;Bie等［25］研究結果表明，上皮細胞培養(yǎng)液中Arg濃度為0.3 mmol/L較適宜上皮細胞的增殖及蛋白質(zhì)轉化。說明Arg對不同細胞都有不同程度的促進作用，以此類推，可以猜想Arg對乳腺細胞同樣具有促進作用。同時，Arg的代謝產(chǎn)物一氧化氮(NO)具有擴張血管的作用，因此Arg-NO途徑具有促進乳腺及乳腺內(nèi)血管的生長、提高營養(yǎng)物質(zhì)的攝取量、改善大鼠的乳腺組織發(fā)育進而提高泌乳性能的作用［26］。

另外，添加Arg對外在因素的調(diào)控及酪蛋白基因的表達都會產(chǎn)生影響。近年來對影響乳腺上皮細胞中蛋白質(zhì)合成因素的研究主要集中在對細胞中酪蛋白和乳清蛋白含量的檢測上［27－28］。氨基酸作為乳蛋白合成的前體物對促進乳蛋白的合成應有適當?shù)谋壤c濃度，氨基酸的平衡性對于提高乳蛋白含量和合成效率具有現(xiàn)實意義［29－30］。激素就是一種典型的外在因素能對乳蛋白的合成產(chǎn)生重要影響。Arg則可通過促進多種內(nèi)分泌激素(包括胰島素、生長激素、催乳素、抗利尿激素和兒茶酚胺等)的釋放［4］，從而可以調(diào)節(jié)乳腺上皮細胞的增殖、凋亡和免疫，促進泌乳和乳蛋白的合成［31－32］。同時基因水平的研究表明，Arg可通過調(diào)控乳腺上皮細胞內(nèi)酪氨酸酶2－信號轉導和轉錄激活子5(Jak2-Stat5)、mTOR信號轉導通路影響酪蛋白基因的表達。其主要機制為激酶Jak2催化結合在受體上的Stat5蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的Stat5蛋白以二聚體的形式進入細胞核內(nèi)與靶基因結合，調(diào)控基因的轉錄［20］。徐柏林［1］以奶牛乳腺上皮細胞為模型研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的Arg能促進奶牛乳腺上皮細胞中αS1－酪蛋白、αS2－酪蛋白、β－酪蛋白、κ－酪蛋白基因的表達，且當體外細胞培養(yǎng)液中Arg濃度為556.00 mg/L時，這4種基因的表達顯著上調(diào)。本試驗中Arg組分娩后大鼠的乳腺腺泡較為規(guī)則、一致，腺泡切面面積極顯著大于對照組;添加Arg對大鼠乳腺β－酪蛋白的合成有顯著的促進作用，對α－酪蛋白、κ－酪蛋白合成量也有所促進，與上述研究結果有著一致性。由此可見，Arg能夠促進乳腺腺泡發(fā)育和酪蛋白基因的表達，進而表現(xiàn)為乳腺組織充分發(fā)育和酪蛋白的合成量的提高。

4 結論

飼糧添加Arg對大鼠乳腺組織發(fā)育及β－酪蛋白的合成有顯著的促進作用。

［1］ 徐柏林.精氨酸對乳腺上皮細胞中酪蛋白合成的影響及其調(diào)控機制［D］.碩士學位論文.揚州:揚州大學，2012.

［2］ 張偉.影響母豬乳腺組織發(fā)育的因素［J］.養(yǎng)豬，2004，6:12 －15.

［3］ 王強，敖長金，嘎爾迪，等.陰外動脈灌注氨基酸對奶山羊乳腺攝取乳成分前體物的影響［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2011，44(21):4481 －4487.

［4］ 侯玉潔，徐俊，趙國琦，等.精氨酸的生理學功能及其在畜禽生產(chǎn)中的應用［J］.中國飼料，2013，5:32 －36.

［5］ KIM S W，MCPHERSON R L，WU G Y.Dietary arginine supplementation enhances the growth of milk fed young pigs［J］.The Journal of Nutrition，2004，134(3):625－630.

［6］ 周錫紅，吳信，唐香山，等.不同水平精氨酸生素對斷奶仔豬生長性能和血液指標的影響［J］.農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化研究，2010，31(2):237 －240.

［7］ MEPHAM T B，LINZELL J L.A quantitative assessment of the contribution of individual plasma amino acids to the synthesis of milk proteins by the goat mammary gland［J］.Biochemical Journal，1966，101:76.

［8］ GUINARD J，RULQUIN H，VERITE R.Effect of graded levels of duodenal infusion of casein on mammary uptake in lactation cows.2.Individual acids［J］.Journal of Dairy Science，1994，77:2221 －2231.

［9］ METCALF JA，WRAY-CAHEN D，CHETTLE E E，et al.The effect of increasing levels of dietary protein as protected soya on mammary metabolism in the lactating dairy cow［J］.Journal of Animal Science，1996，69:603－611.

［10］ BEQUETTE B J，BACKWELL R C.Amino acids supply and metabolism by the ruminant mammary gland［J］.British Journal of Nutrition，1997，56:593 －605.

［11］ DOEPEL L，LAPIERRE H.Deletion of arginine from an abomasal infusion of amino acid does not decrease milk protein yield in Holstein cows［J］.Journal of Dairy Science，2011，94(2):864 －873.

［12］ CHEN L M，LIZ T，WANG M Z，et al.Preliminary report of arginine on synthesis and gene expression of casein in bovine mammary epithelial cell［J］.International Research Journal of Agricultural Science and Soil Science，2013，3:17 －23.

［13］ WANG M Z，XU B L，WANG H R，et al.Effects of arginine concentration on the in vitro expression of casein and mTOR path way related genes in mammary epithelial cells from dairy cattle［J］.PLoSOne，2014，9(5):1－8.

［14］ REEVES PG，NIELSEN FH，F(xiàn)AHEY G C，Jr.AIN-93 purified diets for laboratory rodents:final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN-76A rodent diet［J］.The Journal of Nutrition，1993，123(11):1939 －1951.

［15］ 陳明洪，段杰林，尹杰，等.谷氨酸和精氨酸對飼喂霉變飼糧育肥豬所受損傷的緩解作用［J］.動物營養(yǎng)學報，2013，25(9):2101 －2110.

［16］ 黃新球，王遠興，楊有仙，等.日糧中添加N－氨甲酰－L－谷氨酸及精氨酸對斷奶小鼠生長性能的影響［J］.食品科學，2011，32(19):253 －257.

［17］ MATEORD R D，WU G，BAZERFW，et al.Dietary L-ariginine supplementation enhances the reproductive performance of gilts［J］.The Journal of Nutrition，2007，137:652 －656.

［18］ WU G，F(xiàn)ULLER W，BAZER F W，et al.Important roles for arigine-family amino acids in swine nutrition and production［J］.Livestock Science，2007，122:8 －22.

［19］ FRANK J W，ESCOBAR J，NGUYEN H V，et al.Oral N-carbamyl glutamate supplementation increases protein synthesis in skeletal muscle of piglets［J］.The Journal of Nutrition，2007，137:315 －319.

［20］ WU G，MEININGER C J，KNABE D A，et al.Arginine nutrition in development health and disease［J］.Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care，2008，3:59 －66.

［21］ YAO K，YIN Y L，CHU W Y，et al.Dietary arginine supplementation increases mTOR signaling activity in skeletal muscle of neonatal pigs［J］.The Journal of Nutrition，2008，138(5):867 －872.

［22］ CORZOA，MORANET，Jr，HOEHLE R D.Arginine need of heavy broiler males applying the ideal protein concept［J］.Poultry Science，2003，82(3):402 －407.

［23］ 徐柏林，王夢芝，張興夫，等.精氨酸水平對奶牛乳腺上皮細胞體外生長及κ－酪蛋白基因表達的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2012，24(5):852 －858.

［24］ 何晉，謝秀梅，方葉青，等.L-Arg抑制非對稱性二甲基Arg對內(nèi)皮祖細胞的增殖作用［J］.中國動脈硬化雜志，2007，15(10):751 －754.

［25］ BIE T，YULONG Y，XIANGFENG K，et al.L-arginine stimulates proliferation and prevents endotoxin-induced death of intestinal cells［J］.Amino Acids，2010，38(4):1227－1235.

［26］ KIM S W，WU G.Regulatory role for amino acids in mammary gland growth and milks synthesis［J］.Amino acids，2009，37(1):89 －95.

［27］ SUN Y L，LIN C S，CHOU Y C.Gene transfection and expression in a mammary culture of mammary epithelial cells isolated from lactating sows［J］.Cell biology International，2005，29(7):576 －582.

［28］ MACKLE T R，DWYER D A，INGVARTSEN K L，et al.Bauman effects of insulin and postruminal supply of protein on use of amino acids by the mammary gland for milk protein synthesis［J］.Journal of Dairy Science，2000，83:93 －105.

［29］ 張興夫，杜瑞平，敖長金，等.不同氨基酸模式對奶牛乳腺上皮細胞對酪蛋白合成的影響［J］.動物營養(yǎng)學報，2013，25(8):1762 －1768.

［30］ CHO J，OVETON T R，SCHWAB C G，et al.Determining the amount of rumen-protected merhionine supplement that corresponds to the optimal levels of methionine in metabolizable protein foe maximizing milk protein production and profit on dairy farms［J］.Journal of Dairy Science，2007，90:4908 －4916.

［31］ 方麗云，鐘凱，王艷玲.乳腺免疫的研究進展［J］.河南畜牧獸醫(yī)，2007，5(28):12 －13.

［32］ BRYONY S，WISEMAN Z W.Stromal Effects on mammary gland development and breast cancer［J］.Science，2002，296:1046 －1049.