豬源腸道嗜酸乳桿菌的分離、鑒定與馴化

胡國才 黃 靜 吳曉玉

(江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，南昌市發(fā)酵應用技術(shù)重點實驗室，南昌 330045)

早期斷奶對仔豬生長發(fā)育帶來一系列不良影響，造成其食欲差、消化不良、腹瀉等仔豬早期斷奶綜合征。產(chǎn)生這一后果的生理基礎(chǔ)是由于斷奶應激影響仔豬腸道組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化道微生態(tài)區(qū)系的平衡。同時斷奶應激也嚴重影響免疫系統(tǒng)和酶系統(tǒng)發(fā)育及健全［1］。越來越多的研究表明乳酸菌類微生態(tài)制劑具有減少哺乳和斷奶仔豬消化道疾病發(fā)生、提高機體免疫力的功效，從而有效緩解早期斷奶應激引起的仔豬免疫功能下降，是仔豬生產(chǎn)中一種理想的飼料添加劑［2-3］。

嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)是少數(shù)可以存活并定植于腸道內(nèi)的益生菌之一，其在腸道內(nèi)的定植能力強于其他微生物。它能競爭性地定植于小腸上皮細胞，產(chǎn)生細菌素和有機酸，維持腸道內(nèi)低pH環(huán)境，促進腸道中微生 態(tài) 環(huán) 境 的 正 常 化［4-6］。Lin 等［7］、Lin 等［8］、Aween等［9］研究證實 L.acidophilus可抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、葡萄球菌、枯草桿菌等的生長。L.acidophilus ATCC4356通過降低氧化應激、炎癥反應可減弱小鼠動脈粥樣硬化進程［10］。新生的腸道無菌仔豬喂飼L.acidophilus菌劑時，可顯著提高能量與脂肪代謝的轉(zhuǎn)錄組水平［11］;適當劑量 L.acidophilus NCFM(3.2×106CFU)可增強新生仔豬對胃腸炎病毒(輪狀病毒)的免疫力，仔豬回腸、脾臟和血液的輪狀病毒特異性抗體、免疫球蛋白G(lgG)抗體分泌細胞(ASCs)、記憶B細胞均明顯提高［12］。鑒于乳酸桿菌在腸道黏膜定殖具有宿主特異性，即土著菌株比外來菌株更易于定殖黏膜細胞，且引起黏膜免疫反應所需菌量顯著低于外來益生菌所需的劑量［13-14］，而其中的L.acidophilus較其他乳桿菌更易定植于腸道上皮細胞，形成屏障，抑制病原菌的生長［15-17］，本研究擬從仔豬糞便中分離篩選L.acidophilus，并對其進行馴化，使其作為微生態(tài)制劑在仔豬生長發(fā)育與防御腸道疾病中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

采集江西農(nóng)業(yè)大學養(yǎng)豬場未使用過任何抗生素藥物的15日齡仔豬新鮮糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸鉀(K2HPO4)2 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，乙酸鈉 5 g/L，葡萄糖 20 g/L，吐溫80 g/L 1 mL，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.58 g/L，四水硫酸錳(MnSO4·4H2O)0.25 g/L，pH 5.5。

生理生化鑒定培養(yǎng)基:包括牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、明膠液化培養(yǎng)基、V-P試驗培養(yǎng)基、PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PYG培養(yǎng)基、硝酸鹽液體培養(yǎng)基、吲哚試驗培養(yǎng)基、碳水化合物培養(yǎng)基等均按參考文獻［18］配制。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬腸道L.acidophilus的分離純化

稱取采集的樣品1 g，置于含99 mL 0.85%無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩15 min，使樣品充分混勻，10倍系列梯度稀釋至10-7，配制成不同稀釋度菌懸液。分別用不同稀釋度的菌懸液涂布于MRS平板培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)48 h。

挑取MRS平板培養(yǎng)基上疑似乳酸菌單菌落，革蘭氏染色，鏡檢。選取革蘭氏陽性、桿狀單菌落，在MRS平板培養(yǎng)基上劃線，37℃，培養(yǎng)48 h。重復上述步驟4次。最后，平板單菌落至斜面培養(yǎng)，保存。

1.2.2 豬腸道L.acidophilus的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)特征觀察

將上述分離純化菌株分別劃線至PY基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。觀察單菌落形態(tài)特征。經(jīng)革蘭氏染色后，光學顯微鏡觀察菌體形態(tài)特征。

1.2.2.2 生理生化特性鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［19］、《乳酸細菌分類鑒定及試驗方法》［18］，對上述分離純化的L.acidophilus疑似菌株進行生理生化特測定與分析。

1.2.2.3 高效液相測定發(fā)酵液乳酸含量

測試菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min，在 37℃ 下培養(yǎng) 48 h。發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心后，取上清液，用超純水適當稀釋，即得待測液。

色譜條件:使用Aminex HPX-87H分析柱，流動相為0.005 mol/L硫酸，柱溫50℃，檢測波長210 nm，進樣量 15 μL［20］。

1.2.2.4 16S rDNA 序列分析

采用細菌16S rRNA通用引物(7f:5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’;1540r:5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，引物由上海生工生物技術(shù)服務有限公司合成。PCR反應體系(25 μL):dNTPmix(每個10 mmol/L)0.5 μL，10× Taq reaction Buffer 2.5 μL，Taq(5 U/μL)0.2 μL，模板1 μL，正向、反向引物各 0.5 μL，ddH2O 14.8 μL。反應條件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55℃ 35 s，72℃ 90 s，循環(huán)35次，72℃ 8 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序由該公司完成。

菌株測序后的序列信息用BLAST軟件分析，選擇GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比較。用分子進化遺傳學分析(molecular evolutionary genetics analysis，MEGA)6.0軟件分析處理所測菌株序列與下載同源性較高序列，構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株La-5耐酸性能馴化

以菌株La-5為出發(fā)菌制成菌懸液。取100 mL菌懸液，6 000 r/min離心15 min，收集菌體。菌體轉(zhuǎn)入pH=4.5的MRS液體培養(yǎng)基馴化，搖瓶培養(yǎng)24 h后，取50 mL馴化培養(yǎng)液離心，沉淀菌體再轉(zhuǎn)入pH=5.5的MRS液體培養(yǎng)基富集，再搖瓶培養(yǎng)12 h。按上述方式，依次用 pH 為 4.0、3.5、3.0、2.5、2.0 和1.5 的 MRS 培養(yǎng)基馴化，pH=5.5 的 MRS培養(yǎng)基富集。最后，富集菌液用平板涂布純化，挑取單菌落斜面保藏。經(jīng)耐酸馴化后的菌株命名為菌株La-5a。

取20 mL菌株La-5與La-5a的菌懸液，離心，沉淀菌體分別接入 pH 為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0和5.5的MRS培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)4 h。采用pH=5.5的MRS培養(yǎng)基平板計數(shù)，測定不同pH的MRS培養(yǎng)液的活菌數(shù)。以pH=5.5的MRS為對照組，其他6個pH的MRS為試驗組，計算菌株存活率，并繪制活菌數(shù)、存活率與pH的關(guān)系圖。

1.2.4 菌株La-5a耐膽鹽性能馴化

取菌株La-5a菌懸液100 mL，按1.2.3方法離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入含0.1%膽鹽MRS液體培養(yǎng)基馴化，搖瓶培養(yǎng)24 h后，離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入無膽鹽MRS液體培養(yǎng)基，搖瓶富集培養(yǎng)12 h。按上述方法，依次用含 0.3%、0.5%、0.7% 和 1.0% 膽鹽MRS培養(yǎng)基進行搖瓶馴化、無膽鹽MRS培養(yǎng)基搖瓶富集。最后，富集菌液用平板涂布純化，挑取單菌落斜面保藏。經(jīng)耐膽鹽馴化后的菌株命名為菌株La-5b。

取20 mL菌株La-5和La-5b的菌懸液，離心，沉淀菌體分別接入含膽鹽 0、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40% 和 0.50% 的 MRS 培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)4 h。采用平板計數(shù)法，利用MRS瓊脂培養(yǎng)基，測定不同膽鹽含量MRS培養(yǎng)液中的活菌數(shù)。以膽鹽含量0為對照組，其他6個膽鹽含量為試驗組，計算菌株存活率，并繪制活菌數(shù)、存活率與膽鹽含量的關(guān)系圖。

1.2.5 菌株La-5b耐熱性能馴化

取菌株La-5b菌懸液50 mL，離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入含MRS液體培養(yǎng)基150 mL三角瓶中，置40℃水浴熱激馴化處理30 min后，取20 mL菌液離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基，富集培養(yǎng)24 h。按上述方法，依次再用 45、50、55、60、65 和70℃水浴熱激馴化和富集。最后，富集菌液用平板涂布純化，挑取單菌落斜面保藏。經(jīng)高溫馴化后的菌株命名為La-5c。

分別取菌株La-5和La-5c菌懸液20 mL，離心，沉淀菌體轉(zhuǎn)入含100 mL MRS液體培養(yǎng)基的三角瓶，再將三角瓶分別置于 37、40、45、50、55、60、65和70℃水浴熱激處理30 min。采用平板計數(shù)法，用MRS平板培養(yǎng)基，測定不同溫度處理后的活菌數(shù)。以37℃為對照組，其他7個溫度為試驗組，計算菌株存活率，并繪制活菌數(shù)、存活率與溫度的關(guān)系圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌形態(tài)特征

利用MRS平板培養(yǎng)基從15日齡仔豬糞便中共分離42株具有乳酸菌典型菌落形態(tài)特征的菌株。經(jīng)多次劃線純化、革蘭氏染色、鏡檢，獲得13株菌落直徑較大、長勢較好的桿狀菌株，分別編號為菌株La-1至La-13(圖1)。其菌落特征為:大部分菌落乳白色，少數(shù)透明(菌株La-1、La-3和La-7);邊緣整齊;大部分凸起，少數(shù)無凸起(菌株La-3、La-7、La-9 和 La-12)、濕潤。

圖1 分離純化菌株La-5與La-1的形態(tài)特征圖Fig.1 The morphologic character of strains La-1 and La-5 screened by isolating and purifying(1 000 × )

2.2 生理生化特性的鑒定

參照文獻［18］、［19］，對分離純化的13株進行初步鑒定，結(jié)果表明，菌株 La-1、La-2、La-4、La-5、La-6、La-7、La-8、La-9 和 La-10 的過氧化氫酶試驗、硝酸鹽還原試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、硫化氫試驗以及氧化酶試驗均為陰性。菌株La-3和La-11吲哚試驗陽性，其他試驗均為陰性。菌株La-12硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗及氧化酶試驗為陽性，其他試驗均為陰性。菌株La-13硝酸鹽還原試驗、吲哚試驗為陽性，其他試驗均為陰性。綜合試驗結(jié)果排除菌株La-3、La-11、La-12和La-13為乳酸桿菌屬。

對剩余9 株菌株 La-1、La-2、La-4、La-5、La-6、La-7、La-8、La-9和La-10進行碳水化合物產(chǎn)酸發(fā)酵試驗(表1)。結(jié)果表明，菌株 La-5、La-6、La-8和La-9的4株菌發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)酸特性與L.acidophilus的完全相同。比較菌株La-5，La-6，La-8和La-9生長態(tài)勢及形態(tài)，菌株La-5在MRS瓊脂平板上的長勢優(yōu)于其他3株，單菌落較大而飽滿，菌體為較粗長桿狀，且其發(fā)酵48 h的MRS培養(yǎng)液pH低于其他3株菌株。進一步采用高效液相法對其發(fā)酵液產(chǎn)乳酸、乙酸性能進行測定，結(jié)果見圖2。La-5菌株發(fā)酵液經(jīng)過濾、3倍稀釋后，高效液相測定乳酸含量為 11.52 g/L，乙酸為 2.99 g/L，表明該菌具有發(fā)酵產(chǎn)乳酸的能力。因此選擇菌株La-5為后續(xù)研究菌株。

表1 乳酸菌的碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果Table 1 The results of carbohydrates reaction by lacto acid bacteria

2.3 菌株La-5 16S r RNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用細菌引物7f/1540r對菌株La-5的16S rRNA擴增、測序。獲得基因片段大小為1 430 bp。在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行16S rRNA序列比對，與菌株La-5(登錄號:KJ850588)相似度最高的菌株 L.acidophilus(NR075045、NR117812)，相似性達100%。利用MEGA 6.06構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株La-5進化地位(圖3)。菌株La-5與 L.acidophilus(NR075045、NR117812)處于同一支，自展值100%，說明這一亞支穩(wěn)定性好。結(jié)合菌株La-5的形態(tài)特征、生理生化檢測結(jié)果，將該菌株鑒定為L.acidophilus。

2.4 菌株La-5耐酸性能馴化

對分離篩選的菌株La-5采用稀鹽酸調(diào)整MRS液體培養(yǎng)基酸度，模擬動物胃酸，進行菌株耐酸性能馴化(1.2.3方法)，以提高其耐受胃酸環(huán)境的能力，保證足量活菌進入腸道發(fā)揮益生作用。經(jīng)不同pH處理4 h后，利用平板計數(shù)法，分別測定出發(fā)菌株La-5和馴化后菌株La-5a，的活菌數(shù)及存活率(圖4)。結(jié)果表明:經(jīng)耐酸馴化后獲得的菌株La-5a在同等酸度條件下，其活菌數(shù)與存活率均高于原始菌株La-5，特別在低酸度(pH=1.5～3)時，馴化后菌株存活率明顯高于原始菌株，高出36% ～44%，但極低pH(1.5)對菌株La-5a仍具有一定抑制作用，存活率為37%，原始菌株為0.6%。

圖2 菌株La-5發(fā)酵液L－乳酸、乙酸的液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of L-lactic acid and acetic acid of fermentation broth by strain La-5

圖3 菌株La-5 16S r RNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.3 The phylogenetic tree of strain La-5 based on 16S rRNA gene sequences

圖4 在不同pH條件下處理4 h后菌株的活菌數(shù)(Ⅰ)及存活率(Ⅱ)Fig.4 Viable counts(Ⅰ)and survival rate(Ⅱ)of strains La-5 and La-5a under the condition of different pH for 4 h

2.5 菌株La-5a耐膽鹽能力馴化

采用耐酸性菌株La-5a為出發(fā)菌株，用含膽鹽的MRS培養(yǎng)基進行耐膽鹽性能馴化。經(jīng)馴化后菌株La-5b與原始菌株La-5在不同膽鹽濃度下處理4 h后的生長情況見圖5。菌株La-5b對膽鹽耐受能力明顯優(yōu)于菌株La-5。膽鹽濃度達0.5%時，前者存活率仍有27.30%，而后者僅為4.03%;動物小腸膽汁鹽濃度在0.03% ～0.3%之間波動，在此范圍內(nèi)馴化菌株存活率為85%～90%之間，而菌株La-5為28% ～53%，兩者差異明顯。

圖5 在不同膽鹽含量條件下處理4 h后菌株La-5和La-5b的活菌數(shù)(Ⅰ)及存活率(Ⅱ)Fig.5 Viable counts(Ⅰ)and survival rate(Ⅱ)of strains La-5 and La-5b under the condition of different bile salt concentrations for 4 h

2.6 菌株La-5b耐熱性能馴化

膽鹽馴化后菌株La-5b 經(jīng)耐熱性處理后(1.2.5方法)，與原始菌株 La-5比較，在 45～50℃之間其存活率明顯高于原始菌株，50℃時菌株La-5c存活率為 66.1%，而菌株 La-5 ＜0.01%;當溫度達55℃處理30 min后，前者仍有7.5%的存活率;甚至高達70℃處理后，還有極少量菌生存，而原始菌株在溫度達50℃處理后，已無法檢測到生存菌株(圖6)。

3 討論

1900年，L.acidophilus首次從人體胃腸道分離，并命名為Bacillus acidophilus。1970年Hanson和Moquot修改為現(xiàn)在的名稱。隨著細菌鑒定及特征性描述方式方法的發(fā)展，L.acidophilus的種群分類經(jīng)歷了多次修訂，并在紛繁多樣的乳酸桿菌類群中歸為亞群中的一個種［21］。該菌為革蘭陽性、桿狀細菌，通過糖酵解(EMP)途徑厭氧發(fā)酵產(chǎn)乳酸［22］，根據(jù)生物合成途徑有關(guān)基因組分析，認為L.acidophilus為營養(yǎng)缺陷型細菌，其生長繁殖需提供14種氨基酸，同時不能合成多種輔酶因子及維生素(包括核黃素、維生素B6，煙酰胺、生物素、葉酸等)［23］，菌株也因此需采用營養(yǎng)豐富的 MRS(deMan、Rogosa和Sharpe)為其常規(guī)培養(yǎng)基。

早在1971年 Van der Waaij等［24］證實胃腸道菌群是一個復雜、穩(wěn)定的生境，對外源微生物具有清除能力。Lidbeck等［25］給受試者每天飲用含L.acidophilus發(fā)酵牛奶，其腸道乳酸菌含量明顯提高，但一旦停止飲用，乳酸菌數(shù)量又回復到原有水平。Vinderola等［13］用外源、內(nèi)源 L.acidophilus等益生菌喂飼小鼠，表明內(nèi)源性乳酸菌激活小鼠腸道黏膜免疫反應所需飼喂菌量(104個/d)遠小于外源益生菌(107個/d)。鑒于乳酸菌在腸道內(nèi)定殖的復雜性以及宿主種屬的特異性，本文采集養(yǎng)豬場的未使用過任何抗生素藥物的15日齡仔豬新鮮糞便，利用MRS培養(yǎng)基選擇性地富集乳酸菌，再采用平板劃線法培養(yǎng)單菌落，多次分離純化乳酸菌。通過對分離純化菌株進行形態(tài)學觀察、生理生化檢測、產(chǎn)乳酸性能測定、16S rDNA序列分析以及建立系統(tǒng)發(fā)育樹，最后確定豬源腸道菌株 La-5為 L.acidophilus。

圖6 在不同溫度條件下處理30 min后菌株La-5和La-5c的活菌數(shù)和存活率Fig.6 Viable counts(Ⅰ)and survival rate(Ⅱ)of strains La-5 and La-5b under the condition of different temperatures for 30 min

哺乳仔豬胃內(nèi)pH為4.0左右，斷奶后升至5.5～6.0，以后逐步下降，60日齡后可達到正常水平，為 2.0 ～3.5［26］。哺乳仔豬的膽囊內(nèi)膽汁分泌量很少，膽汁量在出生后3周內(nèi)緩慢增加，小腸內(nèi)膽鹽濃度在 0.03% ～0.30% 波動［27］。而食物進入豬胃后，完全排空的時間3～15日齡約為l.5 h，1 月齡為3 ～5 h，2 月齡為 16 ～19 h［28］。因此，一方面，經(jīng)喂飼的微生態(tài)菌劑必須能耐受胃腸的低胃酸及高濃度膽鹽，才能到達動物腸道，定殖于上皮細胞黏膜，發(fā)揮益生效應。另一方面乳酸菌適宜生長溫度為37℃，高溫不利于菌株的生長及產(chǎn)酸，甚至導致細胞的死亡。而菌劑的發(fā)酵生產(chǎn)過程中，提高發(fā)酵溫度可降低生產(chǎn)能耗、減少染菌;同時乳酸菌制品的加工過程如巴氏消毒等易造成活菌數(shù)大量減少，因此改良菌株對環(huán)境的耐受性已引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。吳惠芬等［29］研究分離自仔豬腸道的乳酸菌L5和L7對低pH和膽鹽的耐受性，表明在pH為1.5和2.5條件下經(jīng)處理30 min后，菌株數(shù)量顯著下降;當膽鹽濃度高于0.2%時，2個菌株的生長極差;菌株L5在50℃下可成活，且呈正常生長趨勢，但對80℃及以上的耐熱能力顯著降低。楊桂梅等［30］研究2株分離自豬腸道的益生性屎腸球菌E1和E7對pH、膽鹽及溫度的耐受特性，結(jié)果顯示菌株E1和E7在pH=2作用2 h后仍能檢測到活菌;膽鹽濃度升高至0.6%時，活菌數(shù)降到102.5 CFU/mL。

細菌的逆境生存機制之一是適應反應，即當細胞暴露于適度逆境下，細菌可獲得對更嚴峻逆境的抗逆性。此種應激反應使細菌獲得在致死環(huán)境下生存的可能。另一逆境生存機制是交叉保護。逆境條件下，細菌不僅獲得對該逆境的抗性，同時表現(xiàn)出對另一不相關(guān)逆境的抗性。在與不斷變化的周圍環(huán)境抗爭進程中，細菌已擁有對逆境進行檢測、監(jiān)控和反應精致系統(tǒng)［31-32］。根據(jù)細菌此種特性，采用漸進式改變菌株生長環(huán)境，馴化篩選抗逆性優(yōu)良菌株，具有目標明確、操作簡便以及篩選的菌株遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點，在工業(yè)生產(chǎn)上是一種行之有效的育種技術(shù)。本研究通過逐步提高培養(yǎng)基的酸度、膽鹽濃度及培養(yǎng)高溫，淘汰抵抗性弱的菌株，富集耐受低pH、高濃度膽鹽及高溫的變異株，使菌株在 pH=1.5～3內(nèi)存活率達38% ～47%，在膽鹽濃度0.03% ～0.3%時存活率在85% ～90%之間，在50℃時仍有66%的存活率。

革蘭氏陽性細菌耐酸性機制包括應激蛋白表達、質(zhì)子泵過量表達、質(zhì)子消耗代謝途徑修飾等［33］。Van de Guchte 等［34］認為乳酸桿菌的耐酸性是通過消耗質(zhì)子驅(qū)動力進行酸應激反應，依賴ATP將質(zhì)子外排至胞外，質(zhì)子移位膜 ATP酶(F0F1-ATP酶)既可利用質(zhì)子合成 ATP，也能經(jīng)ATP水解將質(zhì)子外排。L.acidophilus處于低pH條件下，atp基因轉(zhuǎn)錄被激活，引起F0F1-ATP酶活性增強，而使菌株的耐酸性增強［34］。添加外源性天冬氨酸也能增加干酪乳桿菌(L.casei)耐酸性，原因在于天冬氨酸使細胞糖酵解和三羧酸循環(huán)途徑的中間產(chǎn)物含量升高，從而產(chǎn)生更多的ATP，其通過水解將胞內(nèi)質(zhì)子排出胞外［35］。在德氏乳桿菌保加利亞菌(Lactobacillus delbrueckii sub sp.bulgaricus)中，酸性階段菌株的組氨酸激酶和應答調(diào)控蛋白均被誘導表達。由此構(gòu)建該菌株應答調(diào)控蛋白JN675228/JN675229的基因突變體，顯示突變菌株的耐酸性強于對照菌株［36-37］。同樣乳酸菌對膽鹽的應激反應也是一個復雜的生理過程。Lee等［38］研究指出膽鹽濃度達1.2 g/L以上時，對羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)生長有明顯抑制作用，通過蛋白質(zhì)組學分析揭示在不同濃度膽鹽培養(yǎng)基生長的菌株蛋白質(zhì)組成存在明顯差異，其中包括糖代謝、核苷酸代謝、氨基酸合成以及轉(zhuǎn)錄翻譯等蛋白質(zhì)。在膽鹽培養(yǎng)基中，菌株L.reuteri CRL 1098的細胞膜與細胞壁存在部分剝離，細胞收縮等現(xiàn)象。膽鹽抗性菌株 L.delbrueckii sub sp.lactis 200的10對小鼠腸道黏附性減弱。研究證實在膽鹽存在下，蛋白質(zhì)延長因子Tu的表達被抑制，此因子與腸道黏附蛋白質(zhì)的合成有關(guān)［39-41］。L.acidophilus等益生菌多為不含芽孢的厭氧或兼性厭氧菌，抗逆性差。因此，優(yōu)質(zhì)的益生菌不僅應具備在生產(chǎn)、儲存條件下保證有大量活菌數(shù)的特性，同時須能通過宿主胃環(huán)境，克服其腸道其他菌的拮抗與抑制作用，競爭性地以充足活菌到達腸道，并能定殖于腸黏膜。本研究馴化的菌株La-5c較從仔豬腸道分離純化的原始菌株La-5的耐酸、膽鹽及高溫能力有大幅度提高。但該菌株能否在仔豬腸道黏膜定殖、對仔豬的生長發(fā)育與抗病性的影響以及喂飼仔豬的適宜劑量等還有待進一步的研究。

4 結(jié)論

從仔豬新鮮糞便分離純化的菌株La-5采用形態(tài)、生理生化、16S rRNA基因序列及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，確定為L.acidophilus。通過逐步馴化后，馴化菌株La-5c對酸、膽鹽、高溫的耐受能力明顯高于原始菌株La-5。

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